microRNA21在人牙周韧带细胞成骨分化中的表达变化

目的研究微小RNA21(miR21)在人牙周韧带细胞(PDLC)成骨分化早期的表达变化,探讨其对PDLC成骨分化的作用及可能的调控机制。方法培养PDLC,免疫细胞化学染色鉴定其来源。取第3~4代细胞矿化培养7、14、21 d进行碱性磷酸酶(ALP)检测,21 d进行茜素红染色;分别培养4 h和1、3、7 d,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测miR21、靶基因萌牙2(SPRY2)和Runt相关转录因子2(RUNX2);Western blot检测磷酸化细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2、磷酸化p38、SPRY2和RUNX2。对照组为正常培养细胞。结果培养的PDLC来源于间充质,7、14、21 d的ALP活性明显增高(t7 d=2.707,P7 d=0.011;t14 d=8.189,P14 d=0.001;t21 d=3.546,P21 d=0.024),矿化诱导21 d茜素红染色可见矿化结节,具有成骨分化能力;实时荧光定量PCR结果显示,miR21在矿化诱导3、7 d表达上升,SPRY2的表达则呈下降趋势(FmiR21=14.567,PmiR21<0.05,FSPRY2=7.765,PSPRY2=0.004);Western blot结果显示,ERK-丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在矿化诱导第1天始激活,而后稳步上升(t1 d=14.378,P3 d<0.05,t3 d=6.558,P3 d=0.003,t7 d=10.685,P7 d<0.05);p38 MAPK信号通路活性在诱导4 h时被激活,而后与对照组活性无差异,在第7天时有所升高(t4 h=18.803,P4 h<0.05,t7 d=9.643,P7 d=0.001)。结论 miR21与PDLC成骨分化相关,其调控机制可能与ERK-MAPK、p38 MAPK信号通路相关;miR21可能靶向SPRY2调控ERK-MAPK信号通路活性,实验结果为进一步研究miR21的功能作用与调控机制提供理论依据。     

人牙周韧带细胞成骨分化的差异表达蛋白质组学研究

目的 获得人牙周韧带细胞诱导成骨分化通路中的调节蛋白,探讨牙周韧带细胞诱导成骨分化的分子机制.方法 应用胶内差异双向电泳结合基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱鉴定等蛋白质组学技术筛选人牙周韧带细胞诱导成骨分化的差异表达蛋白质组.结果 获得人牙周韧带细胞诱导成骨分化7 d的差异表达蛋白质图谱,确认有显著差异的蛋白质斑点61个,质谱鉴定29个蛋白质,包括细胞骨架蛋白及细胞骨架相关蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、基质合成、代谢酶和信号传导等蛋白.其中一组细胞骨架蛋白及细胞骨架相关蛋白同时发生改变,与牙周韧带细胞成骨分化早期细胞骨架重组、有丝分裂和细胞迁移等过程紧密相关.结论 建立了人牙周韧带细胞成骨分化早期的差异蛋白质组图谱,为牙周韧带细胞成骨分化的蛋白调控机制进一步研究提供了实验依据.     

牙周膜相关蛋白1在人牙周膜细胞成骨分化过程中的表达

目的 研究牙周膜相关蛋白1（PLAP-1）在人牙周膜细胞（PDLC）成骨分化过程中的表达变化,为明确PLAP-1 在牙周组织中的作用奠定基础.方法 酶消化法培养人PDLC,免疫细胞化学染色鉴定其来源和PLAP-1 的表达,茜素红染色和碱性磷酸酶（ALP）实验鉴定其成骨分化能力,定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测其成骨分化过程中,PLAP-1、Periostin、RGD-CAP、RUNX2、OCN 和OPN mRNA 表达变化,Western blot 检测PLAP-1、RUNX2 和OCN 蛋白表达变化并进行统计分析.结果 培养的人PDLC 来源于间充质;人PDLC 矿化诱导21 d 后茜素红染色阳性,矿化诱导后7、14、21 d 时ALP 活性较对照组明显增高（P ＜ 0.05）,具有成骨分化能力;PLAP-1 免疫细胞化学染色阳性;定量RT-PCR 和Western blot 结果显示,人PDLC 在mRNA 和蛋白水平均表达PLAP-1,且mRNA 表达量随人PDLC 成骨分化过程发生变化,诱导14 d上调,诱导21 d 下调,较对照组有明显差异（P ＜ 0.05）,Western blot 检测蛋白表达显示类似的表达趋势.结论 PLAP-1 在基因及蛋白水平均高表达于人PDLC,其表达量随人PDLC 成骨分化成一定模式,提示其参与调控牙周膜的功能与稳定,但其精细的调控功能还有待进一步深入研究.     

