CD34^＋造血干细胞在“心肌样”微环境中转化为心肌样细胞的可能性

目的：一般认为CD34^＋细胞只能向血细胞分化，观察CD34^＋造血干细胞在“心肌样”微环境中转化为心肌样细胞的可能性。方法：实验于2004-01／12在大连医科大学附属第二医院实验中心完成。①选用成年健康SD大鼠30只及出生l-3dSD大鼠乳鼠。在体外分离、培养CD34^＋造血干细胞，并将CD34^＋造血干细胞与分离出的新生乳鼠心肌细胞共培养。②将新生乳鼠心肌细胞的培养环境模拟为在体心肌细胞的生活环境即心肌样微环境。③在细胞培养瓶内加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记CD34^＋细胞。在倒置显微镜下观察CD34^＋造血干细胞形态学变化，用免疫细胞化学法检测心肌特异性肌钙蛋白T。结果：①CD34^＋造血干细胞与心肌细胞共培养3d，CD34^＋细胞变成长杆状，即呈现较为一致的极性排列，靠近心肌细胞的CD34’细胞形态学改变更早、更明显。②共培养的细胞经免疫细胞化学染色，发现部分5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的CD34^＋细胞核在荧光显微镜下呈现红色，同时其细胞浆心肌特异性肌钙蛋白T表现阳性，说明确实有部分CD34^＋造血干细胞转化成幼稚心肌细胞。结论：将CD34^＋造血干细胞与心肌细胞共培养，CD34^＋造血干细胞可以分化为心肌样细胞，从而验证了体外“心肌样”微环境可以促使CD34^＋造血干细胞向心肌样细胞转化的潜能。     

心肌组织裂解液诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:干细胞具有"环境依赖性分化"特性,以心肌组织裂解液模拟心肌微环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞方向分化的研究甚少.目的:观察心肌组织裂解液对大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞方向分化的影响.方法:选用生长良好的第2代骨髓间充质干细胞,加入诱导液连续培养5周,连续观察细胞形态学特征的变化规律,采用α-Actin进行免疫细胞化学染色观察干细胞是否向肌细胞方向分化,收集诱导后的细胞行苏木精-伊红染色观察是否存在闰盘,并通过电镜观察其超微结构.结果与结论:加入诱导液后大部分细胞呈"竹节样",α-Actin免疫细胞化学染色阳性,表明间充质干细胞向肌细胞方向分化;苏木精-伊红染色可见闰盘,透射电镜下见排列整齐明暗相间的肌丝,扫描电镜下可见胞浆内有纤维状结构,说明"竹节样"细胞具有心肌细胞的典型形态结构特点.连续诱导12 d多个区域出现成片的、具有自律性搏动的多核肌管结构.心肌组织裂解液可模拟心肌细胞的微环境,诱导骨髓间充质干细胞分化为具有典型形态结构特征和相应功能活动的心肌样细胞.     

骨髓间充质干细胞与心肌细胞共培养诱导分化为心肌样细胞

本研究探讨间充质干细胞（MSC）分化为心肌细胞（CM）的能力。对大鼠源MSC进行标记并将大鼠源MSC与初生大鼠CM直接接触共培养5—7天，诱导MSC向CM分化。用流式细胞仪检测细胞表面抗原，免疫荧光法检测标记细胞的心肌特异性标记物肌球蛋白和肌钙蛋白T表达。结果显示：体外培养的MSC表达CD90、CD44、CD105、CD54，不表达CD34、CD45、CD31等造血细胞、内皮细胞相关抗原。MSC与CM直接接触共培养后可分化为心肌样细胞，表达心肌特异蛋白肌钙蛋白T和肌球蛋白，CM与MSC比例为4：1时，MSC分化为心肌样细胞的比例最高。结论：MSC在与CM直接接触共培养条件下可被诱导分化为心肌样细胞，两种细胞按4：1比例混合培养后MSC分化为心肌细胞的效果最明显：     

