普通PCR与TD-PCR在临床医学科研中应用价值的比较

目的 比较普通聚合酶链反应(PCR)与降落聚合酶链反应(Touchdown PCR,TD-PCR)在临床医学科研中的价值.方法 以人类外周血基因组DNA为模板,设计VHL基因3个外显子的3对引物,根据普通PCR及TD-PCR原理设计包括3个外显子片段在内的PCR程序,通过试验选择PCR最佳反应条件,在同一程序中分别对3个片段进行扩增,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,纯化后PCR产物测序分析两种试验方法 的差别.结果 电泳检测及纯化后DNA产物测序分析均显示TD-PCR扩增产物条带特异性、效率较普通PCR扩增产物高.结论 成功建立了TD-PCR方法 ,TD-PCR方法 较普通PCR更为高效实用,为临床基因突变筛查研究提供了快速可靠的手段.     

建立高效的转基因动物鉴定技术体系

转基因动物的鉴定是转基因动物研究领域的重要内容。本文简要回顾了相关鉴定技术的研究进展 ,建立和完善了特异性PCR扩增及其产物酶切的转基因动物鉴定体系 ,在引物设计、PCR参数优化、设立内源性标记等方面作了进一步的改进 ,提高了PCR的特异性和可靠性。实验表明 ,PCR扩增及其产物酶切是一种准确、灵敏、简便、重现性好的转基因动物筛选鉴定方法     

用原位逆转录PCR两种扩增系统检测HCV RNA 的对比研究

原位PCR(IS-PCR)技术是能在组织切片或细胞涂片上原位对特定的DNA或RNA进行扩增的一种新技术,是PCR和原位杂交两种技术相结合的产物.与原位杂交相比,由于先对待测基因片段进行扩增,因而具有更高的灵敏度,可以检测出原位杂交所检不出的单拷贝、低拷贝(20bp)基因,能将敏感性提高50～100倍,同时又具有原位杂交良好的定位能力.间接法IS-PCR是目前应用最广泛的靶序列原位扩增技术,其所用引物和dNTP都不带标志,扩增结束后,再用原位杂交技术检测特异性扩增产物.与直接法相比较,虽然操作复杂,但是扩增效率高,更重要的是特异性强,假阳性率低,这是因为原位杂交所用的探针可特异性地检出扩增产物中的靶序列,这样,即使扩增产物中有非靶序列成分,也不会呈阳性反应,因而提高了原位PCR的特异性.原位逆转录PCR(IS-RT-PCR)是结合逆转录反应和PCR扩增检测细胞内低拷贝mRNA的方法.以mRNA为模板,在逆转录酶催化下合成cDNA,再以cDNA为模板,用PCR对靶序列进行扩增,然后进行IS-PCR检测RNA常用方法,并已成功用于检测丙型肝炎组织的HCV RNA.由于丙型肝炎是RNA病毒,不能直接进行PCR扩增,需经逆转录成cDNA方可扩增,称之为原位逆转录PCR.目前常用的逆转录酶有两种:禽类成髓细胞性白血病病毒(AMV)和莫罗尼鼠类白血病病毒(MMLV),在实际工作中发现两种酶系统存在着较大的差异,故此,对两种系统的酶用不同浓度在原位PCR中的HCV RNA逆转录扩增的灵敏度进行研究与探索. 　　……     

STR—PCR定量检测供受者嵌合体方法的建立及临床应用

利用STRs的高度多态性等特性,用竞争性聚合酶链反应（PCR）结合聚丙烯凝胶电泳、染色和凝胶成像分析等技术,建立定量检测异基因造血干细胞移植后供受者嵌合体的方法,用无关个体的DNA混合实验进行可行性和准确性研究,并同时做染色体分带进行对照,以此基础上对2例非清髓异基因造血干细胞移植病人的植入情况进行动态检测。结果显示,扩增产物中供受者DNA含量的百分比同扩增前混合样本的比例呈显著直线相关,STR－PCR检测嵌合体方法简单、快速、可靠、敏感性高,所需标本量少且不受性别限制,是检测NAST供受者嵌合体的新方法。     

乙型肝炎、丁型肝炎病毒联合诊断芯片制备的初步研究

目的制备联合检测乙型肝炎病毒(HBV)、丁型肝炎病毒(HDV)基因芯片并进行杂交验证。方法利用Primer Premier 5．0分别针对HBV、HDV基因保守区域设计多对PCR引物,扩增后的产物克隆至pMD18-T载体,提取阳性克隆质粒进行测序分析鉴定。用PixSys5500芯片打印仪将PCR产物打印在氨基修饰的玻片上制备成检测芯片。样品荧光标记采用限制性显示(RD)技术,标记后进行杂交验证分析。结果序列分析表明,运用PCR技术得到的多个基因片段均属于HBV、HDV特异基因。杂交结果显示,敏感性、特异性、重复性等指标均佳。结论利用PCR扩增产物作为探针制备HBV、HDV联合诊断芯片是一种快速、简便的实用方法,有着广阔的应用前景;利用RD技术标记样品可提高多种肝炎病毒混合检测的敏感性。     

