RNA干涉（RNAi）抑制宫颈癌细胞SiHa中E7基因表达的实验研究

目的探讨HPV16 E7特异性小干涉RNA（siRNA）表达载体对宫颈癌SiHa细胞E7基因的抑制作用。方法构建HPV16 E7特异性表达载体,利用脂质粒转染SiHa细胞,用RT-PCR及Western blot检测其对E7 mRNA及蛋白的影响。结果两条siRNA均能有效抑制E7mRNA的转录表达,其中以pshRNA-HPV16 E71作用效果最明显,在转染后72h,对E7 mRNA和蛋白的抑制率分剐为78．4％和57．6％。结论HPV16 E7 siRNA表达载体对宫颈癌SiHa细胞E7基因的表达有抑制作用。     

siRNA 表达载体抑制宫颈癌SiHa细胞增殖的实验研究

目的 观察HPV16E7 siRNA表达载体对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响.方法 利用脂质体将HPV16E7特异性siRNA表达载体转染SiHa细胞,通过荧光定量RT-PCR检测E7 mRNA的变化;流式细胞仪检测E7蛋白的变化和细胞周期的分布;MTT法检测细胞增殖的变化.结果 HPV16E7 siRNA表达载体可明显抑制SiHa细胞E7 mRNA和E7蛋白的表达,抑制率分别为92.15%、84.30%;阻滞SiHa细胞由G1期进入S期;抑制细胞的生长.结论 HPV16E7 siRNA表达载体可以特异高效地抑制宫颈癌SiHa细胞E7基因的表达,从而调控肿瘤细胞周期,抑制肿瘤细胞增殖.     

RNA干扰技术抑制HPV16 E6基因表达对宫颈癌细胞株CaSki增殖的影响

目的观察HPV16 E6小干扰RNA(siRNA)能否抑制宫颈癌细胞生长,并探讨其作用机理。方法化学合成针对HPV16 E6的siRNA,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,应用细胞计数的方法测定细胞生长曲线、活细胞率及细胞生长抑制率。运用实时荧光定量RT-PCR、流式细胞术检测转染后不同时间点细胞周期、HPV16 E6、p53、p21 mRNA及蛋白表达的变化。结果转染HPV16 E6 siRNA后,细胞生长明显受到抑制。流式细胞术结果显示并未将细胞阻滞在G1期。实时荧光定量RT-PCR显示,转染24h,E6 mRNA的表达比空白组降低了20.11倍(P<0.05),而p53、p21 mRNA的表达无明显变化。转染48h,E6蛋白表达明显下调,Pp53、P21蛋白表达相应地升高。结论HPV16 E6 siRNA可通过特异、高效地沉默宫颈癌细胞E6mRNA的表达,减少对野生型p53的降解,恢复P53蛋白的功能活性而发挥抑制宫颈癌细胞生长的作用。     

人乳头瘤病毒16 E7 (HPV16E7)逆转录病毒载体的构建

目的 构建人乳头瘤病毒16型E7基因片段（HPV16E7）的逆转病毒载体。方法 PCR扩增HPV16cDNA全长的E7片段，并用酶切，连接等方法将HPV16E7亚克隆到逆转录病毒载体pLXSN上，然后再用酶切，测序进行鉴定，通过Genbank的数据库分析软件对PV16E7进行同源性分析。结果 经酶切分析，测序证明，从HPV16cDNA克隆的300bp的HPV16E7与逆转录病毒载体发生了基因重组，HPV16E7基因片段与数据库中的原HPV16cDNA的E7有高度的同源怀。结论 构建了含HPV16E7的逆转录病毒载体，为人关节软骨细胞的基因转染打下了基础。     

RNA干涉抑制宫颈癌HPV16 E6基因的研究

目的采用RNA干涉（RNAi）技术干扰宫颈癌HPV16 E6基因转录,通过体外和体内实验了解其特异性抑制HPV16 E6基因的效率。方法设计合成针对HPV16 E6的小干扰RNA（siRNA）,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,通过测定转染后不同时间点的细胞凋亡率、HPV16 E6mRNA及蛋白表达变化了解基因抑制的效率。体内实验中建立子宫颈癌荷瘤裸鼠模型,将E6 siRNA直接注入瘤体,观察肿瘤体积的变化,肿瘤切片HPV16 E6免疫组化染色,观察肿瘤坏死和细胞的凋亡。结果HPV16 E6siRNA转染细胞后24h、48h、5d和9d时凋亡率分别为7．7％、11．8％、37．4％和12．6％。RT-PCR显示转染后24h、48h、5d和9d HPV16 E6 mRNA量减少了77％、83％、59％和41％。Western blot显示转染后的HPV16 E6蛋白表达在24h、48h、5d明显减少,9d时有所恢复;流式细胞仪HPV16 E6蛋白定量测定结果显示,转染后24h、48h、5d和9d蛋白表达抑制率分别为79．7％、80．4％、71．3％和57．4％。体内实验瘤内注射HPV16 E6 siRNA明显抑制肿瘤的生长,HPV16 E6蛋白表达明显受抑,肿瘤组织坏死和细胞凋亡增加,重复给药较单次给药效果更好。结论体内和体外实验均表明RNA干涉HPV16 E6基因的效果具有特异性和高效性。     