兔骨髓间充质干细胞体外BrdU标记最佳时间和标记浓度的筛选

背景:骨髓间充质干细胞是目前极具潜力的细胞和基因治疗的宿主细胞.体外标记是追踪其存活、"归巢"、生长、分化等一系列过程的前提.目的:探索5-溴脱氧尿嘧啶核苷体外标记兔骨髓间充质千细胞的最佳时间和最佳浓度.方法:兔骨髓间充质干细胞取自纯种健康新西兰大耳白兔,通过形态学及流式细胞术鉴定分离培养的细胞为骨髓间充质干细胞.观察不同5-溴脱氧尿嘧啶核苷浓度标记及不同5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记时间对兔骨髓间充质干细胞的标记阳性率.结果与结论:流式细胞术检测培养的细胞为较纯的骨髓间充质干细胞,生长曲线呈S形.5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的阳性细胞率随标记时间延长以及标记物浓度增加而逐渐增高,40 μmol/L及72 h标记阳性率达85%～95%.结果提示,应用5-溴脱氧尿嘧啶核苷体外标记骨髓间充质干细胞是安全可靠的,体外标记最佳时间和最佳浓度分别为72 h和40 μmol/L.     

心肌组织裂解液诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：干细胞具有＂环境依赖性分化＂特性,以心肌组织裂解液模拟心肌微环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞方向分化的研究甚少。目的：观察心肌组织裂解液对大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞方向分化的影响。方法：选用生长良好的第2代骨髓间充质干细胞,加入诱导液连续培养5周,连续观察细胞形态学特征的变化规律,采用α-Actin进行免疫细胞化学染色观察干细胞是否向肌细胞方向分化,收集诱导后的细胞行苏木精-伊红染色观察是否存在闰盘,并通过电镜观察其超微结构。结果与结论：加入诱导液后大部分细胞呈＂竹节样＂,α-Actin免疫细胞化学染色阳性,表明间充质干细胞向肌细胞方向分化;苏木精-伊红染色可见闰盘,透射电镜下见排列整齐明暗相间的肌丝,扫描电镜下可见胞浆内有纤维状结构,说明＂竹节样＂细胞具有心肌细胞的典型形态结构特点。连续诱导12d多个区域出现成片的、具有自律性搏动的多核肌管结构。心肌组织裂解液可模拟心肌细胞的微环境,诱导骨髓间充质干细胞分化为具有典型形态结构特征和相应功能活动的心肌样细胞。     

5-溴脱氧尿嘧啶核苷体外标记肌源性干细胞:最佳浓度及时间

背景:肌源性干细胞移植入动物体内可以修复骨、肌肉、软骨或神经系统的损伤,但要了解其在体内的迁移、增殖及分化的情况,还需要一种有效、安全的标记方法来追踪其在体内的变化.目的:观察5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记肌源性干细胞的效果,探讨其最佳标记浓度和时间.方法:采用差速贴壁法体外分离SD大鼠肌源性干细胞,免疫细胞化学染色法鉴定第2代细胞并进行细胞计数.以终浓度5,10,15,20 μmol/L的5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记肌源性干细胞,检测其最佳标记浓度,免疫细胞化学染色法分析其标记率;通过MTT法、锥虫蓝排斥实验观察5-溴脱氧尿嘧啶核苷对细胞增殖的影响.结果与结论:免疫细胞化学染色显示肌源性干细胞呈Desmin阳性,阳性率为(85.7±6.0)%;经5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的肌源性干细胞与未进行标记细胞在活力和增殖上相比未见明显差异(P > 0.05),标记后的肌源性干细胞活细胞率可达(92.3±2.1)%.其中浓度为10,15,20 μmol/L标记组标记效果均优于5 μmol/L标记组,10 μmol/L为最佳工作浓度,最佳标记时间为3 d,标记率为(70.9±4.5)%,随时间延长无明显变化.证实应用5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记肌源性干细胞后,对细胞的活力及增殖情况无影响,标记率也能达到细胞移植对其示踪的要求.     