基于生物信息学分析的人ID4基因启动子表达载体的构建及鉴定

目的:基于生物信息学分析构建人ID4基因启动子表达载体,以其作为研究ID4基因启动子表达调控分析的工作基础.方法:在分析人ID4基因启动子结构和调控元件的基础上,据UCSC基因组生物信息学中人ID4基因转录起始点(TSS)上游启动子区-643 bp及5'非翻译区(5'-UTR) 164 bp序列设计并合成引物,进行PCR扩增;以PCR产物作为模板经巢式PCR扩增了TSS上游启动子区-621 bp片段,将PCR产物回收、纯化后再连接到pGEM-T Easy载体上并转化至DH5α感受态大肠杆菌中构建成pGEM-T Easy-人ID4基因启动子重组质粒.转化产物经半巢式PCR及酶切鉴定,对得到的阳性克隆进行测序.结果与结论:成功构建出含有糖皮质激素受体、cAMP结合蛋白及雌激素受体反应调控元件序列的人ID4基因启动子表达载体.该表达载体的构建为进一步研究人ID4基因的启动子活性及表达调控奠定了基础.     

《现代基因操作技术》

本书针对国内医学分于生物学实验研究的实际需要,详细介绍了基因操作技术、包括基因分离与基因作图、PCR条件最佳化及特殊peR、PCR产物的克隆、突变与重组技术、对已知序列两旁未知序列的克隆方法、CDNA文库的构建与筛选、用差示法和扣除法做CIjNA分析与克隆、寡核苛酸启动的原位DNA合成技术、原位多聚酶链反应技术等。内容先进,实用性强.可供临床和基础医学各专业从事分子生物学实验研究的工作人员参考学习。 本书于2000年10月由人民军医出版社出版。《现代基因操作技术》     

PCR-RFLP技术在布氏菌鉴定与分型中的应用

目的 利用PCR-RFLP技术扩增7株布氏菌临床分离株16S RNA基因片段,为该菌的分子诊断学、遗传学和流行病学研究提供实验依据.方法 参考GenBank公布的布氏菌ATCC 25840标准株序列,设计针对该菌16S RNA保守区的特异性引物,从临床分离培养7株布氏菌,提取DNA并行16S RNA片段的PCR扩增.将PCR产物克隆至PGEM-T载体进行测序并选用合适的限制性内切酶进行RFLP分析,将分析结果用于临床株的同源性及变异位点的研究,并对感染患者的临床资料进行回顾性分析,研究不同布氏菌基因型与感染患者临床特征的相关性.结果 利用PCR扩增出的目的片段与预期一致,大小约为1500bp.测序及同源性分析表明,7株临床分离株之间存在98.88%的同源性和11个变异位点.RFLP结果将7株菌分为4个基因型,临床资料回顾性分析患者不同基因型与临床表现之间无明显联系.结论 利用PCR技术扩增布氏菌16S RNA基因片段可以实现对该菌的早期诊断,为布氏菌的分子遗传学和流行病学提供依据.     

儿童进行性脊肌萎缩症的分子诊断(附10例报告)

目的 对10例儿童进行性脊肌萎缩症(SMA)患者进行分子诊断.方法 提取10例SMA患者和其19例家系成员(患者的父母)以及20例健康正常人对照的基因组DNA.常规PCR扩增SMN基因第7外显子(E7),PCR产物经Dra I酶切后,行琼脂糖凝胶电泳.同时行特异性PCR扩增SMN1和SMN2的E7.结果 常规PCR中,所有10例SMA患者的SMN1 PCR产物(189bp)全部被Dra I切割,所有39例对照组成员(包括19例家系成员和20例健康正常人对照)的SMN1 PCR产物仅有部分可被Dra I切割.在位点特异性PCR中,所有10例SMA患者只有SMN2的E7扩增,所有39例对照组成员既有SMN1、也有SMN2的E7扩增产物.结论 所有10例SMA患者可见SMN1纯合性缺失.所有39例对照组成员未见SMN1纯合性缺失.本研究采用PCR-RFLP和位点特异性PCR相结合,相互佐证,形成一套特有的分子诊断方法,确保了诊断的准确性.     