人乳头状病毒16/18及E6、E7基因在宫颈癌组织中的表达

目的探讨高危型人乳头状病毒(HPV)16／18及其E6、E7基因在宫颈癌诊断中的价值。方法对104例宫颈新鲜组织(正常对照16例，轻度宫颈增生18例，中度宫颈增生20例，重度宫颈增生20例，宫颈癌30例)进行研究，荧光定量PCR用于HPV16／18的检测，PCR用于E6、E7基因的检测。结果正常对照组：HPV16／18阳性1例，E6、E7基因无阳性；轻度宫颈增生：HPV16／18阳性2例，R、E7基因无阳性；中度宫颈增生：HPV16／18阳性2例，E6、E7基因阳性1例；重度宫颈增生：HPV16／18阳性6例，R、E7基因阳性2例；浸润型宫颈癌：HPV16／18阳性16例，E6、E7基因阳性7例。结论宫颈癌组织HPV16／18和E6、E7基因阳性率明显高于其它子宫颈增生者，并随子宫颈增生程度逐渐增加。     

逆转录病毒载体介导HPV16E7对人关节软骨细胞的转化及其生长特性

目的 研究HPV16E7（human papillomavirus 16 E7)基因片段对人关节软骨细胞的转化作用以及转化细胞的生长特性。方法 利用含HPV16E7基因的逆转录病毒载体pLXSN转染人关节软骨细胞，检测HPV16E7基因的整合与表达，并用生长曲线，血清依赖试验，电镜及流式细胞仪细胞周期时相观察，了解转化细胞与正常软骨细胞的生长特性。结果 挑选出能够在体外长期培养的经HPV16E7转化的细胞克隆，已传代50代，PCR及RT－PCR证实HPV16E7已与宿主细胞基因组成功整合及转录，转化细胞的生长速率要高于正常软骨,二者都对血清有较大程度的依赖，转化细胞的核质比大，核仁明显，S期细胞数显著高于正常软骨细胞。结论 经HPV16E7基因转化的人关节软骨细胞增殖能力强，可连续传代达50代。     

新疆南部维吾尔族妇女HPV16E6，E7基因突变与宫颈癌及癌前病变的相关性研究

目的：本研究检测HPV16E6,E7基因突变在新疆南部地区雏吾尔族妇女宫颈癌及癌前病变组织中的发生情况,探讨HPV16E6,E7基因突变与宫颈痛变及宫颈癌的关系。方法：以德国标准株HPV16DNA为原型对新疆南部维吾尔族妇女宫颈癌40例及癌前病变80例组织提取HPV16DNA,对其E6E7PCR扩增产物进行测序后进行对比,分析其突变情况．结果：HPV16阳性率分布：宫颈癌85％（34／40）,CINⅡ～Ⅲ42．5％（17／40）,CINⅡ10％（4／40）,对照组0（0／40）。HPV16E6突变率：宫颈癌中突变40％（16／40）,CINⅡ—Ⅲ中突变15％（6／40）。（x^2=0．023,P=0．011,r=0．998,P=0．038）,HPVE7突变率：宫颈癌中突变7．5％（3／40）,CINⅡ—Ⅲ组中突变率7．5％（3／40）．CINⅠ中突变率0（x^2=0．413,P=0．520）,E6E7同时突变率：宫颈癌组中突变率15％（6／40）;CINⅡ—Ⅲ中突变率7．5％（3／40）,CINⅠ中0（0／40）,（x^2=6．342,P=0．011）。结论：1．HPV16在宫颈癌,癌前病变的突变以单一的E6突变和E6,E7同时突变为主。2．随着宫颈病变向宫颈癌发展其发生突变率也随之增加。     

HPV16 E6/E7融合基因真核表达载体的构建

目的构建pEGFP-N1-E6/E7融合基因真核表达载体。方法应用聚合酶链反应技术(polymerasechain reaction,PCR)从SiHa细胞中扩增出人类乳头瘤病毒16型(HPV16)E6/E7基因全长片段,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-N1上。结果获得了包含全长阅读框架的HPV16E6/E7基因,并成功克隆到真核表达载体中。结论成功构建了pEGFP-N1-E6/E7融合基因真核表达载体。     

