实时荧光定量PCR在检测人ANP基因表达的应用

目的 建立心房钠尿肽(ANP)基因mRNA表达水平的实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行初步评价.方法 以基因表达产物为模板,建立实时荧光定量PCR检测方法,对样本中的心房钠尿肽含量进行相对定量,比较不同样本组的基因表达水平.结果 所建立的实时荧光定量PCR方法熔解曲线中熔解峰单一.肺癌患者胸腔样本的ANP含量为对照样本的4.68倍,血清样本为对照样本的16.03倍.结论 所建立的ANP实时荧光定量PCR检测方法具有较高的特异性.肺癌患者胸腔液和血清中ANP的含量明显增高.     

实时荧光定量PCR在念珠菌研究中的应用

念珠菌作为院内感染的常见机会性致病菌,实时荧光定量PCR技术已应用于念珠菌临床快速诊断、基因分型、耐药等研究。实时荧光定量PCR技术以灵敏、快速、安全、准确、高通量等特性,不仅在分子生物学领域作为常规的分析检测方法,而且在医院临床标本病原体的检测、遗传性疾病的诊断、检疫、法医学标本的鉴定等领域也逐步得到了广泛运用。     

实时荧光定量PCR与酶联定量PCR技术在 HBV-DNA载量检测中的比较研究

目的:比较实时荧光定量PCR(RQ-PCR)与酶联定量PCR(ELQ-PCR)技术在检测HBV感染血清HBV-DNA载量的灵敏度,精确性.为乙型肝炎临床抗病毒治疗和评价药物疗效提供可靠的依据.方法:应用RQ-PCR方法检测212例(4组)HBV感染者血清,ELQ-PCR方法检测228例(4组)HBV感染者血清.结果:RQ-PCR和ELQ-PCR方法检测HBV-DNA,其阳性检出率分别为HBsAg,HBeAg,HBcAb-IgG( )组100%和82.61%;HBsAg,HBeAb,HBcAb-IgG( )组90.63%和73.21%;HBsAg,HBcIgG,HBcAb-IgM( )组80.00%和57.58%;HBsAg,HB-cAb-IgG( )组70.15%和51.43%.HBV-DNA载量的阳性检出率,经统计学处理有显著性差异(P＜0.05).结论:RQ-CPR方法检测HBV-DNA载量在实时监测,节时快速,高灵敏,高精确度等方面都更优于ELQ-PCR.     

实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞CD58基因的表达

目的：应用实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)CD58基因的表达。方法：提取PBMC总RNA并逆转录为cDNA，实时荧光定量PCR法分别检测43例HBV感染者及11例正常对照的PBMC CD58基因的表达水平，同时检测血清ALT、AST水平。结果：乙型肝炎各组患者PBMC CD58 mRNA表达水平较正常对照组明显增高，差异均有显著性。乙型肝炎患者PBMC CD58mRNA水平与血清ALT、AST呈显著正相关。结论：实时荧光定量PCR可以准确定量检测基因的表达；乙型肝炎患者PBMC CD58基因表达水平与疾病严重程度及肝细胞损伤严重程度有关。     

实时荧光定量PCR的研究进展及其应用

随着PCR(聚合酶链反应)技术的飞速发展,实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术以其特异性强、灵敏度高、自动化和重复性好、定量准确、污染少等优点,成为分子生物学和其它领域的重要技术工具,并广泛应用于遗传病、病原体和肿瘤等方面的检测和诊断.本文就实时荧光定量PCR技术的主要原理、定量方法及目前在研究领域中主要的应用进行了概述.     

