结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达与纯化

目的构建结核分枝杆菌esat-6基因原核表达载体,使其在大肠杆菌中表达融合重组蛋白,并纯化。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建pGEX-esat-6重组质粒,将其转化入大肠杆菌JM109;PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法纯化融合蛋白。结果PCR扩增出esat-6 288bp的基因,克隆到pMD18-T载体中,经测序与GenBank中序列一致;随后亚克隆到表达载体pGEX-4T-2构建重组表达质粒,在JM109中表达了ESAT-6融合蛋白,表达的蛋白能被GST免疫血清识别;通过亲和层析纯化获得的蛋白能被结核病人血清识别。结论成功构建esat-6重组表达质粒,该质粒在JM109中表达ESAT-6融合蛋白,并获得较纯的蛋白。     

hsp70/CD80嵌合DNA真核表达质粒的构建及鉴定

我们将结核分支杆菌ｈｓｐ70和人ＣＤ80的编码基因进行连接重组 ,构建成ｈｓｐ70 /ＣＤ80嵌合ＤＮＡ真核表达质粒 ,为进一步研究其免疫保护效果及制备结核病ｈｓｐ70 /ＣＤ80嵌合ＤＮＡ疫苗奠定了基础 ,可望通过基因免疫获得免疫原性强、以低剂量即可有效刺激机体产生Ｔ细胞和Ｂ细胞应答、安全可靠的新型结核病疫苗。材料与方法　ＤＮＡ提取试剂盒购自上海华舜公司 ,连接试剂盒为大连宝生物公司产品。寡核苷酸引物由上海生工公司合成 ,Ｐ1:5′ＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＣＴＣＧＴＧＣＧＧＴＣＧＧＧＡＴＣ 3′(含ＨｉｎｄⅢ位点和起始密码ＡＴＧ…     

结核分支杆菌重组ESAT6蛋白抗原诱发豚鼠迟发型超敏反应的研究

结核菌素纯蛋白衍生物 (ＰＰＤ)含多种蛋白成分 ,与多种分支杆菌存在交叉 ,尤其在鉴别结核分支杆菌感染和卡介苗接种阳转者上有一定的困难。所以ＰＰＤ作为结核病诊断试剂有其局限性。现已发现结核分支杆菌Ａｇ85、ＭＰＴ6 4、380 0 0、ＭＰＴ6 3、ＥＳＡＴ6等抗原 ,均能诱发豚鼠发生迟发性超敏反应 (ＤＴＨ)。具有高特异性的新的诊断试剂或许就存在它们或它们的组合中。ＥＳＡＴ6蛋白是结核分支杆菌生长中的一种小相对分子质量分泌蛋白 ,它能诱发结核分支杆菌感染的豚鼠发生很强的ＤＴＨ反应 ,大部分ＢＣＧ在减毒过程中丢失了编码该蛋白的…     

几种结核分支杆菌重组蛋白诱发豚鼠迟发型超敏反应的研究

目的：了解结核分支杆菌重组抗原ESAT6（E）、MPT64（M）、Ag85A(A)及两两混合物诱发豚鼠产生迟发型超敏（DTH）反应的能力。方法：常规皮肤实验法：灭活H37Rv全菌体致敏豚鼠，皮肤试验以生理盐水为阴性对照，5U PPD标准品为阳性对照，0．8μgE、0.8μgM、0.8μgA、0.4μgA 0.4μgM、0.4μgA 0.4μgE、0.4μgE 0.4μgM分别于背部皮内注射，注射后24、48、72h分别测量硬结反应横、纵直径（mm），取二者的平均值。皮肤试验轮圈法：生理盐水、5U PPD及0．8μgE、0.8μgM、0.8μgA、0.4μgA 0.4μgM、0.4μgA 0.4μgE、0.4μgE 0.4μgM，以轮圈法注射于同一只豚鼠背部两侧，每批6只，共3批。注射后24、48、72h分别测量硬结反应横、纵直径（mm），取二者的平均值。结果：常规皮肤试验0．8μgM、A、M＋E及E＋A诱发豚鼠DTH的平均直径与PPD相比无显著性差异（P＞0．05），而0．8μgE抗原及M＋A诱发豚鼠DTH的平均直径与PPD相比有显著性差异（P＜0．05）。时间效应：重组抗原及其混合物诱发豚鼠DTH的平均直径24h平均直径显著高于48h平均直径（P＜0．05），24h测量效果较好。轮圈法皮肤试验排除个体差异后，结果与常规皮肤试验结果一致。结论：从试验结果看，重组ESAT6抗原及MTP64与Ag85A混合物诱发豚鼠DTH反应强于PPD。     

