人抑瘤素M在毕赤酵母中的高效分泌表达

目的：在毕赤酵母中高效分泌表达重组人抑瘤素M（rhOSM）。方法：以人胚胎组织DNA为模板通过PCR技术获得hOSM基因,构建毕赤酵母真核表达载体pPICZαC-hOSM,电转化毕赤酵母菌株X-33,PCR法筛选阳性克隆,SDS-PAGE和Western blotting方法筛选能够稳定、高效分泌表达rhOSM的酵母工程菌。结果：经PCR法获得了hOSM基因,培养液上清经SDS-PAGE和Western blotting证实获得了相对分子质量约为28 000的rhOSM,表达量为45　mg•L^-1。结论：毕赤酵母表达系统能够稳定、高效分泌表达rhOSM,摇瓶规模表达量为45 mg•L^-1。     

白蛋白信号肽引导天然N-端的rBPTI在毕赤酵母中高效分泌表达

目的：探讨在毕赤酵母(Pichia pastoris)中高效分泌表达具有天然N-端序列的rBPTI。方法：将白蛋白信号肽(hsasp)和bpti基因连接并构建真核表达载体pPICZ/hsasp-bpti，电击转化毕赤酵母菌株X-33，用PCR法、SDS-PAGE和胰蛋白酶抑制活性分析筛选阳性转化菌。结果：转染pPICZ/hsasp-bpti的毕赤酵母X-33工程菌能够高效地分泌表达rBPTI；培养上清中rBPTI含量约200 mg• L^-1；SDS-PAGE和质谱分析结果显示rBPTI相对分子质量分别为6 500和6 508；rBPTI的N-端测序结果表明其N-端15个氨基酸序列与天然BPTI完全一致；胰蛋白酶活性抑制分析结果表明，抑制常数Ki＝（2.6±0.1）×10^-9,与天然BPTI一致。结论：hsasp能够在毕赤酵母中高效地引导分泌表达天然N-端氨基酸序列的rBPTI,其表达量达200 mg• L^-1。     

人血管抑素K1-3在毕赤酵母胞内表达的研究

目的:构建人血管抑素K1-3的重组酵母胞内表达质粒PHIL-D2/K1-3,获得重组目的蛋白.方法:从胎儿肝脏组织用RT-PCR方法扩增人血管抑素K1-3目的基因,克隆至酵母胞内表达质粒PHIL-D2中,线性化后转化到毕赤酵母GS115胞内,经PCR和Sourthern杂交筛选出阳性转化子,并用甲醇诱导表达.表达产物进行SDS-PAGE(12%)和Western blot检测,经赖氨酸亲和层析柱纯化后,用Lowry法测定蛋白含量,并进行生物活性测定.结果:SDS-PAGE和Western blot结果显示,表达蛋白质的相对分子量为30kd左右,低糖基化.Lowry法测定蛋白表达量为6.8mg/L.活性测定实验表明重组血管抑素能特异抑制人血管内皮细胞的增殖.结论:在毕赤酵母GS115胞内成功表达了人血管抑素K1-3重组蛋白.     

人抑制素M突变体在毕赤酵母中的分泌表达研究

目的:构建重组人抑瘤素M突变体(Recombinant human mutant oncostatin M,rhMut-OSM)毕赤酵母分泌表达菌株.方法:将人抑瘤素M蛋白成熟蛋白编码序列同义突变成毕赤酵母偏好密码子,同时将100位和217位Asn突变成Glu,消除糖基化位点,人工合成人抑瘤素突变体基因.将基因直接连接到pPIC9载体信号肽识别序列之后,构建毕赤酵母真核表达载体DPIC9-rhMut-OSM,电转化毕赤酵母菌株GS115,用PCR法筛选阳性克隆,SDS-PAGE和Western blotting方法筛选能够稳定、高效分泌表达rhMut-OSM的酵母工程菌.结果:培养液上清经SDS-PAGE和Western blotting证实获得了相对分子质量约为22kD的rhMut-OSM,实现了非糖基化表达,表达量高峰出现在诱导72h后,摇瓶表达量为400mg/L.结论:成功构建了重组人抑瘤素突变体毕赤酵母工程菌株,能稳定、高效分泌表达rhMut-OSM.     