人乳头瘤病毒16型E6、E7反义RNA对人宫颈癌SiHa细胞的恶性逆转作用

通过真核表达载体介导HPV16型E6、E7基因反义RNA在SiHa细胞中的表达，探讨反义RNA能否降低E6、E7基因的表达和诱导细胞凋亡。利用pEGFP构建HPV16型E6、E7基因反义RNA的真核表达载体并转染SiHa细胞。利用RT-PCR和Western blot技术检测转染后E6、E7基因的mRNA和蛋白的变化，利用MTT法检测SiHa细胞转染后细胞增殖活性，利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测转染后细胞的凋亡情况。     

肿瘤转移抑制基因KAI1在宫颈癌的表达及其与HPV感染的关系

目的探讨肿瘤转移抑制基因KAI1在宫颈癌中的蛋白表达以及人乳头瘤病毒(HPV)16E6、E7和HPV18E6/E7感染对其表达的影响。方法采用免疫组化SP法检测70例浸润性宫颈癌、15例原位癌、20例正常宫颈组织中KAI1蛋白的表达,采用PCR扩增-琼脂糖凝胶电泳法检测浸润性宫颈癌组织中HPV16E6、E7和HPV18E6/E7的DNA状况。结果宫颈浸润癌及原位癌组织中的KAI1蛋白表达与正常宫颈上皮中的表达相比明显下调(P<0.05),原位癌与浸润癌中的表达差异无统计学意义;HPV16E6、E7和HPV18E6/E7在浸润性宫颈癌中的阳性率分别为67.1%、54.3%和12.9%,HPV16E6、E7和HPV18E6/E7感染与宫颈癌中的KAI1蛋白表达无相关性。结论肿瘤转移抑制基因KAI1在宫颈癌中呈下调表达,HPV16E6、E7和HPV18E6/E7感染不影响其表达。     

高危HPVE6/E7mRNA对宫颈病变诊断价值的研究

目的 探讨高危HPV E6/E7 mRNA对宫颈病变的临床诊断价值。 方法 根据病理诊断结果的不同分为两组,其中慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ级患者共48例为对照组,高级别宫颈病变(包括CINⅡ级、CINⅢ级及宫颈浸润癌)共42例患者为观察组,分别对上述宫颈细胞标本进行HPV DNA分型检测和高危HPV E6/E7 mRNA检测。 结果 慢性宫颈炎、CINⅠ组中高危HPV DNA的检出率(29.1%)明显高于高危HPV E6/E7 mRNA(8.3%),高级别宫颈病变组中高危HPV E6/E7 mRNA的检出率(85.7%)明显高于高危HPV DNA(64.3%),差异有统计学意义(P<0.05);高危HPV E6/E7 mRNA检测的敏感度、特异性、阳性预测值、阴性预测值(85.7%、91.7%、90.0%、88.0%)均高于HPV DNA分型检测(64.3%、70.8%、65.9%、69.3%),差异有统计学意义(P<0.05)。 结论 高危HPV E6/E7 mRNA检测在临床诊断过程中大大降低过度检查和治疗的机会,避免了高频率和重复感染给患者带来的经济负担和精神压力。     

湖北地区宫颈癌组织HPV16 E7和E5转化基因变异分析

目的:分析湖北地区宫颈癌组织HPV16E7和E5基因序列变异情况。方法:对87例宫颈鳞癌组织分别采用多重HPV16E7引物进行巢式PCR扩增和HPV16E5特异引物进行PCR扩增,并选择阳性扩增的基因片段DNA进行纯化、测序,检测基因变异。结果:测序成功的20例宫颈癌组织DNA中,HPV16E7基因的5个突变位点为:T846C、A647G、T732C、T789C、T795G,突变频率分别为85%(17/20)、70%(14/20)、15%(3/20),10%(2/20)、5%(1/20);HPV16E5基因的4个突变位点包括:A3979C、A4042G、G3868A、C3991T,突变频率分别为:80%(16/20)、90%(18/20)、5%(1/20)、5%(1/20)。结论:湖北地区宫颈癌的宫颈组织中HPV16E7热点突变为A647G和T846C,HPV16E5的热点突变为A3979C和A4042G,本研究为湖北地区宫颈癌流行病学的研究打下基础。     