体外模拟心肌环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化

目的:以往研究将长有一层心肌细胞的半透膜放于骨髓间充质干细胞培养皿中,或用培养过心肌细胞的培养基来培养骨髓间充质干细胞,均未发现心肌细胞特异蛋白表达.为此体外模拟心肌微环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,并与常规诱导剂5-氮杂胞苷的诱导效果进行比较.方法:实验于2007-03/09在山西医科大学中心实验室完成.①动物:Wistar大鼠20只,新生1 d龄Wistar乳鼠10只,均由山西医科大学动物房提供,清洁级,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.诱导剂5-氮杂胞苷为美国Sigma公司产品.②实验方法:自新生Wistar乳鼠心脏分离培养心肌细胞,取第1、2代制成1×109 L-1细胞悬液,-70 ℃放置4～5 h后融化,吸管吹打,反复3次,离心取上清,过滤后即为心肌细胞冻融液,以此作为培养基体外模拟心肌微环境.自成年Wistar大鼠骨髓分离骨髓间充质干细胞,取生长良好的第2代制成1×108 L-1细胞悬液,分为4组:血清对照组加入含15%胎牛血清的DMEM/F12培养基;5-氮杂胞苷组加入10μmol/L 5-氮杂胞苷37 ℃避光孵育24 h后,换DMEM/F12培养基继续培养;5-氮杂胞苷 心肌细胞冻融液组加入10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导24 h后,在培养体系中加入相当于4倍骨髓间充质干细胞数量的心肌细胞冻融液;心肌细胞冻融液组加入相当于4倍骨髓间充质干细胞数量的心肌细胞冻融液.③实验评估:诱导1周后观察骨髓间充质干细胞的形态变化,利用免疫细胞化学技术鉴定心肌特异性肌钙蛋白T、连接蛋白43、α-横纹肌肌动蛋白、CD31的表达情况.结果:①体外模拟心肌微环境情况:培养7 d时心肌细胞形成细胞簇或细胞单层,呈放射状排列的同心圆状或峰谷样生长,细胞簇搏动呈明显同步性.传代后的心肌细胞仍具有自主收缩的特性.②骨髓间充质干细胞的体外诱导结果:诱导处理1周后,5-氮杂胞苷组多数细胞呈杆状,紧密平行排列生长,细胞体积变大,可见肌丝样结构形成;心肌细胞冻融液组细胞有聚集生长趋势,形成大量的子细胞,可见大量的肌丝样的结构;5-氮杂胞苷 心肌细胞冻融液组脱落或降解的细胞数明显少于5-氮杂胞苷组,也形成肌丝样结构,但部分细胞内有脂肪空泡形成.③免疫细胞化学鉴定结果:诱导培养1周后,血清对照组仅表达α-横纹肌肌动蛋白;5-氮杂胞苷组表达心肌特异性蛋白T、α-横纹肌肌动蛋白、连接蛋白43,其阳性率分别为20%,28%,25%,抗CD31染色呈阴性;心肌细胞冻融液组上述蛋白阳性表达率分别为23%,32%,28%,明显高于5-氮杂胞苷组(P < 0.05),同时抗CD31染色呈阳性;5-氮杂胞苷 心肌细胞冻融液组上述蛋白阳性表达率略低于心肌细胞冻融液组,抗CD31染色呈阳性.结论:①以心肌细胞冻融液体外模拟心肌微环境,可高效诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞.②部分骨髓间充质干细胞表达CD31,即可向血管内皮细胞分化,提示与5-氮杂胞苷单一的肌细胞诱导作用相比,心肌细胞冻融液更能提供一个心肌再生所需的自然条件.     

心肌微环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:骨形态发生蛋白、Wnt、Notch、FGF 及 Hedgehog 等信号通路是否参与诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化还不清楚. 目的:探讨心肌微环境中,不同刺激因素诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞及其分化的机制. 方法:利用 Transwel 培养装置建立心肌微环境,骨髓间充质干细胞在此环境中培养并加入 Wnt11、骨形态发生蛋白抑制剂诱导其向心肌细胞分化;应用 RT-PCR、Western blot 方法检测骨形态发生蛋白、Wnt、Notch、FGF 和 Hedgehog 信号通路关键信号分子的表达.同时检测心肌特异性转录因子(Nkx2.5、GATA4、Mef2c)和成熟心肌细胞特异性基因(cTnI、ANP、α-MHC、β-MHC)的表达. 结果与结论:骨髓间充质干细胞经过与大鼠心肌细胞共培养诱导后,Wnt、骨形态发生蛋白、Notch、Hedgehog 信号通路关键信号分子的表达较未诱导的阴性对照组明显升高(P <0.01).在骨髓间充质干细胞与大鼠心肌细胞共培养体系中加入骨形态发生蛋白信号通路的抑制剂Noggin,心肌特异性转录因子或结构蛋白的表达明显降低(P <0.01).提示心肌细胞构成的微环境可以诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞;Wnt、骨形态发生蛋白、Notch、FGF、Hedgehog 信号通路共同参与了诱导分化过程.     