结核分枝杆菌ESAT-6抗原真核表达质粒的构建及其免疫原性

目的构建结核分枝杆菌抗原ESAT-6的真核表达质粒,并研究其免疫原性.方法采用聚合酶链反应（PCR）方法自结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增esat-6基因片段,定向亚克隆入真核表达载体pVAC,构建pVAC-esat-6重组质粒;利用脂质体介导的转染技术,将其导入Vero E6细胞,RT-PCR法检测mRNA表达情况,Western-blot法鉴定表达产物;重组质粒经基因枪免疫小鼠后,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠血清抗ESAT-6特异性抗体以及小鼠脾淋巴细胞培养上清液干扰素-γ（IFN-γ）含量.结果成功构建了真核表达重组质粒pVAC-esat-6,并可在VeroE6细胞中表达;重组质粒免疫小鼠3次后,抗体滴度达到了1：1600,重组质粒组（pVAC-esat-6组）小鼠脾淋巴细胞培养上清液IFN-γ水平明显高于对照组（pVAC组）（P＜0.01）.结论成功构建结核分枝杆菌抗原ESAT-6的真核表达质粒pVAC-esat-6,免疫小鼠后诱导产生了特异的体液免疫应答和细胞免疫应答.     

结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6kDa蛋白原核载体的构建及在E．coli中的高效表达

目的获得高效表达的结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6kDa蛋白（ESAT-6）。方法利用PCR方法扩增出ESAT-6基因片段,将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体pET-21b（＋）,酶切分析和序列测定鉴定出ESAT-6基因的阳性重组子,将其转化入EcoliBL21（DE3）,阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;重组蛋白经Ni-NTAHis·Bind Resins纯化。结果成功扩增出ESAT-6基因片段,构建了重组表达质粒pET-ESAT-6,SDS-PAGE显示表达产物分子量约为6kD,经亲和纯化后的ESAT-6重组蛋白纯度高,且能被结核病人血清所识别。结论利用pET原核表达系统成功的对结核分枝杆菌ESAT-6重组蛋白进行高效表达和纯化,重组蛋白具有良好的免疫活性。     

结核分支杆菌katG蛋白的高表达与纯化

目的 表达与纯化结核分支杆菌ｋａｔＧ蛋白,为深入研究异烟肼耐药机制奠定基础。方法 将含有ｋａｔＧ基因的;ｐＥＴ２４ｂ－ｋａｔＧ表达载体转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株,在异丙基硫代β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导下表达,分别对不同诱导时间的表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ以及考马斯亮蓝染色。获得稳定的高表达菌株后采用Ｘｐ;ｒｅｓｓ＾ＴＭ蛋白纯化系统对超声破菌液进行纯化。     

鼠白细胞介素3真核表达质粒的构建及鉴定

利用鼠白细胞介素3（IL－3）基因构建真核表达质粒,筛选获得的阳性克隆经限制性内切酶酶切鉴定和基因测序,证明小鼠IL－3基因正确克隆到pCDNA3真核表达载体上;将获得的真核表达质粒pCDNA3IL－3转化大肠杆菌细胞,增菌培养后大量提取pCDNA3IL－3质粒,经紫外分光光度计检测其纯度和浓度,用于小鼠抗生育DNA疫苗在免疫小鼠模型的免疫增强佐剂。     

结核分支杆菌热休克蛋白65kD在大肠杆菌中表达

目的 构建能表达结核分支杆菌热休克蛋白65KD的工程菌。方法 设计引物并PCR扩增，目的基因克隆并转化，重组子经酶切和自动测序鉴定，阳性重组子转化表达宿主菌并受化学诱导后表达重组65kd蛋白。结果 65KD蛋白编码基因约1.6kd，重组子单酶切和双酶切证明目的的基因插入载体，3个测序反应覆盖99.1%目的基因；大肠杆菌表达重组65kd蛋白。结论 大肠杆菌表达系统是一种快速、简便获得单一结核分枝杆菌抗原的途径。     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达

