血卟啉单甲醚-光动力学疗法治疗角膜新生血管的实验研究

目的：观察血卟啉单甲醚行光动力学疗法（photodynamic treatment，PDT）治疗角膜新生血管的疗效。材料与方法：碱烧伤有色兔角膜制作角膜新生血管模型。静脉注射血卟啉单甲醚5mg／kg，不同的能量密度（7．6～152．8J／cm^2）的氩绿激光照射角膜新生血管根部，不注射血卟啉单甲醚仅行同等能量密度的激光照射作为对照组，行角膜新生血管造影观察新生血管封闭情况。     

血卟啉单甲醚-光动力学疗法对兔移植静脉再狭窄的抑制作用

目的探讨局部灌注血卟啉单甲醚(HMME)结合血管外激光照射的方法对移植静脉吻合口处内膜增生的抑制作用。方法采用兔颈外静脉颈总动脉移植模型，将实验动物随机分为光动力学治疗组、单纯激光照射组、单纯光敏剂灌注组、空白对照组，每组4只兔。光动力学治疗组局部应用血卟啉单甲醚HMME(15／μg／ml)溶液充盈在移植静脉段，再以532nm波长半导体激光器在吻合口(每只兔2处吻合口)附近进行血管外照射5min，功率密度100mW／cm^2，能量密度30J／cm^2；单纯激光照射组以生理盐水充盈移植静脉段，再用激光照射；单纯光敏剂灌注组仅用HMME(15μg／ml)溶液充盈移植静脉段5min；空白对照组应用生理盐水充盈移植静脉段5min.术后第4周于各实验组移植静脉的动静脉连接都及其两侧0.5cm处的动脉端、静脉端取材，常规石蜡包埋切片HE染色，组织病理观察，采用IMAGE-Pro Plus生物医学图像分析系统，观察不同处理组内膜增生程度的差异。     

钙在血卟啉单甲醚-光动力学疗法处理后HeLa细胞中的变化及作用

目的 了解钙离子在血卟啉单甲醚-光动力学疗法(HMME-PDT)处理后HeLa细胞中的变化和作用。方法 Fura-2／AM孵育荧光分光光度计检测细胞质游离钙浓度[Ca^2 】i的变化，MTT法分析PDT及钙离子对HeLa细胞存活率的影响，Western印迹法分析HMME-PDT后HeLa细胞的肌浆／内质网钙泵(SERCA2)蛋白的降解情况。结果 HMME-PDT处理后即刻HeLa细胞内【Ca^2 】i就开始增高，且与PDT剂量成正相关用，BAPTA／AM拮抗【Ca^2 】i的升高可增加HeLa细胞的存活率。同时HMME-PDT可引起SERCA2蛋白的降解。结论 HMME-PDT处理后HeLa细胞内【Ca^2 】i可迅速增高，【Ca^2 】i，升高可能与SERCA2蛋白的降解相关，并可促进HeLa细胞的死亡。     

血卟啉单甲醚光动力学疗法对体外培养的人角质形成细胞增生的影响

目的观察人角质形成细胞株Hacat对血卟啉单甲醚(hematoporphyrinmonomethylether,HMME)的吸收特性及HMME-PDT对角质形成细胞增生的影响。方法对数生长期的Hacat细胞分别与浓度为0、10、20和40μg/ml的HMME孵育1h;同时将另一实验组的Hacat细胞与10μg/ml的HMME分别孵育0和30min、1和2h,分别以流式细胞仪检测孵育时间和孵育浓度对Hacat细胞吸收HMME的影响;在此基础上,将Hacat细胞分别与0、2·5、5、10、20和40μg/ml的HMME孵育2h,用532nm的倍频Nd∶YAG激光以20mW/cm2的功率密度分别照射0、2·5、5、10、20min,同时设立完全空白对照组和单纯光敏剂组,24h后以MTT法检测Hacat细胞的存活率。结果Hacat细胞对HMME吸收量随着孵育浓度的增高和孵育时间的增加而增多。单独照光或以高达40μg/ml的HMME孵育对Hacat无明显杀伤(P>0·05)。在激光功率密度相同的情况下,HMME-PDT对Hacat细胞的杀伤呈孵育浓度和激光能量密度相关性。结论Hacat细胞对HMME吸收呈孵育浓度和孵育时间相关性,孵育浓度及激光能量密度是影响HMME-PDT杀伤效应非常重要的影响因素,在实验范围内的HMME-PDT能对Hacat细胞产生明显的杀伤作用。     