体外培养脂肪干细胞向心肌细胞诱导的实验研究

目的：研究诱导体外培养脂肪干细胞（ADSCs）向心肌细胞分化的方法。方法：培养原代脂肪干细胞经CD34、CD44、CD105抗体标记鉴定后,进行5-aza诱导培养。通过鉴定心肌细胞特异性抗原横纹肌肌动蛋白及心肌特异性肌钙蛋白T检测细胞分化情况。结果：ADSCs高表达间充质干细胞特异抗原CD44、CD105,不表达CD34;表达HLA-I抗原,不表达HLA-抗原。经5-aza诱导后,细胞形态变为类似于心肌样细胞。免疫细胞化学检测横纹肌肌动蛋白及心肌特异性肌钙蛋白T呈阳性,流式细胞仪显示心肌细胞特异性抗原阳性细胞为94%。结论：脂肪干细胞具有向心肌细胞分化的可能,在组织工程学及干细胞移植领域有着良好的应用前景。     

体外模拟心肌环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化

目的：以往研究将长有一层心肌细胞的半透膜放于骨髓间充质干细胞培养皿中，或用培养过心肌细胞的培养基来培养骨髓间充质干细胞，均未发现心肌细胞特异蛋白表达。为此体外模拟心肌微环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化，并与常规诱导剂5-氮杂胞苷的诱导效果进行比较。 方法：实验于2007-03／09在山西医科大学中心实验室完成。①动物：Wistar大鼠20只，新生1d龄Wistar乳鼠10只，均由山西医科大学动物房提供，清洁级，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。诱导剂5-氮杂胞苷为美国Sigma公司产品。②实验方法：自新生Wistar乳鼠心脏分离培养心肌细胞，取第1、2代制成1×10^9L^-1细胞悬液，-70℃放置4～5h后融化，吸管吹打，反复3次，离心取上清，过滤后即为心肌细胞冻融液，以此作为培养基体外模拟心肌微环境。自成年Wistar大鼠骨髓分离骨髓间充质干细胞，取生长良好的第2代制成1×10^8L^-1细胞悬液，分为4组：血清对照组加入含15％胎牛血清的DMEM／F12培养基；5-氮杂胞苷组加入10μmol／L 5-氮杂胞苷37℃避光孵育24h后，换DMEM／F12培养基继续培养；5-氮杂胞苷＋心肌细胞冻融液组加入10μmol／L 5-氮杂胞苷诱导24h后，在培养体系中加入相当于4倍骨髓间充质干细胞数量的心肌细胞冻融液；心肌细胞冻融液组加入相当于4倍骨髓间充质干细胞数量的心肌细胞冻融液。③实验评估：诱导1周后观察骨髓间充质干细胞的形态变化，利用免疫细胞化学技术鉴定心肌特异性肌钙蛋白T、连接蛋白43、α-横纹肌肌动蛋白、CD31的表达情况。 结果：①体外模拟心肌微环境情况：培养7d时心肌细胞形成细胞簇或细胞单层，呈放射状排列的同心圆状或峰谷样生长，细胞簇搏动呈明显同步性。传代后的心肌细胞仍具有自主收缩的特性。②骨髓间充质干?     

Thymus-derived rosettes are not "helper" cells

Rosettes against SRBC were made from normal spleen cells. Although T rosettes tend to dissociate, they could be stabilized with 0.05% sodium azide. A clear separation of nonrosettes, T rosettes, and B rosettes was obtained by subjecting the suspension of splenic rosettes to velocity sedimentation at unit gravity. Each fraction was injected with either normal bone marrow cells or normal thymus cells with antigen into 650-R-irradiated hosts. Direct plaque-forming cells (PFC) were assayed in the spleens 7 days later. Synergism with thymus cells occurred only in the B-rosette fraction; PFC precursors therefore sedimented as B rosettes. Synergism with bone marrow cells occurred only in the nonrosette small lymphocyte fraction; helper cells therefore did not bind detectable numbers of sheep red blood cells (SRBC). Thus T rosettes are not helper cells in the direct PFC response of bone marrow B cells to SRBC.     