目的　在大肠杆菌中高效融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT 6和CFP 10 ,获得纯化的重组ESAT6 CFP10 (rCFP10 ESAT6 )融合蛋白抗原。方法 通过聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)扩增CFP10 ESAT6融合基因 ;以质粒pET 2 8a为表达载体 ,构建重组质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ;以异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达目的蛋白 ,通过SDS PAGE电泳和蛋白免疫印迹法 (Westernblotting)鉴定rCFP10 ESAT6在大肠杆菌中的表达 ,确定rCFP10 ESAT6蛋白抗原在大肠杆菌中的表达形式 ;采用ChelatingSepharoseFastFlow蛋白纯化试剂纯化重组蛋白。West ernblotting及酶联免疫吸附试验 (ELISA)分析重组蛋白的免疫原性。结果 重组质粒pET2 8a CFP10 ESAT6中目的基因测序结果与报道序列相同 ;在大肠杆菌中以可溶性形式表达 ;分子量约2 8kDa ,表达量约占菌体总蛋白的 4 6 % ,纯化后的rCFP10 ESAT6样品经SDS PAGE和激光密度扫描分析表明其纯度为 90 %左右 ,每 10 0ml培养菌可获得 16mg左右的重组蛋白 ;Western印迹结果证实重组蛋白与His·tag单克隆抗体及确诊的肺结核病患者血清发生特异免疫反应。ELISA结果分析表明 ,该重组抗原能区分肺结核患者血清及正常人血清。结论 成功地表达和纯化了结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白。该重组蛋白具有特异的免疫原性。     

结核杆菌Ag85A及ESAT-6双价抗原融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的　为结核病新型疫苗研究提供靶基因和靶抗原。方法　采用PCR扩增的方法获得结核杆菌两种免疫保护性抗原Ag85A及ESAT - 6的基因 ,将其定向克隆入真核及原核穿梭表达型载体 pBK -CMV构建含嵌合目的基因的重组质粒 ,转化大肠杆菌后用IPTG进行诱导表达 ,并通过SDS -PAGE和Western -blotting对表达蛋白进行初步分析。结果　 1)从结核杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Ag85A及ESAT - 6基因。 2 )成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达质粒 pBK - 85A -E6。 3)重组质粒 pBK - 85A -E6经IPTG诱导后能在大肠杆菌中稳定表达 38kDa的融合蛋白。 结论　成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达载体 ,并在大肠杆菌中实现了稳定表达 ,为进一步研究其在结核病基因工程疫苗研制中的应用奠定了基础。     

结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6-CFP10的融合表达及纯化

目的在原核表达系统融合表达结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT-6和培养滤液蛋白CFP10的融合蛋白(rE6C)并纯化,测定抗原性和特异性。方法用将一个柔性的氨基酸“接头”插入原核表达载体pET32c(﹢)中,构建pET32c(﹢)-linker。PCR法扩增ESAT-6、CFP10基因。将ESAT-6克隆入改建的载体pET32c(﹢)的linker前,CFP10克隆入linker后,构建E6C融合基因,转化大肠杆菌XL1-blue,抽提质粒,酶切鉴定;在大肠杆菌BL21中表达,纯化rE6C蛋白,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测其抗原性和特异性。结果重组质粒pET32c(﹢)-ESAT-6-CFP10靶基因的测序结果与预计序列完全一致。携带重组质粒的菌株经诱导产生高水平的表达产物,纯化的表达产物具备较高的纯度、抗原性和特异性。结论pET32c(﹢)-ESAT-6-CFP10质粒在BL21菌中能高效表达,rE6C融合蛋白具有良好的抗原性和特异性,有望用于结核分枝杆菌感染的临床诊断。     

结核分枝杆菌FurB基因真核表达质粒的构建及表达

目的构建结核分枝杆菌铁调控基因furB真核表达载体。方法以BamHⅠ和HindIII双酶切pQE-80L-furB获得furB基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),重组质粒酶切鉴定后以阳离子聚合物转染COS-7细胞,分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。结果构建了重组质粒pcDNA3.1(-)-furB,RT-PCR结果证明furB可在COS-7细胞中转录,用间接免疫荧光检测,显示COS-7细胞内有FurB蛋白的表达。结论成功构建了结核分枝杆菌furB基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-furB,furB基因可以在COS-7细胞中表达。     