牙周韧带细胞与成骨样细胞的体外共培养

目的：探讨牙周韧带细胞(periodontal ligament cell，PDLC)和成骨样细胞的相互作用。方法：牙周韧带来源的PDLC和骨髓基质来源的成骨样细胞(osteoblast like cell，BC)进行体外套皿共培养，通过细胞增殖、蛋白质合成和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALPase)活性来分析细胞间相互作用。结果：PDLC较成骨样细胞增殖快，共培养条件对细胞增殖无显著影响；共培养对PDLC蛋白质合成没有影响，但对成骨样细胞蛋白质合成有影响；在共培养条件下，PDLC上调ALPase活性，成骨样细胞下调ALPase活性。结论：在共培养体系中，PDLC和成骨样细胞存在相互作用，两者的分化趋势受到相互诱导。     

细胞外基质磷酸化糖蛋白mRNA在人牙周韧带细胞成骨分化过程中的表达

目的 检测人牙周韧带细胞(periodontal ligament stem cell,PDLC)诱导矿化过程中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)和细胞外基质磷酸化糖蛋白(matrix extracellular phosphoglycoprotein,MEPE)mRNA的表达,探讨MEPE能否作为人牙周韧带细胞的分化标记及其功能.方法 酶消化法培养PDLC并鉴定其来源,取未诱导及矿化诱导7、14和21 d的PDLC,茜素红染色检测矿化结节的形成;免疫组织化学染色检测OCN的表达;实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测ALP、OCN和MEPE mRNA的表达变化,并对结果进行方差分析.结果 PDLC矿化诱导后茜素红染色显示钙化结节形成,免疫染色OCN表达增强;PDLC成骨诱导培养前ALP、OCN和MEPE mRNA表达系数分别为72、1.1和534.随着诱导时间延长,ALP、OCN和MEPE mRNA表达上调,诱导7 d组的表达系数分别为78、9.56和629.6,诱导14 d组的表达系数分别为290、133和638.3,诱导21 d组的表达系数分别为1108、925和2261.1.与对照组相比,各诱导组OCNmRNA的表达、诱导14 d和21 d组ALP mRNA的表达,以及诱导21 d组MEPE mRNA的表达,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 在PDLC向成牙骨质或成骨样细胞分化过程中,MEPE mRNA与ALP和OCN呈现相似的表达变化趋势,提示MEPE与PDLC成骨分化有关,有可能作为PDLC向成牙骨质或成骨样细胞分化的标志.     

EGFR在人牙龈成纤维细胞和牙周韧带细胞中表达的研究

成纤维细胞是人牙龈及牙周膜中的主要细胞类型 ,在维持牙龈组织的结构完整、牙周膜的更新、牙周组织损伤后的再生及牙周组织自身结构的稳定等方面具有重要作用。两种部位来源的成纤维细胞虽然形态相似 ,但功能上明显不同 ,目前尚无明确鉴定它们的细胞标记物。为此 ,我们研究了表皮生长因子受体 (ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ,ＥＧＦＲ)在人牙龈成纤维细胞 (ｇｉｎｇｉｖａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ,ＧＦ)和牙周韧带细胞 (ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｃｅｌｌ,ＰＤＬＣ)中的不同表达。一、材料与方…     

牙周韧带细胞体外矿化的研究——骨唾蛋白与骨桥素在矿化过程中的表达

目的：研究骨唾蛋白与骨桥素在体外培养的人牙周韧带细胞矿化过程中的表达。方法：体外培养的人牙周韧带细胞，经地塞米松矿化液诱导，分别于不同时间在相差显微镜下观察其矿化结节的形成，采用免疫细胞化学的方法观察骨唾蛋白与骨桥素的表达情况。结果：矿化培养1周细胞呈复层生长，骨桥素呈阳性染色；两周细胞密集呈结节状，骨唾蛋白与骨桥素均为阳性，胞浆染成黄褐色；3周出现矿化结节，矿化以后骨唾蛋白与骨桥素保持稳定表达。结论：牙周韧带细胞在适当的条件下可以向成骨细胞表型分化，表达矿化相关蛋白，形成矿化结节。     

牙周韧带细胞及成骨样细胞在纯钛表面附着的形态学比较

目的：从形态学上比较牙周韧带细胞及成骨样细胞在纯钛表面的附着及增殖情况。方法：在相同的培养条件下，商用纯钛表面分别接种牙周韧带细胞和成骨样细胞，采用倒置显微镜及扫描电镜进行形态学观察。结果：两种细胞在纯钛表面均附着、生长良好，7天后细胞即连接成片，并在钛片边缘存在“细胞聚集”现象，呈现复层生长。扫描电镜显示两种细胞附着早期呈“伪足”样伸展，附着后期形成大量的细胞外基质成份。两种细胞在细胞形态、“伪足”形态及钛片周边聚集形态上均存在明显差异。结论：牙周韧带细胞和成骨样细胞与纯钛均有良好的生物相容性，在体外培养过程中，呈现不同细胞形态、“伪足”形态及钛片周边聚集形态，提示两种细胞在分化过程中可能存在差异。     

