转化生长因子-β2诱导大鼠胰腺星形细胞活化及上皮间质转化的研究

目的探讨转化生长因子-β2(TGF-β2)诱导大鼠胰腺星形细胞(PSCs)活化及上皮间质转化(EMT)的作用。方法组织块法分离、培养及鉴定大鼠PSCs后,10 ng/ml TGF-β2刺激PSCs 72 h,光镜下观察细胞形态学改变;免疫荧光染色及Western blot法检测α-SMA、Col-Ⅰ的蛋白表达;q RT-PCR及Western blot法分别检测E-caderin、Vimentin基因及蛋白的表达;荧光显微镜观察E-caderin和Vimentin在细胞内的表达情况。结果免疫荧光染色显示新分离PSCs神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、结蛋白(desmin)表达阳性,α-SMA表达阴性,符合其生物学特性。TGF-β2处理PSCs后,光镜下观察细胞体积及胞核变大,伪足发达,脂滴消失;免疫荧光染色及Western blot结果显示α-SMA和Col-Ⅰ表达量显著增加,呈典型活化状态;q RT-PCR、Western blot及免疫荧光染色结果显示Vimentin的表达明显高于空白对照组,而E-caderin的表达明显降低(P<0.05)。结论 TGF-β2可诱导PSCs活化及上皮间质转化。     

昆明小鼠胰腺星状细胞分离培养与鉴定

目的通过体外分离培养昆明小鼠胰腺星状细胞(PSC),建立更为经济合适的分离PSC方法。方法采用酶消化联合碘海醇密度梯度离心分离小鼠PSC,经油红O染色和荧光倒置显微镜观察鉴定原代培养的PSC,传代并观察其活化状态。结果昆明小鼠分离PSC数量可达1.84×105,存活率为93.0%。经自发荧光及油红O染色鉴定原代分离PSC脂滴,发现PSC纯度较高。形态观察经传代培养的PSC在前3代细胞状态良好,第4代PSC细胞形态呈现活化且α-平滑肌肌动蛋白染色呈阳性。结论酶消化联合碘海醇密度梯度离心可以成功分离昆明小鼠PSC,前3代PSC的活力与纯度均能满足体外实验的要求,昆明小鼠可作为更为经济适用的PSC分离动物。     

连翘酯苷A对肝星状细胞增殖及凋亡的影响

目的 研究连翘酯苷A(FA)对肝星状细胞增殖活化及凋亡的影响。方法 以人肝星状细胞（LX-2）作为实验对象,采用血小板衍生生长因子（PDGF）-BB模拟肝纤维化微环境,实验分为对照组、PDGF-BB组、FA组、PDGF-BB+FA组。采用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测LX-2细胞活力;采用油红O检测细胞内脂滴的情况;采用免疫荧光染色检测细胞内α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达;采用蛋白质印迹技术（Western Blot）检测纤维化相关标志蛋白[α-SMA、α1-I型胶原蛋白（COL1A1）]和凋亡相关蛋白[B淋巴细胞瘤-2蛋白（BCL-2）、剪切的-腺苷二磷酸核糖聚合酶（cleaved-PARP）、BCL-2相关X蛋白（BAX）、剪切的-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved-CASPASE-3)]的表达;采用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 FA处理后LX-2细胞活力明显下降,且呈剂量依赖性;油红O实验结果显示,与PDGF-BB组比较,FA组细胞内脂滴数量较多;免疫荧光染色结果显示,与PDGF-BB组相比,FA组细胞内α-SMA荧光斑点的数量减少;WesternBlot实验结果显...     

