大鼠脑皮质星形胶质细胞体外培养方法的改进

目的改进大鼠脑皮质星形胶质细胞体外培养方法,获得纯度较高的大鼠脑皮质星形胶质细胞。方法取出生后1d内SD大鼠大脑皮质,用机械吹打法使细胞分散制成初细胞悬液,10μm尼龙膜过滤除去成纤维细胞后接种。待7d细胞铺满瓶底后,"十"字形震荡培养液5min后传代接种。传代2次后行GFAP免疫组化染色鉴定。结果通过微孔尼龙膜过滤和传代前"十"字形震荡培养液等操作可以得到形态典型、纯度较高的星形胶质细胞。通过纯度计算可得离体培养的星形胶质细胞的纯度平均值为95.49%(n=6)。结论改进的星形胶质细胞体外培养方法,降低了实验操作难度,方法稳定有效,得到的星形胶质细胞纯度较高。     

大鼠大脑皮层星形胶质细胞的传代培养

目的：获得纯度较高的星形胶质细胞材料用于进一步实验。方法：采用大鼠神经胶质细胞的原代培养和传代培养方法。取生后24h以内Wistar大鼠脑皮层，用机械法和胰蛋白酶消化法分散细胞，制成细胞悬液，接种于无底物黏附培养瓶中，置37℃，5％CO2培养箱中培养。培养液为DMEM/F12混合培养液。待细胞铺满瓶底后传代，并对传代细胞进行形态观察、吖啶橙荧光染色和星形胶质细胞的免疫细胞化学鉴定。结果：通过传代得到了形态典型含量较高的星形胶质细胞。结论：在无底物黏附培养的条件下，星形胶质细胞在体外能够得到良好的生长，并被纯化。     

大鼠脊髓星形胶质细胞的体外培养与鉴定

目的:探讨大鼠脊髓组织星形胶质细胞体外培养、纯化和鉴定的方法。方法:于无菌条件下取新生1~2 d的SD大鼠脊髓组织,采用机械吹打及胰酶消化法制成细胞悬液,通过差速贴壁和恒温摇床震荡去除杂细胞,进行培养。用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色对所培养的细胞进行鉴定。结果:分离培养的细胞具有典型的星形胶质细胞的形态,传至第3代细胞纯度达95%以上。结论:成功建立了大鼠脊髓星形胶质细胞体外培养方法,为脊髓星形胶质细胞的实验研究奠定基础。     

大鼠脑皮质星形胶质细胞的纯化培养

目的获取纯度较高的大鼠脑皮质星形胶质细胞，用于进一步实验。方法取新生大鼠大脑，用酶消化结合机械吹打方法分离皮质细胞制成细胞悬液，差速贴壁法去除成纤维细胞，培养融合时，恒温摇床振荡法去除少突胶质细胞、小胶质细胞等，纯化后，观察星形胶质细胞生长变化规律，并通过GFAP免疫细胞化学方法鉴定星形胶质细胞。结果大鼠脑皮质细胞接种后24h全部贴壁，部分细胞已伸出突起；3～5d时细胞增殖最明显，细胞数目增加，体积增大，突起相互交织成网状；原代培养7～10d时细胞基本融合并开始分层生长。振荡纯化处理后，GFAP免疫细胞化学染色阳性细胞可达98％。结论用差速贴壁和恒温振荡方法可获得高纯度皮质源性星形胶席细胸．     

大鼠星形胶质细胞培养方法的改进

目的 改进星形胶质细胞的体外纯化培养方法,为研究星形胶质细胞的生物学功能提供实验模型.方法 采用新生 SD大鼠,无菌操作取其大脑皮质,用0.025%的胰酶吹打消化成单个细胞,替代传统的0.25%的胰酶水浴消化15 min,单个细胞悬液接种于预先包被好PDL的24孔板或25 cm2的细胞培养瓶中,体外培养9~14天至细胞完全融合并铺满瓶底后进行传代.第2代细胞应用抗GFAP的抗体进行免疫荧光染色来鉴定星形胶质细胞的纯度.结果 免疫荧光染色结果显示这种培养方法分离培养出的星形胶质细胞纯度达到90%以上.结论 采用本实验改进的方法,培养的大鼠星形胶质细胞纯度高、生长状态良好,符合体外研究要求.     