镁离子对人牙周韧带细胞体外成骨能力的影响

目的:探究不同浓度Mg²⁺对hPDLCs成骨向分化的影响,为后续牙周组织再生实验选择合适的Mg²⁺注入浓度提供依据。方法:取P3-P5代hPDLCs于Mg²⁺浓度分别为0、10、15、25、35、50 mmol/L条件中常规培养,用CCK-8法检测hPDLCs增殖情况。成骨诱导后比较各组ALP活性差异及茜素红矿化结节着色情况,进行RT-qPCR检测成骨相关基因Runx2、ALP、Col1、OPN及Bglap的表达差异。采用SPSS16.0软件,运用单因素方差分析进行统计学分析。结果:10、15、25 mmol/L Mg²⁺浓度可促进细胞增殖并提高ALP活性,35、50 mmol/L Mg²⁺浓度抑制细胞增殖及ALP活性。结论:适宜浓度镁离子(0~25 mmol/L)可促进hPDLCs早期成骨分化并抑制矿化。     

低氧对人牙周膜干细胞骨向分化影响的实验研究

基因,如碱性磷酸酶、骨钙素和富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的表达,从而抑制了人牙周膜干细胞骨向分化.     

人牙周膜干细胞成骨相诱导后相关基因的表达变化

目的:对人牙周膜干细胞进行筛选纯化,骨向诱导后观察其成骨能力,并对成骨相分化过程中相关基因的表达变化进行检测。方法:用组织块联合磁珠分选法分离纯化人牙周膜干细胞,初步探讨其成骨性能,碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色观察其成骨情况,实时定量PCR检测其相关成骨基因的表达变化。利用SPSS12.0软件包对数据进行统计学分析。结果:组织块联合磁珠分选法能成功培养出高纯度的人牙周膜干细胞。体外培养中,PDLSCs具备成脂和成骨的双相分化能力。在成骨诱导过程中,FOXO1和RUNX2的表达先升高再降低,ALP和OCN的基因表达水平持续增高。结论:成骨相关基因 ALP、RUNX2、FOXO1和OCN均参与其向成骨样组织分化的过程,其表达变化具有时间规律性,与成骨过程类似。     

Leptin对人牙周膜细胞骨向分化作用的实验研究

目的探讨瘦素(leptin)对人牙周膜细胞增殖和骨向分化的作用。方法采用酶消化法体外培养人牙周膜细胞,用不同浓度梯度的leptin处理细胞,通过四唑盐(MTT)比色试验和碱性磷酸酶活性测试,检测leptin对细胞体外增殖分化的影响。将人牙周膜细胞与羟基磷灰石/磷酸三钙材料作为复合体,植入BALBc免疫缺陷裸鼠,12周后采用组织学和免疫组化法检测裸鼠体内生成物。结果体外实验leptin对人牙周膜细胞增殖有明显抑制作用,但leptin能促进人牙周膜细胞碱性磷酸酶的活性表达。体内试验中leptin可提高牙周膜细胞生成类骨质的能力。结论 leptin抑制牙周膜细胞的增殖活性,但可明显促进牙周膜细胞骨向分化。     

低强度高频振动对人牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的 研究低强度高频振动（low-magnitude high frequency vibration,LMHFV）对人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs）增殖、迁移、成骨分化能力的影响。方法 体外分离培养hPDLSCs;流式细胞术检测间充质干细胞表面标志物;加载LMHFV（加速度=0.3 g,频率=40 Hz,时间=15 min/24 h）刺激后,采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力,通过细胞划痕实验检测细胞迁移能力;通过qRT-PCR、Western免疫印迹检测成骨相关基因、蛋白表达水平,通过茜素红染色检测细胞成骨分化能力。采用SPSS 21.0软件包对数据进行统计学分析。结果 加载振动刺激后,hPDLSCs的增殖能力增强,迁移能力上升;RUNX2、ALP、Col-1、OCN的mRNA表达量和蛋白表达量均上升,茜素红染色结果与qRT-PCR、Western免疫印迹结果一致。结论 LMHFV可提高hPDLSCs的增殖、迁移能力和成骨分化能力。     

Endogenous hydrogen sulfide is involved in osteogenic differentiation in human periodontal ligament cells