荧光定量PCR在乙肝检测中的应用

目的 :探讨 5‘ -核酸酶法荧光定量技术在乙肝检测中应用状况。方法 :采用荧光定量PCR方法 ,检测2 0份阳性对照考核批内及批间变异 ;采用 5 0份HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAg(+)的血清 ,结合肝功能及HBeAg滴度考核阳性率、病毒含量范围以反映病毒复制状况 ;对 5份本法检测阳性的标本 ,4℃保存 ,并隔日检测 ,确定最佳检测时间。结果 :批内CV为 4 1 % ,批间CV为 4 0 %。阳性标本为 4 6份 (92 % ) ,其中 4份肝功能正常 ;阴性标本为 4份 (8% ) ,其中 1份肝功能异常。病毒量有较大的变化范围 ,从 0 .1 1× 1 0 4～ 5 .1× 1 0 4CID/ml。阳性标本所测病毒量与HBeAg滴度相关系数为 0 .77。在 1 5d内隔日所测病毒量相近。结论 :本法应用于乙肝检测 ,有较好的特异性 ;定量结果能够反映病毒在体内的复制状况 ;病毒含量因患者而异 ;在严格操作条件下 ,本法有一定的重复性 ;正确保存标本时 ,在半月内均可以检测病毒     

实时荧光定量PCR技术研究进展及应用

实时荧光定量PCR(rea-l time fluorescent quantitative polymerase chain react ion,FQ-PCR)是是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术。,它具有特异性强、PCR污染少、自动化程度高等特点。作者就实时荧光定量PCR技术的研究进展及目前肿瘤诊断、细胞因子分析及病毒感染的监测等方面进行了概述。     

实时荧光定量PCR应用及实验条件优化

实时荧光定量PCR是在普通PCR基础上发展起来的新技术,在保持了PCR技术灵敏、快速、特异特点的基础上增加了定量的特点.在检测微小残留病变,肿瘤标志性基因及病毒负荷量等方面为临床医生判断病情,了解预后发挥着不可替代的作用.荧光定量PCR为科学发挥着巨大作用的同时,人们也不断对其实验条件进行优化,保证定量结果的准确.     

荧光实时定量PCR的研究进展

生物机体的生长、发育、衰老和病变通常由基因在不同阶段和部位的差异表达来决定。基因表达差异最终表现为蛋白质合成量上的差异,并在一定程度上决定细胞的激活、增殖、分化、病变和凋亡。定量mRNA表达是了解机体生长发育调控和病理病变机理的一个重要方面,因此准确定量mRNA表达成为了生物医学研究中的一个重要内容。     

实时荧光定量PCR 法在检测血浆结核杆菌DNA 的应用

目的:探讨实时荧光定量PCR 法在检测血浆结核杆菌DNA 的应用及价值.方法:以我院确诊为结核病且未经治疗的患者392 例作为实验组,同时选取健康体检人群100 例作为对照组.分别对两组患者取静脉血,并对其血浆中结核分枝杆菌DNA 采用实时荧光定量PCR 法进行检测,同时对实验组患者进行痰涂片检查.结果:对照组患者实时荧光定量PCR 法检测全为阴性;实验组患者采用痰涂片检查,结果显示有80 例为阴性,其实时荧光定量PCR 法检测结果显示,痰涂片阳性的患者全为阳性,其阴性患者中有24 例为阳性,在对阳性患者抗痨治疗后有12 例患者转为阴性.实验组患者MTB DNA 为1.76×109 copies/mL.结论:本实验表明结核患者血浆中存在MTB DNA,采用实时荧光定量PCR 法可有效的对痰涂片阴性以及无痰患者进行诊断,有较好的利益价值.     

实时荧光定量PCR检测限的统计推断

检测限是检测方法的重要性能指标,用Poisson分布的概率函数分式计算一次抽样检测出现的结果推论总体出现该结果的概率。以实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测乙型肝炎病毒DNA结果为例,计算可知,一次抽样反应管的检测结果≥4时,才可推论总体与0(空白)差异有显著性(P<0.05)。因而检测血清中病原体时扩增反应管中的检测限是4拷贝/ul计算也可知,1拷贝/ul表示一次抽样的结果为0的概率可达0.368,结果在0拷贝/ul～4拷贝/ul的概率为0.996,而1000拷贝/ml表示一次抽样结果为0的概率为0。结果在905拷贝/ml～1095拷贝/ml的概率为0.997;而100000拷贝/L表示一次抽样结果在997000拷贝/L～1003000拷贝/L的概率为0.997。抽样单位ul不能随意放大为ml甚至L。     