血卟啉单甲醚光动力学疗法对体外培养的人角质形成细胞增殖的影响

目的：观察人角质形成细胞株Hacat对血卟啉单甲醚（hematoporphyrin monomethyl ether，HMME）的吸收特性及HMME-PDT对角质形成细胞增殖的影响，为HMME-PDT用于临床银屑病的治疗提供初步的实验依据。     

线粒体在血卟啉单甲醚-PDT诱导HeLa细胞凋亡中的作用

目的探讨线粒体在血卟啉单甲醚(HMME)-PDT诱导HeLa细胞凋亡中的作用。方法膜联蛋白(annexin)V-PI双染法检测HMME-PDT处理后6hHeLa细胞的凋亡率和坏死率。Rh123染色法检测PDT后2h内HeLa细胞的线粒体膜电位(△Ψm)变化。Western杂交法检测PDT后6h内细胞质内细胞色素C(CytC)的含量变化。结果HMME-PDT后6hHeLa细胞的凋亡率和坏死率分别为11.48%±3.42%和17.68%±1.05%。PDT后2h内△Ψm无显著改变。PDT后即刻(0h)细胞质内未检测到CytC,而在PDT后2、4和6h均可检测到CytC,且含量有增高的趋势。结论线粒体内的CytC转位于细胞质,是HMME-PDT导致HeLa细胞凋亡的机制之一。     

血卟啉单甲醚-PDT对骨髓基质细胞及K562白血病细胞杀伤效应的初步研究

目的:对比研究血卟啉单甲醚(HMME)-PDT对骨髓基质细胞及白血病K562细胞的杀伤效应。材料与方法:实验选用白血病K562细胞株及原代培养骨髓基质细胞,光敏剂为血卟啉单甲醚(HMME),KTP激光(532nm)作为照射光源,MTT法检测细胞杀伤效应。结果:在照光剂量为10J/cm2、HMME浓度为10μg/m     

血卟啉单甲醚光动力学疗法对小鼠接触性超敏反应的抑制效应

目的 探讨血卟啉单甲醚光动力学疗法(hematoporphyrin monomethyl ether mediated photodynamic therapy,HMME-PDT)对小鼠接触性超敏反应(contact hypersensitivity,CHS)的影响.方法 雌性BALB/c小鼠按功率密度分为50和100mW/cm2两个实验组,同时设置单纯照光组、单纯光敏剂组、空白对照组以及DNFB组.PDT处理后3 d,各实验组分别以2,4-二硝基氟苯(DNFB)诱发小鼠右耳变应性接触性皮炎,以游标卡尺测量发敏前后右耳的厚度差;对于功率密度为50 mW/cm2组,进一步观察了PDT处理前4 d或PDT处理后1、3和12 d,DNFB发敏前后小鼠右耳的厚度差,并对PDT后3 d组行组织学检查,以目镜网格测微尺计算浸润炎症细胞数量.结果 处理前4d预先以DNFB致敏,PDT对CHS无抑制作用(P＞0.05).反之,PDT照射后1、3或12 d再以DNFB致敏,则PDT能对CHS产生显著抑制作用(P＜0.01),其抑制率分别为58%,63%,47%.且无论是以50mW/cm2还是以100mW/cm2功率密度的激光照射,这种抑制作用均存在.未经任何干预,DNFB致敏组致敏右耳浸润的单核细胞和中性粒细胞的数量增加,而经PDT处理后,浸润的炎性细胞明显减少,二者之间存在显著性差异(P＜0.01).结论 HMME-PDT能对正常小鼠接触性超敏反应产生明显抑制作用,并有短暂持续效应.     