人成纤维细胞生长因子21基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

目的：以毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115和SMD1168为宿主菌表达人源成纤维细胞生长因子21（hFGF21）,为开发治疗糖尿病药物提供一定的实验基础。方法：根据毕赤酵母基因偏爱密码子和hFGF21氨基酸序列,设计多条寡核苷酸引物。利用融合PCR方法获得人工合成的成纤维细胞生长因子21(FGF21)基因,定向克隆到质粒pPIC9K中,电转化Pichia pastoris GS115和SMD1168。MD、MM平板筛选表型Mut⁺,YPD/G418平板进一步筛选高拷贝转化子。甲醇诱导表达,硫酸铵沉淀、分子筛、离子交换方法纯化目的蛋白。结果：PCR　扩增出约569 bp的特异性片段,测序分析正确;诱导表达上清经SDS-PAGE和Western blotting分析表明：FGF21在宿主菌GS115中不表达,而在SMD1168表达上清中出现相对分子质量为20 000的特异性条带,且与抗FGF21抗体产生特异性反应,阴性对照在该处无特异性带,证明hFGF21蛋白在SMD1168菌株中成功分泌表达。结论：成功克隆FGF21基因,并在Picha pastoris　SMD1168中获得表达。     

PHOⅠ信号肽在毕赤酵母中引导分泌表达天然N-端rBPTI

目的：在毕赤酵母(Pichia pastoris)中分泌表达天然N-端rBPTI。方法：将PHOⅠ/bpti基因克隆到真核表达载体pPICZα,电转化毕赤酵母菌株X-33。 结果：构建了含PHOⅠ/bpti基因的表达质粒,并在 X-33中分泌表达rBPTI。用胰蛋白酶抑制实验筛选出表达rBPTI的工程菌。表达上清经阳离子交换层析分离纯化为单一组份,SDS-PAGE显示相对分子质量为 6 500。结论：PHOⅠ信号肽在毕赤酵母中成功地诱导分泌表达了具有正确N-端氨基酸序列的rBPTI。     

人骨形成蛋白-2成熟肽在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

目的利用甲醇毕赤酵母表达系统,高效分泌表达人骨形成蛋白-2成熟肽(hBMP-2)。方法利用PCR方法扩增得到hBMP-2基因,构建其毕赤酵母真核表达载体pPICZaC/hBMP2,电转化巴斯德毕氏酵母X-33,于28℃进行甲醇诱导分泌表达,用PCR法、SDS-PAGE、WesternBlot等方法筛选获得高效表达rhBMP-2的工程菌株,并进行了表达产物的纯化和活性测定。结果表达产物分泌至培养上清中,rhBMP-2含量达100mg·L-1。SDS-PAGE初步验证了表达产物的分子量,经WesternBlot和ELISA检测到重组表达产物的特异性结合活性。结论构建了重组hBMP-2的基因工程菌,并在毕赤酵母中实现了高效分泌表达,为进一步研究其活性和功能奠定了基础。     

重组sCR1在毕赤酵母细胞中的表达、纯化及鉴定

目的:酵母细胞SMD 1168表达人sCR1,并对重组蛋白进行纯化。方法:从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入真核表达载体pPIC9K,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9K-sCR1);经测序鉴定正确后,将重组质粒转化入毕赤酵母菌细胞SMD 1168中,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析及W estern b lot鉴定,并通过N i2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果:经甲醇诱导的含pPIC9K-sCR1的酵母细胞表达出重组人sCR1的融合蛋白,48~72 h sCR1融合蛋白表达量最高。此蛋白在凝胶上表现为M r大于31 KDa的蛋白区带,在W estern b lot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经N i2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论:人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原活性。     

旋毛虫抗原基因Ts87在毕赤酵母系统中优化表达的研究

目的优化旋毛虫抗原基因Ts87在毕赤酵母系统中的表达,提高其表达量。方法选择去除自身信号肽序列的Ts87基因构建天然N末端的重组质粒,电击转化经锂盐处理过的酵母细胞X-33,摸索诱导起始细胞浓度、甲醇诱导浓度及其添加的时间间隔、pH值及诱导时间等条件对重组菌株表达的影响,并对表达产物进行Western blotting鉴定。结果采用锂盐处理毕赤酵母细胞的感受态制备方法可以极大的提高电击转化效率,并确定pPICZαA-Ts87nature/X-33株最佳表达条件为:OD600 nm=1.0,1.0%/24 h体积比添加甲醇,pH值7.0或8.0,诱导表达72 h。将此条件下的培养物上清液30μL直接上样,表达产物可被感染旋毛虫的兔血清所识别。结论本研究优化了Ts87在毕赤酵母系统中的表达条件,为后续研究工作打下基础。     

毕赤酵母中表达HSA/IL1ra融合蛋白的产物不均一现象的研究

目的探索HSA/IL1ra融合蛋白在毕赤酵母中表达的产物不均一现象的原因及可能的影响因素.方法通过去糖基化和抑制糖基化实验验证不均一产物的由来,并考察了不同融合方式、不同克隆菌株、不同表达宿主对产物不均一现象的影响.结果糖基化不均一引起产物不均一现象,且在SMD1168中没有此类现象,个别毕赤酵母GS115克隆中也没有此现象.结论HSA/IL1ra融合蛋白在毕赤酵母中表达的产物不均一现象,是由于融合蛋白在毕赤酵母中表达时糖基化不均一引起的,且不同融合方式、不同克隆、不同宿主对该现象有影响.     