人乳头瘤病毒E6/E7mRNA检测在宫颈病变中的诊断价值研究

目的 探索HPV E6/E7mRNA检测在宫颈病变中的诊断价值。方法 收集2016年12月~2017年10月在笔者医院妇科行细胞学和HPV DNA基因分型联合筛查发现疑似宫颈病变并转阴道镜活检的女性病例262例,活检同期均行HPV E6/E7mRNA检测,以宫颈组织病理活检为标准对照。对比3种方法检测宫颈病变HSIL的敏感度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比及受试者工作特征曲线下面积（AUC）,及3种方法在不同病理级别中的检出情况,并分析HPV E6/E7mRNA病毒载量与病变关系。结果 HPV E6/E7mRNA检测宫颈病变≥HSIL的敏感度与HPV DNA基因分型和细胞学相似,特异性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比均高于细胞学和HPV DNA基因分型;HPV E6/E7mRNA的受试者工作特征曲线下面积（AUC=0.80, P<0.01）高于细胞学（AUC=0.65, P<0.01）和HPV DNA分型（AUC=0.54,P>0.05）的曲线下面积;HPV mRNA和细胞学在不同病理级别中的检出率比较,差异有统计学意义（P<0.01）,HPV DNA基因分型在不同病理级别中的检出率比较差异无统计学意义（P>0.05）;HPV E6/E7 mRNA表达水平与组织病理分级之间的相关关系有统计学意义（P<0.01）,且HPV E6/E7mRNA表达水平与宫颈病理分级间呈正相关（r=0.467）。结论 HPV E6/E7mRNA检测对宫颈病变诊断准确性优于细胞学和HPV DNA分型,在宫颈病变及癌变的筛查中具有一定的临床价值,临床医生应给予关注。     

宫颈癌前病变中ΔNP63与HPV16 E7表达的研究

目的:研究宫颈上皮内瘤变中ANP63和HPV16 E7 mRNA的表达情况,寻找用于临床评估CIN病变进展趋势的生物学标志物。方法:收集临床71例薄层液基细胞标本,采用SP免疫组化法检测细胞中ANP63的蛋白表达,RT-PCR法检测残留标本中HPV16 E7的mRNA转录情况。结果:1．ANP63定位于异常鳞状上皮细胞和腺细胞,在CIN中表达高于炎症组(P< 0．05);2．HPV16 E7在CIN中表达明显高于炎症组(P<0．05);3．CIN中ANP63与HPV16 E7的检测结果具有较好的一致性。结论:ANP63可作为CIN的生物学标志物辅助细胞学筛查;ANP63可间接反映HPV16 E7的转录情况,有利于临床评估高危型病毒HPV16的致瘤能力。     

HPV16E7基因和P16~(INK4A)蛋白在宫颈病变中的表达及其临床意义

目的:检测宫颈病变组织中HPV16E7基因和P16INK4A蛋白的表达,分析基因表达变化的临床意义。方法:入选慢性宫颈炎和CINⅠ^Ⅱ患者81例、CINⅢ、宫颈浸润性鳞癌患者57例,采用PCR扩增技术检测宫颈病变组织HPV16E7基因表达,采用免疫组化方法检测宫颈病变组织P16INK4A蛋白表达,用SPSS软件行等级相关分析和χ2检验。结果:⑴HPV16E7特异性片段阳性率在慢性宫颈炎、CINⅠⅡ患者81例、CINⅢ、宫颈浸润性鳞癌患者57例,采用PCR扩增技术检测宫颈病变组织HPV16E7基因表达,采用免疫组化方法检测宫颈病变组织P16INK4A蛋白表达,用SPSS软件行等级相关分析和χ2检验。结果:⑴HPV16E7特异性片段阳性率在慢性宫颈炎、CINⅠ^Ⅱ中分别为17.0%、26.5%,在CINⅢ及宫颈浸润性鳞癌中分别为61.5%和74.2%;HPV16E7分布在慢性宫颈炎、CINⅠⅡ中分别为17.0%、26.5%,在CINⅢ及宫颈浸润性鳞癌中分别为61.5%和74.2%;HPV16E7分布在慢性宫颈炎、CINⅠ^Ⅱ和CINⅢ、宫颈浸润性鳞癌间差异具有统计学意义(P<0.001);⑵P16INK4A蛋白的表达在慢性宫颈炎、CINⅠⅡ和CINⅢ、宫颈浸润性鳞癌间差异具有统计学意义(P<0.001);⑵P16INK4A蛋白的表达在慢性宫颈炎、CINⅠ^Ⅱ分别为10.6%和30.0%,在CINⅢ和宫颈浸润性鳞癌中分别为96.0%和100%;P16INK4A蛋白的表达在慢性宫颈炎、CINⅠⅡ分别为10.6%和30.0%,在CINⅢ和宫颈浸润性鳞癌中分别为96.0%和100%;P16INK4A蛋白的表达在慢性宫颈炎、CINⅠ^Ⅱ和CINⅢ、宫颈浸润性鳞癌间差异具有统计学意义(P<0.001);⑶在HPV16E7特异性片段表达阳性的宫颈病变组织中,P16INK4A蛋白的表达均是阳性。宫颈病变组织中P16INK4A蛋白与HPV16E7的表达有相关性(r=0.482,P<0.001)。结论:HPV16E7和P16INK4A蛋白与宫颈上皮内瘤变和宫颈癌的发生具有相关性,HPV16E7和P16INK4A蛋白可能是宫颈上皮内瘤变和宫颈癌的早期预测指标。