光动力治癌新药血卟啉单甲醚（HMME）的研究

本文报道了一种单体卟啉血卟啉单甲醚的合成及其光敏化力、人癌细胞光灭活作用、动物移植瘤光动力疗效和有关的临床前药理毒理学研究资料。实验结果表明,与临床应用的混合卟啉制剂血卟啉衍生物(HpD)相比,HMME具有光敏化力强、肿瘤选择性摄入率高、光动力效应强、毒性低、无致突变和致畸胎作用等优点,是一种较理想的光动力治癌新药。     

光动力学疗法治疗恶性黑素瘤的动物实验研究

目的:在黑素瘤动物模型上观察二氢卟吩e6(Ce6)和5-氨基酮戊酸(5-ALA)的光动力学治疗作用。方法:将培养的人恶性黑素瘤细胞株接种至裸鼠腹部皮下,接种细胞数为2×106个/只,接种后1周开始PDT实验。荷瘤裸鼠随机分为4组,每组6只。对照组:不给予光敏剂处理,只进行激光照射;5-ALA-PD     

血卟啉单甲醚-光动力学疗法治疗实验性脉络膜新生血管

目的 观察光敏剂血卟啉单甲醚-630 nm半导体激光器光动力学疗法对实验性脉络膜新生血管的疗效及影响疗效的因素.方法 BN大鼠共21只,随机分为空白对照组?和PDT治疗组(T1～T6).氪激光光凝诱导BN大鼠建立脉络膜新生血管动物模型后14～21d,T1～13组大鼠股静脉注射血卟啉单甲醚15 mr/ks后20 min,分别以400、600、1 000 mW/cm2功率密度,波长630 nm半导体激光照射90s,即能最密度36、54、90 J/cm2;T4～T6组大鼠在给予血卟啉单甲醚30mg/kg后,以波长630 nm半导体激光分别照射60、90、150 s,即能量密度分别为36、54、90 J/cm2.眼底光斑直径皆为800～1 000μm.治疗后24 h、7 d行荧光素眼底血管造影检查和组织病理学检查,治疗后7 d行脉络膜平片的免疫组化检查.结果 荧光素眼底血管造影显示各治疗参数的CNV闭合率不同,随能量密度的增加和光敏剂剂量的增加而提高.T1、T2、T3组PDT后第24小时CNV闭合率分别为39.1%、65.2%、87.5%,PDT后第7天闭合率分别为O%、5.6%、45.5%.T4、T5、T6组PDT后第24小时CNV闭合率分别为56.5%、78.3%、90.9%,PDT后第7天闭合率分别为25.0%、68.8%、93.3%.PDT后第24小时除T1组外,其余各组均可见不同程度的CNV和脉络膜毛细血管闭合及血栓形成;T2组视网膜毛细m管和脉络膜大血管未闭合;T4、T5组部分视网膜毛细血管有附壁红细胞聚集未堵塞管腔;T3、T6组视网膜毛细血管、CNV、脉络膜毛细血管及大部分脉络膜大血管闭合.PDT后第7天各组闭塞的视网膜血管和脉络膜大血管未见完全开放.脉络膜平片的免疫组化分析显示对形成血管腔和未形成血管腔的内皮细胞均有特异性表达,用方差分析统计方法结果显示C组与T1～T6组问差异有统计意义(P<0.01).结论 血卟啉单甲醚—光动力学疗法治疗实验性脉络膜新生血管疗效确切.     