下瘀血汤抑制胰腺巨噬细胞浸润改善肝纤维化的机制研究

目的:评价下瘀血汤对四氯化碳(CCl_4)诱导的肝纤维化模型小鼠肝脏和胰腺病变的改善作用,并探讨其相关机制。方法:24只雄性C57BL/6小鼠随机分为正常组、模型组和下瘀血汤组,每组8只。模型组和下瘀血汤组小鼠腹腔注射10%CCl_4诱导肝纤维化模型,正常组小鼠给予等体积橄榄油,每周3次,连续6周。造模第4周起,下瘀血汤组小鼠灌胃给予0.467 8 g/kg下瘀血汤药液,正常组和模型组小鼠给予等体积蒸馏水,每日1次,连续3周。药物干预期间,每周称量各组小鼠体质量。末次给药后,腹主动脉采血,分离肝、脾、胰腺组织并称重,计算肝脏指数和脾脏指数;试剂盒检测血清ALT、AST水平,HE染色和天狼星红染色后光镜下观察肝脏和胰腺组织病理形态学变化;免疫荧光检测肝组织α-SMA蛋白表达,免疫组化检测胰腺组织CD68、MCP-1及α-SMA蛋白表达。结果:①与正常组相比,模型组小鼠体质量明显降低(P0.01),肝脏指数、脾脏指数显著增大(P0.01),血清ALT、AST水平显著升高(P0.05,P0.01);与模型组相比,下瘀血汤组小鼠体质量显著升高,肝脏指数、脾脏指数及血清ALT、AST水平显著降低(P0.01)。②病理学观察显示,模型组小鼠肝组织可见明显肝细胞肿胀、小叶中心性出血及灶状坏死,并伴有炎症细胞浸润,纤维组织大量增生,增生的胶原纤维分割肝小叶形成较粗大的间隔;胰腺小叶间隙增大,腺泡肿胀,腺管区有较多炎症细胞浸润。下瘀血汤组小鼠肝组织胶原纤维间隔较窄、排列疏松,肝细胞变性、坏死及肝和胰腺组织炎症细胞浸润明显减轻。③与正常组相比,模型组肝组织α-SMA表达明显增多,胰腺组织CD68、MCP-1及α-SMA阳性表达显著升高(P0.01);下瘀血汤干预3周后,肝组织α-SMA表达明显减少,胰腺组织CD68、MCP-1及α-SMA阳性表达显著降低(P0.01)。结论:肝纤维化可引起胰腺巨噬细胞浸润和星状细胞激活;下瘀血汤可显著减轻肝纤维化过程中胰腺巨噬细胞浸润,抑制胰腺星状细胞活化。     

α-SMA的表达与软骨细胞的去分化

目的:探讨细胞骨架蛋白α-SMA的表达与软骨细胞去分化之间的联系.方法:分离、培养大鼠肋生长板软骨细胞(RGCs),对原代至第5代RGCs进行细胞生长动力学分析,阿尔新兰染色、免疫细胞化学法和蛋白质印迹分别检测蛋白多糖,α-SMA和Ⅱ型胶原的表达.结果:随着传代次数的增加,前3代RGCs的每日倍增指数逐渐增加,随后不断下降.原代RGCs的阿尔新兰和Ⅱ型胶原染色均呈强阳性,仅个别细胞α-SMA弱阳性染色.随着传代次数的增加,阿尔新兰和Ⅱ型胶原阳性染色的细胞比例迅速下降,第3代以后的RGCs阿尔新兰染色均为阴性,第5代RGCs也仅有圆形细胞仍保持了Ⅱ型胶原阳性染色,而α-SMA阳性染色细胞的比例则不断增加.蛋白质印迹所揭示的Ⅱ型胶原和α-SMA蛋白表达的变化趋势与免疫细胞化学染色的结果一致.结论:α-SMA从无到有并随着RGCs去分化程度的增强而增加的表达模式,提示它是引起软骨细胞"去分化"的重要原因.     

胰腺癌组织中胰腺星状细胞的活化和基质金属蛋白酶2的表达

目的:检测胰腺癌组织中胰腺星状细胞(PSC)活化的标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和结蛋白(desmin)及基质金属蛋白酶2(MMP2)的表达.方法:应用免疫组织化学染色法分别检测40例胰腺癌、10例正常胰腺组织中α-SMA、desmin及MMP2的表达.结果:胰腺癌组织中α-SMA的阳性表达率为67.5%,desmin的阳性表达率为55.0%,均高于正常胰腺组织(20.0%和30.0%).胰腺癌组织中MMP2的阳性表达率为55%,高于正常胰腺组织(15%).胰腺癌组织中MMP2的阳性表达率与淋巴结转移和向周围组织器官浸润有关(P＜0.01).PSC活化(α-SMA与desmin均为阳性)与淋巴结转移有关.α-SMA与desmin的共表达与MMP2的表达相关(P＜0.05).结论:胰腺癌组织中存在PSC的活化,PSC的活化及MMP2的表达的上调可能参与胰腺癌的浸润转移.     