人碱性成纤维细胞生长因子cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达

目的：克隆和表达人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF),以便进一步研究其功能。方法：从人神经胶质瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR方法,扩增出hbFGF cDNA片段,与pMD18-T载体连接后作DNA序列分析,并用亚克隆的方法构建pPICZα-hbfFGF,将测序正确的重组质粒用SacI线性化后电转化至毕赤酵母X-33,经PCR法、SDS-PAGE和Western blotting分析表达产物,从而筛选出能够稳定、高效分泌表达hbFGF的酵母工程菌。结果：经测序证实获得的hbFGF序列与GenBank（登录号NM002006）报道的完全一致,甲醇诱导表达后培养液上清的SDS-PAGE凝胶电泳显示在相对分子质量约18 000有一蛋白条带,Western blotting结果显示表达产物与抗人碱性成纤维细胞生长因子抗体产生特异性条带,证明rhbFGF蛋白的表达。结论：成功克隆了hbFGF 基因,并在毕赤酵母体系中进行了表达。     

人重组白细胞介素11在毕氏酵母系统中的表达及纯化

目的在甲醇营养型毕氏酵母蛋白质表达系统中高效表达人白细胞介素-11(rhIL-11),便于进一步开发。方法以人工设计合成的rhIL-11基因,构建表达载体pPICZαA-IL-11,经线性化后电转化导入毕氏酵母菌株KM71,甲醇诱导表达,用ELISA和SDS-PAGE检测发酵上清中IL-11的抗原性和表达量,用IL-11依赖的B9-11细胞株分析其生物学活性,采用疏水层析、离子交换和凝胶过滤纯化发酵上清中的IL-11。结果序列分析表明,克隆载体中IL-11人工基因序列与设计相符;基因工程菌株KM71-2424在摇瓶培养上清中IL-11的表达量超过60mg/L,生物学活性测定显示其比活性为5.5×10     

SARS冠状病毒N蛋白在酵母中的表达纯化及抗原性分析

目的研究人SARS冠状病毒核壳N蛋白在Pichia pastoris酵母中的表达,获得具有生物学活性的重组N蛋白,并鉴定表达蛋白的抗原性,为下一步的研究奠定基础.方法合成引物扩增SARS冠状病毒N基因,插入含AOX1启动子的Pichiapastoris酵母表达载体中,转化酵母宿主菌KM71H、X-33、GS115,筛选阳性转化子,摇瓶培养,用甲醇诱导表达.表达产物经镍离子柱亲和层析纯化后,以抗SARS冠状病毒N蛋白的小鼠单抗、兔多抗及SRAS病人阳性血清鉴定其抗原性.结果SDS-PAGE和免疫学分析显示,酵母转化子仅在KM71H、X-33中有Mr约70 000的诱导蛋白,表达产物具有良好的抗原性和特异性.结论在酵母表达系统中,初步实现了SARS冠状病毒核壳N蛋白的有效表达.     

人血管内皮生长因子受体2胞外段在毕赤氏巴斯德酵母中的表达

目的探讨在毕赤氏巴斯德酵母（Pichia pastoris）中高效表达有真核蛋白结构的人血管内皮生长因子受体2胞外段（heVEGFR-2）的可行性。方法从重组质粒pORF-heVEGFR-2经PCR获全长heVEGFR-2 DNA,构建重组毕赤氏巴斯德酵母分泌性表达载体,电转化Pichia pastoris X-33。用抗药性表型和甲醇诱导筛选出重组heVEGFR-2蛋白表达阳性的转化子（X-33-heVEGFR-2）。结果SDS-PAGE显示,获分子量约108kDa的重组heVEGFR-2蛋白,约占X-33-heVEGFR-2分泌性表达蛋白总量的45％。该重组蛋白在表达上清中的质量浓度达80mg／L。其heVEGFR-2部分分子量约106kDa。Western blot证实,该蛋白能特异地与大鼠抗小鼠VEGFR-2单克隆抗体结合。结论毕赤氏巴斯德酵母能高效表达有真核蛋白结构的人血管内皮生长因子受体2胞外段蛋白全段。