血卟啉单甲醚在生理盐水溶液中光漂白的研究

目的观察在光动力学反应过程中血卟啉单甲醚(HMME)的光漂白现象,探讨其影响因素。方法通过本研究建立的光敏剂荧光分析系统,应用光学多通道分析仪对生理盐水溶液中HMME介导的光动力反应过程中光漂白的情况进行监测。HMME的浓度分别为1、10μg/ml。Nd∶YAG倍频532nm激光作为光动力的照射光源,同时利用其作为荧光激发光源。在光动力反应过程中采集溶液的荧光光谱,并进行分析处理。结果光敏剂HMME在一定的浓度范围内,初始浓度越高,光漂白的速率越快。在HMME的光漂白过程中于639nm处出现新的荧光峰。根据漂白造成的自体背景的变化,HMME的光漂白可以分为两个阶段:(1)在0～45min阶段,随着照光过程的持续,HMME在613nm与674nm处的荧光特征峰强度下降,同时在639nm处出现新的荧光峰,且其强度持续增强,自体背景强度起伏很小,稳定在HMME初始荧光强度的0.16倍左右;(2)而45～90min阶段,随着照光时间延长,在613、674和639nm处荧光峰的强度均下降,自体背景强度呈接近于线性持续增强,到照光结束时增至HMME初始荧光强度的约0.45倍。结论HMME的光漂白是一个较复杂的过程,初始浓度影响其漂白的速度,并伴有光漂白产物的生成及其再漂白的现象。     

角膜新生血管光动力学疗法的实验研究

目的研究角膜新生血管的治疗方法,观察不同浓度的光敏剂血卟啉单甲醚(hematoporphyrinmonomethylether,HMME)所介导的光动力作用对兔角膜新生血管的影响,为探讨光动力学疗法治疗角膜新生血管的可行性和有效性提供初步的实验依据。方法采用角膜缝线的方法,诱导18只荷兰大耳白兔36只眼角膜新生血管形成。缝线后的第7天,将18只兔随机分成9组,将不同浓度的HMME分别注射于兔眼球结膜下,30min后用波长为632.8min的He-Ne激光照射不同的时间(即能量密度不同),观察每眼角膜新生血管损伤情况及角膜组织病理学改变。结果在HMME浓度为7.5mg/ml时,激光功率密度为30mW/cm2,能量密度为108,(?)m2,照射时间60min,兔角膜新生血管密度减低率(67.97±2.20)%,不但高于激光照射时间分别为15、30和45min,能量密度分别为27.54和81J/cm2时的新生血管密度减低率,其统计学差异有显著意义(P=0.001,P=0.002,P=0.031),而且高于HMME浓度为2.5mg/ml和5mg/ml2时的角膜新生血管的减低率,其统计学差异有显著意义(P<0.01,P<0.01);而HMME浓度为10m/ml时,睑球结膜损伤较大,不宜用于治疗眼部。PDT后组织病理学检查,电镜下见新生血管内皮细胞变性;HE染色角膜标本光镜下见新牛血管退缩。结论采用结膜下注射HMME,并用波长为632.8nm的He-Ne激光照射,     

不同活性氧成分在血卟啉单甲醚-PDT诱导HeLa细胞死亡中的作用

目的探讨不同活性氧成分在血卟啉单甲醚(HMME)-PDT诱导HeLa细胞死亡中的作用。方法将接种人宫颈癌HeLa细胞的培养皿随机分成单纯HMME-PDT组、HMME-PDT加叠氮钠(单线态氧淬灭剂)与HMME-PDT加甘露醇(羟自由基淬灭剂)组。以功率密度为15mW/cm2,能量密度为5.4J/cm2、波长为510.6mm的激光照射。用膜联蛋白(annexin)V-碘化丙啶(PI)双染法检测激光照射后第6和24h三组中HeLa细胞的凋亡率和坏死率。结果PDT后第6小时,单纯HMME-PDT组和HMME-PDT加入叠氮钠组的坏死率17.68%±1.05%和4.15%±2.19%(P=0.0006),单纯HMME-PDT组和HMME-PDT加D-甘露醇组的HeLa细胞凋亡率分别为11.48%±3.42%和3.19%±1.01%(P=0.0158)。PDT后第24小时,单纯HMME-PDT组的HeLa细胞凋亡率和坏死率分别为48.51%±2.85%和19.26%±1.57%,加入叠氮钠组为40.45%±3.56%和13.12%±2.75%,加入D-甘露醇组为39.43%±4.37%和21.00%±4.31%。结论HMME-PDT产生的单线态氧以导致HeLa细胞坏死为主,而羟自由基则以导致细胞凋亡为主。     