大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法改良

目的建立大鼠大脑皮层星形胶质细胞(As)的培养方法,以进一步对大脑皮层As进行体外实验研究。方法在M cCarthy方法基础上改用出生后5 d的SD大鼠的大脑皮层,制备单细胞悬液后,接种于培养瓶,培养箱中1 h后换瓶,3 d后换液,细胞融合成单层后传代,传3代后采用间接免疫荧光法监测As特异性标志胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。阳性细胞确认为As。结果体外培养的大脑皮层As经历了贴壁、去除成纤维细胞、纯化和传3代,GFAP阳性细胞达95%以上。结论大脑皮层As体外培养成功,并有较高的纯度,为进一步进行As的研究创造了条件。     

星形胶质细胞AQP9在体外损伤反应中的表达变化

目的 通过体外培养星形胶质细胞,探讨星形胶质细胞水通道蛋白-9（aquaporin-9,AQP9）对损伤反应的表达变化及其所起的作用.方法 取出生后2 d的Wistar大鼠乳鼠大脑皮层进行星形胶质细胞纯培养,随机分为对照组和损伤组,每组分为1、3、5、7 d共4个时间点,采用划伤的方法建立星形胶质细胞对损伤反应的实验模型,通过形态学观察、免疫细胞化学染色、原位杂交图像分析等方法研究星形胶质细胞对损伤的反应及AQP9的表达变化.结果 星形胶质细胞受损后,形态学上表现为胞体肥大、突起增粗,呈反应性胶质化的典型特征;胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫细胞化学染色增强;原位杂交分析表明,AQP9 mRNA表达在损伤后1 d显著增高,第3天至第5天达到高峰,与对照组相比,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 体外培养的星形胶质细胞对损伤表现为反应性胶质化、AQP9 mRNA表达增强,提示AQP9可能直接参与损伤性脑水肿的形成.     

α7-nAChR在海马星形胶质细胞上的表达

目的 探讨α7-nAChR亚基在体内、体外海马星形胶质细胞上的表达.方法 从大鼠脑中分离海马后进行冰冻切片,采用免疫荧光双染技术,首先用抗-GFAP抗体对星形胶质细胞进行鉴定,再观察α7-nAChR在星形胶质细胞上的表达.体外表达的研究在培养星形胶质细胞上进行,先分离获得新生SD大鼠的海马组织,提取并培养海马星形胶质细胞,纯化鉴定后,用配体结合实验和细胞免疫荧光双标分析α7-nAChR在星形胶质细胞上的表达.结果 海马组织中抗-GFAP染色阳性的细胞抗-α7-nAChR染色也呈阳性,但仅部分抗-α7-nAChR染色阳性的细胞抗-GFAP染色也呈阳性.体外纯化后的星形胶质细胞既能与FITC标记的α-BTX结合,荧光染色呈阳性,同时,细胞免疫荧光双标分析显示星形胶质细胞抗-GFAP和抗-α7-nAChR染色均呈阳性.结论 α7-nAChR在体内体外星形胶质细胞上均能正常表达.     

体外原代星形胶质细胞分离培养方法的优化

目的：通过对国内外原代培养星形胶质细胞的不同方法的比较运用,旨在优化现有的星形胶质细胞（AS）分离培养方法,建立稳定,高产的培养模式,为进一步研究奠定基础.方法：结合自有实验室条件采用优化的胰蛋白酶消化组织块分离培养法获取AS,进行形态学观察,绘制生长曲线,对培养的细胞进行GFAP免疫荧光鉴定.结果：体外培养的原代AS 7～10 d基本融合,胞体不规则,突起丰富如网状,生长曲线符合正常细胞生长特性;免疫荧光染色显示细胞纯度可达95％以上.结论：优化的胰蛋白酶消化组织块分离培养法对AS的培养更适宜自有实验室条件,可获得稳定纯度较高的AS,为中枢神经系统疾病相关研究提供了新的基础.     

大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法建立及鉴定

目的：纯化和鉴定体外培养的大鼠大脑皮层星形胶质细胞.方法：取1~3天新生大鼠大脑皮层细胞进行体外培养,通过差速贴壁和传代去除成纤维细胞和神经元等,采用免疫组化法检测星形胶质细胞特异性蛋白—胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）鉴定星形胶质细胞.结果：培养的细胞具有典型的星形胶质细胞形态且生长旺盛,第3代95%以上为星形胶质细胞,特异性抗原GFAP表达阳性.结论：该方法操作简单,可靠,是一种有效的新生大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法.     