Adenosine triphosphate utilization by "young" and "old" red cells

“Young” red cells lose adenosine triphosphate more rapidly than “old” cells during incubation in the absence of glucose. Comparable findings with 2,3-diphosphoglycerate suggest that this precursor cannot account for the differential loss of adenosine triphosphate in cells of different ages. Studies with a cardiac glycoside indicate that the difference in adenosine triphosphate loss between young and old cells is ouabain resistant.     

"Pathogen-mimicking" nanoparticles for vaccine delivery to dendritic cells

A clinically relevant delivery system that can efficiently target and deliver antigens and adjuvant to dendritic cells (DCs) is under active investigation. Immunization with antigens and immunomodulators encapsulated in poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) (PLGA) nanoparticles elicits potent cellular immune responses; but understanding how this mode of delivery affects DCs and priming of naive T cells needs further investigation. In the current study, we assessed the extent of maturation of DCs after treatment with monophosphoryl lipid A (MPLA) encapsulated in PLGA nanoparticles and the generation of primary T-cell immune responses elicited by DCs loaded with antigens using this approach. Results indicated that DCs up-regulated the expression of surface maturation markers and demonstrated an enhanced allostimulatory capacity after treatment with MPLA containing PLGA nanoparticles. Treatment of DCs with MPLA containing nanoparticles released high amounts of proinflammatory and TH1 (T helper 1) polarizing cytokines and chemokines greater than that achieved by MPLA in solution. The delivery of ovalbumin in PLGA nanoparticles to DCs induced potent in vitro and in vivo antigen-specific primary TH1 immune responses that were furthermore enhanced with codelivery of MPLA along with the antigen in the nanoparticle formulation. Delivery of MUC1 lipopeptide (BLP25, a cancer vaccine candidate) and MPLA in PLGA nanoparticles to human DCs induced proliferation of MUC1 reactive T cells in vitro demonstrating the break in tolerance to self-antigen MUC1. These results demonstrated that targeting antigens along with toll-like receptor ligands in PLGA nanoparticles to DCs is a promising approach for generating potent TH1 polarizing immune responses that can potentially override self-tolerance mechanisms and become beneficial in the immunotherapy of cancer and infectious diseases.     

循环肿瘤细胞的“旧语新说”

循环肿瘤细胞(CTC)是指游离在循环体液中的肿瘤细胞;CTC检测避免了侵入性组织活检的局限性,取材便捷、无创,在动态反映肿瘤状态、疗效监测与预后评估中有重要作用。目前,应用于临床的CTC计数是评估乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌预后的有效指标;CTC携带的肿瘤特异性抗原与核酸分析的转化研究,将有助于提高CTC的捕获效率与诊断性能。虽然CTC检测技术的临床应用仍然面临着诸多挑战,但是其在肿瘤诊疗上的潜力不容小觑,具有广阔的应用前景。     

成年组织干细胞"横向分化"或"可塑性"特性遭到严重质疑--还成年组织干细胞生物学特性的本来面目

20世纪 90年代中期 ,有报道某些成年组织干细胞可分化成为在发育上无关的其它组织的细胞类型 ,即成年组织干细胞具有“可塑性”(ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ)、“横向分化”或“跨系分化”(ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ)潜能。此后有关各种成年组织干细胞“可塑性”研究的报道在《Ｎａｔｕｒｅ》、《Ｓｃｉｅｎｃｅ》及《Ｃｅｌｌ》上出现 ,1998～ 2 0 0 1年这类报道达到了高潮。从发育生物学的角度讲 ,只有胚胎干细胞 (ＥＳ)才能产生不同胚层的各类细胞 ,而成年组织干细胞在其进化潜能上则有局限性 ,只能向其所在胚层的某些或某类细…