血卟啉单甲醚在血管内皮细胞和角质形成细胞的亚细胞定位及光动力治疗作用点

目的探讨血卟啉单甲醚（hematoporphyrin monomethyl ether,HMME）在血管内皮细胞系ECV304和角质形成细胞系HaCaT的亚细胞定位及光动力疗法的作用点。方法 HMME与ECV304和HaCaT分别孵育1和18 h,选择特异性细胞器荧光探针分别标记线粒体、核膜、细胞膜和过氧化物酶体,应用共聚焦显微镜观察孵育1和18 h时HMME与细胞器的结合率;HMME与ECV304和HaCaT分别孵育20 h,细胞器荧光探针选择同前,给予532 nm连续激光照射,分别在照光前后采集上述细胞器中HMME的荧光强度,比较照光前后HMME的漂白率。结果 HMME与细胞器的结合率结果示,ECV304孵育1 h时线粒体、核膜、细胞膜、过氧化物酶体HMME的结合率分别为1.18±0.18、0.72±0.21、0.95±0.24、0.68±0.15,孵育18 h时上述4种细胞器HMME的结合率分别为1.35±0.13、0.83±0.11、0.73±0.13、0.91±0.15;HaCaT1 h组孵育1 h时上述4种细胞器HMME的结合率分别为1.09±0.12、0.66±0.20、0.92±0.24、0.77±0.16,孵育18 h时上述4种细胞器HMME的结合率1.13±0.13、0.86±0.12、0.72±0.14、1.1±0.20。HMME在线粒体、核膜、细胞膜、过氧化物酶体的漂白率结果显示,ECV304分别为（18.22±3.53）%、（10.77±2.06）%、（7.44±1.06）%、（8.56±3.51）%,HaCaT分别为（11.90±1.46）%、（5.02±1.48）%、（3.82±0.54）%、（8.90±2.30）%。结论 ECV304中HMME主要定位于线粒体,HaCaT定位于的线粒体和过氧化物酶体;ECV304光动力疗法的主要作用点可能为线粒体,而HaCaT的主要作用点为线粒体和过氧化物酶体。     

瘢痕成纤维细胞对血卟啉单甲醚的吸收特性及其光动力效应

目的探讨增生性瘢痕成纤维细胞（HSF）对光敏剂血卟啉单甲醚（HMME）的吸收特性和光动力疗法（PDT）的杀伤效应。方法取原代培养的HSF,经流式细胞仪（FCM）检测HMME浓度（0～40μg/ml）和孵育时间（0～120 min）对HSF细胞吸收HMME的影响;MTT法检测HMME-PDT对HSF细胞存活率的影响。结果在一定HMME浓度范围内（0～40μg/ml）,HSF细胞对HMME的吸收量随HMME浓度和孵育时间的增加而增大。实验范围内的HMME-PDT对HSF细胞的杀伤效应与HMME浓度和激光能量密度正相关。结论 HSF对HMME的吸收随HMME浓度和孵育时间的增加而增大,HMME-PDT处理HSF时,光敏剂HMME浓度和激光能量密度是影响细胞存活率的重要因素。     

光动力药物血卟啉单甲醚HPLC-荧光检测法的建立及其药代动力学研究

目的建立测定血浆中血卟啉单甲醚(HMME)的HPLC-荧光检测法,并用以进行HMME在犬体内的药代动力学研究。方法血浆中的HMME采用乙酸乙酯液-液萃取,荧光素为内标。选用C18柱(4·6mm×150mm,5μm),0·02mol/L醋酸钠(用冰醋酸调pH6·0)-四氢呋喃(60∶40)组成为流动相,荧光检测器激发波长为395nm,发射波长为613nm。结果HMME血药浓度的范围为0·025~5·000μg/mL,采用两条标准曲线定量的方法,两条标准曲线的线性范围分别为:0·025~0·500μg/ml(r=0·9973)和0·25~5·00μg/ml(r=0·9999),提取回收率92·1%~99·2%,日内、日间RSD分别为3·3%~8·4%和3·8%~8·5%。静脉给药后,HMME在犬体内的药代动力学符合开放二房室模型。其主要药代动力学参数:T1/2α(分布半衰期)=(0·18±0·16)h,T1/2β(消除半衰期)=(14·24±3·41)h,Vd(中央室表观分布容积)=(6·37±3·70)L/g,CL(清除率)=(0·31±0·17)L·kg-1·L-1,AUC(0-tn)(血药浓度-时间曲线下面积)=(27·40±11·72)mg·h-1L·-1。结论HPLC-荧光检测法准确、灵敏,适用于HMME药代动力学研究。HMME在犬体内的药代动力学过程符合开放二室模型,其在犬体内可以迅速消除,可很好地消除光动力学疗法的主要副作用———正常组织的持久光毒反应。     