大鼠海马神经元及星形胶质细胞的体外培养

目的：改进大鼠海马神经元、星形胶质细胞及两者混合状态的体外培养方法,获得高纯度的海马神经细胞。方法：选取孕期18~20 d 的SD 大鼠胎鼠作为原代海马细胞培养的材料来源。断头后于冰板上剥离双侧海马,去除表面血管及薄膜,利用眼科剪分离为小块。随后使用冷平衡盐溶液洗涤3 次,将海马组织碎块移入酶消化液中。本方法选择Accutase 和0.1% DNase 作为酶消化液,37 ℃消化 15 min,期间轻柔振动。使用冷平衡盐溶液洗涤3 次,终止消化。0.1% DNase 加入Neurobasal 和B-27 的混合液对消化后的海马组织碎块进行轻柔吹打,获得单细胞悬液。将悬液过200 目筛,进行细胞计数。将过筛的单细胞悬液移入DMEM 培养基（DMEM+10%胎牛血清）中,按照每平方厘米2.5×104 的细胞密度进行接种。经PDL 孵育的塑料片置于培养基底部。细胞于37 ℃、5% CO2 培养箱内培养。4 h 后,依据所需细胞种类的不同,更换相应培养基。海马神经细胞于培养后7~10 d 可用于实验。结果：通过本方法可得到高纯度的大鼠海马神经细胞,且根据实验需求,通过更换培养基,可得到纯神经元、纯胶质细胞及两者混合的三种培养状态。培养的神经元及星形胶质细胞纯度均>98%。结论：该文在传统海马神经细胞体外培养方法基础上,进一步降低了实验操作难度,方法稳定有效。     

SD大鼠脑皮层星形胶质细胞的原代培养及纯化方法改良

目的:探讨大鼠大脑皮层星形胶质细胞的培养方法,以获得纯度高的细胞进一步对其进行体外实验研究。方法:在Mc-Carthy方法基础上改用出生后1d的SD大鼠的大脑皮层,结合机械分离和胰酶消化后制备单细胞悬液接种,差速贴壁1h,培养14d以后上摇床以去除混杂细胞,细胞融合后传代,每次传代前都经历胰酶冲洗和差速贴壁,传3代后利用GFAP-FITC免疫荧光法对所获细胞进行鉴定。结果:经过原代传代及纯化,大脑皮层星形胶质细胞体外培养成功,并有较高的纯度。GFAP-FITC免疫荧光染色阳性。结论:经过合理取材、改良纯化方法后,可以更为简便得到纯度很高的星形胶质细胞。     

免疫磁珠分选法原代培养小鼠肺微血管内皮细胞

目的：探讨一种高效、稳定的小鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）原代培养方法。方法：选取45只1周龄Balb/c小鼠,随机分成3组,分别用酶消化法、组织贴块法、免疫磁珠分选法3种方法分离培养小鼠PMVECs,观察细胞形态学以及VIII因子相关抗原免疫荧光染色鉴定内皮细胞,计算各组原代培养成功率及从原代培养开始到首次传代所需时间,测定细胞纯度,MTT法绘制生长曲线。结果：3组原代培养的细胞在倒置显微镜下均能见到短梭形、多边形的微血管内皮细胞,血管内皮细胞特异性标志物VIII因子相关抗原表达阳性。免疫磁珠分选法组原代培养成功率及细胞活性显著高于其他2组,差异有统计学意义（P＜0.01）,从原代培养至首次传代所需的时间短于组织贴块法组,差异有统计学意义（P＜0.05）,细胞纯度显著高于酶消化法组,差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：相比于酶消化法与组织贴块法,免疫磁珠分选法原代培养小鼠PMVECs具有重复性好,分离速度快,细胞纯度高及活性好的优点。     