人α-磷酸丙酮酸水合酶原核表达载体的构建及蛋白纯化

目的 构建带PET-28a标签的人ENO1基因原核表达产物,观察其表达并纯化出带PET-28a标签的ENO1融合蛋白,为研究肿瘤糖酵解的相关机制奠定实验基础.方法 以人乳腺文库为模板,利用PCR技术扩增出ENO1基因编码片段,将其插入到PET-28a载体中,鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌Rossate,小量诱导表达后,利用PET-28a-琼脂糖凝胶4B亲和珠纯化PET-28a-ENO1融合蛋白,经SDS-PAGE电泳和Western印迹检测,获得纯度较好的PET-28a-ENO1蛋白.结果 利用PCR技术从乳腺文库中扩增得到大小约1300 bp的目的基因片段,插入PET-28a载体中,经双酶切鉴定及测序,结果表明PET-28a-ENO1质粒构建成功;转化Rossate菌并小量诱导,表达鉴定成功后纯化得到相对分子质量(Mr)约为57×103的目的蛋白.结论 成功获得了人糖酵解相关基因ENO1的原核表达产物,为进一步研究ENO1在糖酵解过程中的作用机制奠定基础.     

醛缩酶A基因真核表达载体的构建及其生物学活性分析

目的 构建带FLAG标签的醛缩酶A(ALDOA)基因的真核表达载体,对其表达产物进行功能检测.方法利用PCR技术从人乳腺文库中扩增ALDOA基因,将其克隆至真核载体pcDNA3.0-FLAG中.经过酶切与测序验证,转染人胚肾293T细胞系,利用蛋白质免疫印迹实验完成其表达鉴定.转染人乳腺癌细胞MCF7和ZR75-1,使...     

抑制性消减杂交技术筛选XTP4蛋白反式调节基因

目的 筛选、克隆乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg）反式激活基因XTP4转染肝癌细胞后的反式调节基因,探索XTP4基因表达对肝细胞基因表达谱的影响。方法 常规的分子生物学技术构建真核表达载体peDNA3．1(-)-XTP4,应用抑制性消减杂交(SSH)技术对重组表达质粒peDNA3.1(-)-XTP4转染的HepG2细胞和空载体转染的相同细胞差异表达的mRNA进行研究,将富集的二次PCR产物与T／A载体连接,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 消减文库扩增后得到21个阳性克隆,PCR分析显示其中16个克隆含有200～1000bp的插入片段。对插入片段进行测序及生物信息学分析,结果共获得9种蛋白编码基因。这些差异表达的基因与肝细胞纤维化形成、肿瘤发生、线粒体氧化还原代谢、细胞生长调节密切相关。结论 应用SSH技术成功筛选了XTP4对肝癌细胞的反式调节基因,为进一步阐明HBxAg对肝细胞蛋白的反式调节作用提供了理论依据。     

锚定多重PCR技术的建立及其在核酸相对分子质量标准制备中的应用

目的利用5＇端锚定引物及多重聚合酶链反应（PCR）技术建立高效、特异性扩增核酸片段的方法,并探讨其在核酸相对分子质量（Mr）标准（DNA标志物）制备中的应用。方法针对常用的pMD19-T载体（2692 bp）序列,利用命令行程序pd4marker.py,结合Primer3及多因素引物特异性评估软件MFEprimer,设计5＇端锚定的上游引物和7对扩增不同目的片段的下游引物;其次,以转化有pMD19-T载体的大肠杆菌DH5α菌液为模板,分别进行一至七重PCR扩增;并将扩增产物经2%琼脂糖凝胶分离及凝胶成像仪采集图像分析;最后,评估该方法在核酸Mr标准制备中的应用。结果制备了特异性较好的一至七重PCR扩增产物,可针对不同实验目的进行不同核酸Mr标准的制备。结论建立了一种快速、特异性扩增核酸片段的锚定多重PCR方法,可根据不同实验目的,快速制备出不同Mr标准大小的核酸片段,进一步拓展了PCR技术的应用范围。     

聚合酶链反应检测嗜肺军团菌的实验研究

 目的探讨并建立聚合酶链反应(PCR)用于检测嗜肺军团菌的方法.方法用PCR方法扩增嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强子基因(mip)片段,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物;分析其特异性和敏感性.结果在嗜肺军团菌14个血清型参考株均扩增出特异的340bp片段,而三株非嗜肺军团菌及其他需鉴别诊断的常见病原菌均未扩增出此特异条带.检测灵敏度为2.6 pg/ul基因组DNA.结论依据mip基因建立的嗜肺军团菌PCR检测方法具有高度的敏感性和特异性,是诊断与鉴别诊断嗜肺军团菌感染的一种有效手段.     