血卟啉甲醚-PDT诱导C6胶质瘤细胞凋亡机制的研究

目的探讨血卟啉甲醚-光动力学疗法（PDT）诱导C6胶质瘤细胞的凋亡机制。 方法常规传代培养C6胶质瘤细胞系,取处于对数生长期细胞按实验要求分组接种于96孔培养板上,应用光敏剂血卟啉甲醚,以不同照光剂量（40、80、120、160、200、240、280和320J/cm^2）处理C6胶质瘤细胞。MTT法检测不同照光剂量的细胞死亡率;电镜观察PDT后C6细胞形态学变化;以Fluo-3/AM为细胞内钙离子荧光指示剂,激光共聚焦显微镜测定不同照光剂量作用后C6胶质瘤细胞内[Ca^2＋]i。 结果PDT组对C6胶质瘤细胞死亡率影响显著,照光剂量与细胞死亡率正相关,随照光剂量增加,细胞死亡率逐渐增大,当达到能量密度大于200J/cm^2时,细胞死亡率不再明显增加。PDT作用后早期出现一定数量凋亡的C6胶质瘤细胞和多数线粒体、内质网等亚细胞结构肿胀。PDT作用晚期可见大量坏死细胞和部分凋亡细胞。PDT作用后C6胶质瘤细胞内游离钙明显升高。 结论血卟啉甲醚-PDT诱导C6胶质瘤细胞坏死和凋亡,钙超载在广泛超微结构损伤中起重要作用。     

光动力学疗法对人乳癌MDA-MB-231细胞系杀伤的体外实验研究

目的：探讨光动力学疗法（PDT）对体外培养的人乳腺癌MDA-MB-231细胞系的杀伤效应。方法：以人乳癌MDA-MB-231细胞系作为研究对象，以血卟啉衍生物（HpD）为光敏剂，以激光为光源，采用连续照射的方式，将经不同浓度HpD处理的MDA-MB-231细胞，照射不同剂量的激光，用MTF法测定OD492值，并绘制MDA-MB-231细胞PDT处理后的生长曲线，用光镜电镜观察PDT后不同时间MDA-MB-231细胞的形态变化。     

体外超声激活血卟啉单甲醚抗C6胶质瘤细胞的研究

目的 研究超声激活血卟啉单甲醚(HMME),对C6胶质瘤细胞的生物效应,为声动力疗法(sonodynamic therapy,SDT)治疗脑胶质瘤奠定实验基础. 方法实验分为SDT组(超声 HMME组)、超声组、HMME组及仅加入肿瘤细胞的对照组.HMME终浓度为10 μg/ml,SDT组、超声组进行超声照射(频率:1.0 mHz,声强度:0.5 W/cm2,时间:120 s)处理.采用噻唑蓝比色分析法(MTT法)观察SDT处理后6、12、24、48和72 h的抑瘤率;流式细胞学检测SDT处理后6 h C6细胞凋亡率及细胞周期百分比.结果 SDT组抑瘤率显著增高;超声组也有一定的抑瘤率;HMME组抑瘤率与对照组无明显差别.SDT后凋亡率升高,G0/G1期、G2/M期百分比降低,S期百分比升高、凋亡增殖比(APR)升高.结论 SDT能显著杀伤C6胶质瘤细胞,并诱导其凋亡,使细胞阻滞于S期→G2期.