BXSB狼疮小鼠胸腺上皮细胞培养方法的建立

目的：比较不同培养条件下原代狼疮小鼠胸腺上皮细胞生长情况。 方法：分别采用剪切法、剪切加胶原酶消化法、剪切加胰蛋白酶消化法建立培养体系获取自发性系统性红斑狼疮小鼠（BXSB小鼠）胸腺上皮细胞;用光镜、免疫细胞化学染色法进行细胞鉴定。 结果：含血清的培养基与含生长因子的培养基均能培养出较纯的胸腺上皮细胞;剪切法成纤维细胞污染较多,剪切加胰蛋白酶消化法细胞生长状态较差,经剪切加胶原酶消化的BXSB胸腺植块,生长状态好,成纤维细胞污染少;当原代培养的细胞长满瓶壁的90％左右时可传代,角蛋白染色阳性细胞纯度达95％以上。 结论：剪切加胶原酶消化法仅用含血清的培养基即可培养出符合实验要求的BXSB小鼠胸腺上皮细胞,是低成本、简便易行的系统性红斑狼疮模型鼠胸腺上皮细胞培养体系。     

小鼠肾脏足细胞的原代培养和鉴定

目的：建立可操作性好、简单易行且效率较高的小鼠肾脏足细胞分离及原代培养模式,为其进一步研究奠定基础。方法：取C57/BL6J小鼠肾脏,通过差异过筛法获取300目筛的肾小球,用制备好的KI-3T3培养基重悬肾小球后静置于铺被鼠尾胶原的培养皿中,4 d后开始换液,7 d后开始胰蛋白酶消化肾小球,并开始足细胞传代培养。5~7d传代1次,传代2~3次后收集细胞鉴定。采用倒置扭转显微镜观察小鼠肾脏足细胞形态表现,采用PCR法检测小鼠肾脏足细胞中nephrin,podocin和P-cadherin的表达。结果：肾小球种植3 d后可见足细胞从组织中爬出,足细胞传代培养7 d后在倒置相差显微镜下可观察到细胞胞体有突起生长。PCR法检测,分离培养的足细胞表达nephrin、podocin和P-cadherin。结论：差异过筛结合消化酶技术能够成功分离培养C57/BL6J小鼠肾脏足细胞。     

星形细胞瘤细胞的原代培养及形态学研究

目的:通过建立人星形细胞瘤细胞原代培养的方法,观察不同级别星形细胞瘤细胞的生长状态及形态学特点。方法:应用胰蛋白酶消化法,对不同级别的新鲜星形细胞瘤手术标本进行肿瘤细胞原代培养及传代培养,通过调整培养参数,观察肿瘤细胞的生长情况,并从形态学及细胞免疫组化染色等方法进行研究。结果:Ⅱ级及以上的星形细胞瘤均成功进行原代细胞培养,Ⅲ及Ⅳ级星形细胞瘤还成功获得传代培养,并表达免疫组化GFAP,不表达Ⅳ胶原。结论:星形细胞瘤细胞的原代培养可以用胰酶消化法成功培养,培养显示,不同级别的星形细胞瘤其生长活性不同,与其恶性生物学行为呈密切相关。     

新生小鼠心肌干细胞培养与分化的研究

目的了解新生小鼠心肌干细胞原代和传代的培养及其分化潜能，为缺血及坏死心肌重建的临床应用提供科学依据。方法在无菌超净台中剪取新生小鼠心脏组织，经胰酶反复消化后，弃去消化液，所得剩余组织块用胶头滴管反复吹打后离心，加入培养液培养，待其长满培养瓶后进行传代，传代培养约1周可见搏动的心肌细胞，也可见成团细胞的同步收缩。结果采用改良后的方法从消化后的心肌组织块中成功培养得到原代细胞，进行免疫荧光染色、流式细胞仪鉴定其表型为c—kit、sea-1阳性的细胞，表面不表达CD34、CD8、肌球蛋白重链（MHCⅡ）。细胞经传代培养1周左右，开始出现搏动，也可见成团细胞的同步收缩。再次经免疫荧光染色、流式细胞仪鉴定其表型为c-kit、sea-1阴性，MHCⅡ阳性的细胞，仍然不表达CD34、CD8。结论在原方法的基础上，通过对其进行改良，从心脏中成功分离得到纯度更高、活性更好的心肌干细胞，其表型为c-kit^＋、sea-1^＋、CD34^-、CD8^-、MHCⅡ^-，经过传代培养之后，分化为搏动的心肌细胞，细胞表面标记变为c-kit^-、sca-1^-、CD34-、CD8^-，并表达心肌结构蛋白MHCⅡ。