免疫酶斑点法检测HIV－1DNA

多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)在艾滋病毒感染的诊断、检测中起着重要的作用[1]。为了确认PCR扩增的片段,常采用放射性标记的核酸探针对扩增产物进行Sorthern杂交。近年来采用生物素、地高辛等非放射性标记物的技术得到了广泛应用[2]。本文介绍了用生物素标记HIV-1DNA的扩增产物,然后用免疫酶斑点法(immunoenzyme dot assay,IEDA)直接检测扩增产物的方法。     

多聚酶链式反应在血液病诊断与监测中的应用

多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术由美国Cetus公司Mullis等于1985年建立.它是一种在体外将特异性DNA序列进行高效扩增的方法.不仅被广泛用于遗传性疾病及其产前诊断、感染性疾病病原的检测,而且用于各种类型肿瘤基因的研究.PCR作为一个“无细胞基因扩增系统”,其基础理论及应用研究主要用于从基因组DNA中产生大量特异DNA片段用于序列分析或分子克隆.从已知两端序列的双链DNA中产生特异性片段作为分子探针.通过选择性扩增cDNA的特殊片段进行cDNA克隆、产生尚未克隆基因的     

中长跑运动员胃肠菌群区系结构分布特征的微生态研究

目的:应用分子生物学的实验方法和技术研究中长跑运动员胃肠菌群区系结构分布特征.方法:直接从运动员粪便样品中提取细菌总DNA,并以此为模板进行PCR扩增,得到不同运动个体胃肠细菌基因指纹图;然后将1名运动员的PCR产物用地高辛标记为探针,与其余6名运动个体的胃肠细菌指纹图进行核酸印迹杂交;最后对目的基因片段进行克隆和测序.结果:(1)不同运动个体胃肠菌群中既存在共有菌群,又存在个体特征菌群;(2)普遍存在于运动员胃肠道中的某种特征菌群,在基因库中无与其同源的序列,可能是一种尚未被报道的新型菌群.     

3种基于PCR的荧光标记方法的比较研究

目的：荧光标记物是目前杂交型基因芯片所检测的主要目标底物，本实验比较了3种基于PCR的荧光标记方法在基因芯片检测中的应用效果。方法：荧光分子标记的引物或荧光分子修饰的核苷酸可以在PCR反应中通过Taq，Pfu等DNA聚合酶掺入到PCR产物中，在此过程中，荧光分子又可以通过不同的方法掺入到PCR产物中。方法1：直接将荧光分子化学合成在引物的5’端；方法2：在PCR反应体系中加入荧光分子修饰的核苷酸单体，由DNA聚合酶将其掺入PCR产物中；方法3：对PCR产物通过非模板依赖性的酶促加尾反应在其3’端随机加入荧光修饰的核苷酸。本实验优化了3种荧光标记方法，并以检测CYP3A4基因外显子5中4个核苷酸位点的探针微阵列为例，比较了检测效果。结果：在各自优化的实验条件下，从扩增、标记效率以及芯片杂交的信号强度、背景、分辨率等方面进行比较，3种方法得到的荧光标记样品无明显区别，但后两种方法操作过程复杂，使用成本高，对反应条件苛刻。结论：3种基于PCR扩增的荧光标记方法均可以提供优质的荧光标记探针或样品(底物)，在实际应用中，各自有不同的特点及适用范围。     

小鼠骨髓组织4种造血生长因子受体cDNA片段的克隆和序列测定

目的：探索大剂量照射后造血生长因子受体基因的表达规律。方法：应用逆转录PCR技术，从小鼠骨髓造血组织中扩增出造血生长因子受体的目的片段，PCR产物与克隆载体连续后转化感受态大肠杆菌，阳性菌落提取质粒后进行序列测定。结果：4种造血生长因子受体片段均扩增成功，PCR产物经测序证实。结论：粒细胞集落刺激因子受体（G－CSFR），促红细胞生长素受体（EPOR）、促血小板生成素受体（c-mpl)和干细胞因子受体（c-kit)cDNA片段的克隆成功，从为整体水平上研究照射后造血生长因子受体的表达规律打下了基础。     

应用抑制性消减杂交技术筛选膦甲酸钠免疫调节基因

目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建膦甲酸钠(PFA)处理的人T淋巴细胞Jurkat差异表达基因的cDNA消减文库,筛选并克隆PFA免疫调节相关基因,阐明PFA免疫调节的分子生物学机制。方法 以PFA处理Jurkat细胞,同时以生理盐水处理的相同细胞作为对照;24h后制备细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa1酶切后,将实验组cDNA分成两组．分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性多聚酶链反应(PCR)扩增,将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 成功构建了PFA处理淋巴细胞差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到46个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000bp插入片段。挑取含有插入片段的14个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得11种已知基因序列和3个未知基因。结论 应用SSH技术成功构建了PFA处理的淋巴细胞差异表达基因的cDNA消减文库,为进一步阐明PFA的免疫调节机制及深入了解PFA防治病毒性肝炎的药理作用机制提供了依据。