ObjectiveEndogenous hydrogen sulfide (H₂S) has recently emerged as an important intracellular gaseous signaling molecule within cellular systems. Endogenous H₂S is synthesized from l-cysteine via cystathionine β-synthase and cystathionine γ-lyase and it regulates multiple signaling pathways in mammalian cells. Indeed, aberrant H₂S levels have been linked to defects in bone formation in experimental mice. The aim of this study was to examine the potential production mechanism and function of endogenous H₂S within primary human periodontal ligament cells (PDLCs).DesignPrimary human PDLCs were obtained from donor molars with volunteer permission. Immunofluorescent labeling determined expression of the H₂S synthetase enzymes. These enzymes were inhibited with D,L-propargylglycine or hydroxylamine to examine the effects of H₂S signaling upon the osteogenic differentiation of PDLCs. Gene and protein expression levels of osteogenic markers in conjunction with ALP staining and activity and alizarin red S staining of calcium deposition were used to assay the progression of osteogenesis under different treatment conditions. Cultures were exposed to Wnt3a treatment to assess downstream signaling mechanisms.ResultsIn this study, we show that H₂S is produced by human PDLCs via the cystathionine β-synthase/cystathionine γ-lyase pathway to promote their osteogenic differentiation. These levels must be carefully maintained as excessive or deficient H₂S levels temper the observed osteogenic effect by inhibiting Wnt/β-catenin signaling.ConclusionsThese results demonstrate that optimal concentrations of endogenous H₂S must be maintained within PDLCs to promote osteogenic differentiation by activating the Wnt/β-catenin signaling cascade.     

低氧对牙周膜成纤维细胞增殖和成骨分化的影响

目的:观察低氧对体外培养的人牙周膜成纤维细胞(periodontal ligament cells, PDLCs)增殖与成骨分化的影响。方法:体外培养鉴定人牙周膜成纤维细胞,分别用浓度为0、100、200、400 μmol/L的CoCl2作用于细胞,采用MTT法观察CoCl2对PDLCs增殖的影响,运用实时定量PCR和Western免疫印迹技术检测CoCl2模拟低氧对PDLCs成骨分化的影响。采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。结果:免疫组化染色结果证实,培养细胞为牙周膜成纤维细胞。200 μmol/L及400 μmol/L的CoCl2均能抑制PDLCs的增殖及碱性磷酸酶、RUNX2、Ⅰ型胶原的表达,并呈剂量依赖性。结论:氯化钴模拟的低氧环境对PDLCs增殖及成骨分化具有抑制作用。     

炎症微环境对人牙周膜成纤维细胞增殖与成骨分化的影响

目的: 观察脂多糖模拟的炎症微环境对体外培养的人牙周膜成纤维细胞（periodontal ligament cells, PDLCs）增殖与成骨分化的影响。方法: 体外培养鉴定人牙周膜成纤维细胞,分别用浓度为0、0.1、10 μg/mL脂多糖作用于细胞,采用MTT法观察脂多糖对PDLCs增殖的影响,运用实时定量PCR和Western印迹法检测脂多糖模拟的炎症微环境对PDLCs成骨分化的影响。采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 0.1 μg/mL脂多糖促进PDLCs增殖,增强成骨标志物mRNA和蛋白的表达;10 μg/mL脂多糖可抑制PDLCs的增殖及碱性磷酸酶、RUNX2、Ⅰ型胶原、骨形态发生蛋白2的表达,其结果有统计学意义。结论: 高浓度脂多糖（10 μg/mL）模拟的炎症微环境对PDLCs增殖及成骨分化有抑制作用,低浓度脂多糖（0.1 μg/mL）对PDLCs的增殖和成骨分化有促进作用。     

炎症微环境下芦丁对牙周膜干细胞成骨分化能力的影响

目的 研究芦丁（rutin）对炎症微环境下牙周膜干细胞成骨分化能力的影响。方法 采用有限稀释法分离纯化获得牙周膜干细胞,采用流式细胞术鉴定牙周膜干细胞。以脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激牙周膜干细胞,建立体外炎症模型。实验分为4组,第1组使用α-MEM培养基培养牙周膜干细胞,第2组使用含有脂多糖的α-MEM培养基培养牙周膜干细胞,第3组在含有脂多糖的α-MEM培养基加入芦丁培养牙周膜干细胞,第4组使用含有芦丁的α-MEM培养基培养牙周膜干细胞。通过碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性测试、茜素红染色、RT-PCR以及蛋白免疫印迹等方法检测成骨分化能力的改变。采用SPSS 17.0软件包对数据进行统计分析。结果 CCK-8和碱性磷酸酶活性测试结果显示,10 μmol/L芦丁对炎症状态下牙周干细胞增殖和成骨分化作用最明显。碱性磷酸酶染色和茜素红染色结果显示,10 μmol/L芦丁可以改善炎症微环境下牙周膜干细胞的成骨分化能力。RT-PCR、蛋白免疫印迹结果显示,芦丁可以增强炎症状态下COL1、ALP、RUNX2等成骨基因和成骨蛋白的表达。结论 芦丁可以增强炎症微环境下牙周膜干细胞的成骨分化能力。