HBV A83点变异真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

研究A83点突变的生物学意义。采用分子生物学方法，设计引入KpnⅠ和HindⅢ酶切位点的引物扩增乙型肝炎病毒（HBV）ayw亚型的PcP10标准株中的Pre-C/C片段（1814-2452），经KpnⅠ和HindⅢ双酶切后，在T4DNA连接酶的作用下连于EB病毒真核表达载体。利用定点突变技术对连接载体进行1896点的定点诱变，经错配PCR-RFLP和测序分析。确定突变的克隆，提取突变前后的质粒转染HepG2细胞。突变后在Pre-1C/C第28位氨基酸形成终止密码。HBVA83点突变真核表达载体的构建为体外研究该点突变对HBeAg表达的影响以及HBeAg阴性的乙型肝炎病毒感染的致病机理奠定基础。     

结核杆菌Mtb8.4抗原在大肠杆菌中表达的初步研究

目的构建结核杆菌低分子质量抗原Mtb8.4的原核表达质粒,并检测其在大肠杆菌中的表达。方法PCR扩增目的基因,克隆到质粒pETHisT7启动子的下游;酶切和PCR法鉴定重组子;阳性重组子转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导后,SDSPAGE电泳分析。结果重组质粒pETHisMtb8.4成功构建,含阳性重组子的菌体蛋白经SDSPAGE电泳出现一新的蛋白带,与预计相符。结论初步证明构建的大肠杆菌重组体能够表达目的蛋白,为进一步对其免疫效应的研究奠定了基础。     

牛分枝杆菌抗原MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的融合表达及相关特性分析

目的牛分枝杆菌抗原MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的融合表达及相关特性分析。方法应用PCR方法从牛分枝杆菌临床分离株基因组中扩增获得mpb70、mpb83、cfp-10和esat-6四个目的基因片段。采用重叠延伸剪接技术(splicing by overlap extension,SOE)获得融合基因cfp10-esat6和mpb83-cfp10-esat6,将mpb70和mpb83-cfp10-esat6串连于载体pUC19-Linker上,再将mpb70-mpb83-cfp10-esat6连于表达载体pET28a(+)中得到重组质粒pET70-83-C10-E6。转化BL21(DE3)感受态细胞后,经IPTG诱导获得以可溶形式表达的融合蛋白。用Ni2+亲合层析法纯化该融合蛋白。结果经ELISA验证该融合蛋白能分别与抗原蛋白MPB70、MPB83和CE(cfp10-esat6)的多抗反应,说明该融合蛋白具有四个抗原蛋白的免疫学活性。Western blot分析显示:该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生特异性反应,而与牛其它疾病的阳性血清不反应。热稳定性试验证明该融合蛋白属于热稳定性蛋白。结论融合表达了牛分枝杆菌的四种特异性抗原蛋白,该蛋白具有单个蛋白的免疫原性和稳定性,作为一种新型的诊断抗原具有良好的应用前景。     

牛分枝杆菌抗原MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的融合表达及相关特性分析

目的牛分枝杆菌抗原MPB70、MPB83、CFP-10和ESAT-6的融合表达及相关特性分析。方法应用PCR方法从牛分枝杆菌临床分离株基因组中扩增获得mpb70、mpb83、cfp-10和esat-6四个目的基因片段。采用重叠延伸剪接技术(splicing by overlapextension,SOE)获得融合基因cfp10-esat6和mpb83-cfp10-esat6,将mpb70和mpb83-cfp10-esat6串连于载体pUC19-Linker上,再将mpb70-mpb83-cfp10-esat6连于表达载体pET28a(+)中得到重组质粒pET70-83-C10-E6。转化BL21(DE3)感受态细胞后,经IPTG诱导获得以可溶形式表达的融合蛋白。用Ni2+亲合层析法纯化该融合蛋白。结果经ELISA验证该融合蛋白能分别与抗原蛋白MPB70、MPB83和CE(cfp10-esat6)的多抗反应,说明该融合蛋白具有四个抗原蛋白的免疫学活性。Westernblot分析显示:该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生特异性反应,而与牛其它疾病的阳性血清不反应。热稳定性试验证明该融合蛋白属于热稳定性蛋白。结论融合表达了牛分枝杆菌的四种特异性抗原蛋白,该蛋白具有单个蛋白的免疫原性和稳定性,作为一种新型的诊断抗原具有良好的应用前景。