趋化因子CXCL12可能参与白细胞介素17A对小鼠肺成纤维细胞的活化

目的: 研究IL-17A促进小鼠肺成纤维细胞活化及趋化因子CXCL12在其中的作用。方法: 以雄性BALB/c小鼠为研究对象,小鼠腹腔注射重组小鼠IL-17A后取小鼠肺组织。采用实时逆转录PCR和蛋白质印迹法检测小鼠肺组织α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Ⅰ型胶原蛋白的mRNA和蛋白表达,采用免疫组织化学法和实时逆转录PCR法测定肺组织中趋化因子CXCL12的表达。分离培养正常小鼠原代肺成纤维细胞,采用免疫荧光染色法和光学显微镜观察鉴定原代肺成纤维细胞。将分离的肺成纤维细胞与不同浓度的重组小鼠IL-17A共培养后收集细胞及上清液,采用实时逆转录PCR法测定细胞中α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白和CXCL12的mRNA水平,采用ELISA法测定培养上清液中Ⅰ型胶原蛋白和CXCL12蛋白水平。结果: 与对照组比较,重组小鼠IL-17A处理后小鼠肺组织中α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白的mRNA和蛋白水平均升高（均P < 0.01）。与不同浓度的重组小鼠IL-17A共培养后,小鼠肺成纤维细胞表达α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白和CXCL12的mRNA明显增加（均P < 0.01）,其培养基上清液中Ⅰ型胶原蛋白、CXCL12的浓度也明显升高（均P < 0.01）,且呈剂量依赖性。结论: IL-17A能促进肺成纤维细胞的活化并转化为肌成纤维细胞,分泌Ⅰ型胶原蛋白明显增加,促进细胞外基质的沉积,从而导致肺纤维化的发生和发展,而活化的成纤维细胞分泌的趋化因子CXCL12可能参与了这个过程。     

腹主动脉灌注法分离胰腺星状细胞及其培养、鉴定

目的:通过腹主动脉插管灌注胶原酶分离胰腺星状细胞(pancreatic stellate cell,PSC),建立简单易行的PSC分离方法,并对PSC进行培养和鉴定.方法:大鼠腹主动脉插管灌注后,经胶原酶消化、Nycodenz密度梯度离心,分离得到PSC;通过观察细胞形态、胞质内脂滴和免疫细胞化学方法检测结蛋白(desmin)、神经胶质酸纤维蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、α平滑肌肌动素(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达来鉴定PSC.结果:腹主动脉灌注法分离得到PSC,产率、活力和纯度分别为:(15.3±4.6)×103/g体重、(95.0±3.5)%、＞80%;培养24 h后大多数细胞已贴壁,呈星状或多角形,48 h后表达desmin、GFAP,并在96 h后表达α-SMA.结论:通过腹主动脉灌注法较容易分离得到PSC,其产率、活力和纯度较高,经鉴定后能够满足体外实验要求.     

人肝脏星状细胞的一种改良分离方法

目的建立和改良人肝脏星状细胞(human-hepatic stellate cells,hu-HSCs)分离方法,使之适于原代培养和研究。方法在传统分离HSCs方法的基础上,省略链霉蛋白酶和DNA酶,用EGTA液促细胞解离,再用Ⅳ型胶原酶消化,差速离心去除肝实质细胞,最后用Nycodenz密度梯度离心纯化hu-HSCs,台盼蓝染色法计算细胞产量和进行活力评估,α-SMA、desmin免疫荧光染色及油红O脂滴染色鉴定细胞纯度。结果分离得到的原代hu-HSCs数量高达3×106个/克肝脏,纯度达98%;细胞传代后纯度达到100%。结论改良后的方法经济、快捷、高效,细胞得率及纯度大为提高,有利于建立在原代hu-HSCs基础上的研究。     

ASPP2在人肝星状细胞活化中的作用

目的 探讨p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis-stimulating protein of p53-2,ASPP2)对人肝星状细胞活化的调节作用及机制.方法 人永生的肝星状细胞系LX-2在孵箱中培养,转染ASPP2腺病毒和单荧光自噬指示体系(GFP-LC3)质粒,免疫印迹法检测ASPP2、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、自噬基因表达相关蛋白(Beclin-1)的表达水平.免疫荧光检测,LX-2细胞共转染ASPP2腺病毒和GFP-LC3质粒后,ASPP2过表达对LX-2细胞自噬的影响,M30染色检测ASPP2过表达对LX-2细胞凋亡的影响.结果 转染ASPP2腺病毒后LX-2细胞内ASPP2蛋白表达明显增加;与转染对照空载腺病毒的LX-2细胞相比,转染ASPP2腺病毒的LX-2细胞自噬和α-SMA的表达明显减少,肝星状细胞的活化受到抑制;转染ASPP2腺病毒后LX-2细胞的凋亡水平增加明显.结论 ASPP2过表达在体外具有抑制肝星状细胞活化的作用.