实时荧光定量PCR检测HBV DNA与ELISA检测HBV M结果的关系

目的:探讨实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测HBV DNA与ELISA检测HBV M结果的关系.方法:采用实时FQ-PCR和ELISA方法分别对240例乙肝患者进行HBV DNA定量测定和HBV M检测.结果:240例HBsAg阳性血清中HBV DNA阳性率为74.58%.HbsAg、HbeAg、HBcAb和HbsAg、HbeAg阳性组的HBVDNA含量及HBV DNA阳性率均明显高于HbsAg、HbeAb、HBcAb和HbsAg、HBcAb组(P＜0.05,P＜0.01).122例HBeAg阳性的血清中97.54%的HBV DNA阳性;118例HBBeAg阴性的血清中有50.85%HBV DNA阳性.结论:实时FQ-PCR检测HBV DNA准确灵敏,是HBV感染及复制的直接证据.HBV M和HBV DNA的检测各有其独特的临床检测意义,在乙型肝炎的诊断治疗中均具有重要的临床价值.     

呼吸道合胞病毒实时荧光定量PCR检测

目的 建立一种快速、准确诊断人呼吸道合胞病毒(hRSV)早期感染的实时荧光定量PCR检测方法。方法 以hRSV最保守的N基因序列为参考,设计两对特异的引物和一条TaqMan荧光探针,在LightCycler定量PCR检测仪上对93例下呼吸道感染患儿进行hRSVRNA检测,并与病毒分离培养、常规PCR、巢式PCR方法和ELISA法相比较。结果 以PCR模板浓度来定义,该方法线形范围为1×10²~1×10⁷cDNAcopies/μl,灵敏度达1×10²cDNAcopies/μl,和巢式PCR相同,比常规PCR高10倍。用人脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、柯萨奇病毒2型、甲型、乙型流感病毒、腺病毒7型作对照,均无预期扩增产物和荧光的产生;该方法在LightCycler和Rotor-Gene两种仪器上的定量结果具有一致性;采用该法对93例患儿行FQ-PCR检测出阳性44例(43.9%),ELISA方法检测阳性4例(4.3%),两者相关性不高。hRSV浓度的高低与患儿临床症状之间的关系不是很明显。结论 该方法可快速、灵敏、特异、定量检测hRSV,在hRSV感染的早期诊断和疗效监测方面具有良好的应用前景。     

胃癌组织Twist基因的荧光实时定量PCR检测

目的探讨Twist基因在人胃癌组织、癌旁组织、胃癌转移灶组织中表达及临床意义。方法应用Trizol法提取总RNA，以总RNA为模板经逆转录合成cDNA，用实时荧光定量PCR的方法检测8例正常胃粘膜，27例胃癌原发灶，19例胃癌转移灶组织中Twist mRNA的表达情况并分析其与临床病理指标的关系。结果荧光实时定量PCR扩增结果显示，Twist基因在正常胃粘膜组织中表达量很低，而在原发性胃癌组、转移性胃癌组中均有较高的表达，原发性胃癌组织及腹膜转移组织中的表达明显高于正常胃粘膜组织（P〈0．05）；Twist基因在淋巴转移组织中的表达与原发组中的表达差异显著（P〈0．05）。结论Twist基因在胃癌中过度表达可能促进胃癌的发生与发展，并与胃癌转移密切相关，又可能成为预测胃癌转移潜能的分子基础。     

HBV-DNA荧光定量PCR检测的临床意义

目的 探讨荧光定量PCR检测HBV-DNA在乙型肝炎的诊断、治疗及判断病情、预防 等方面的临床应用价值。方法 运用荧光定量PCR和ELISA法同时检测了180例乙型肝炎患者和56 例正常献血员血清中HBV-DNA的含量及其免疫标志物,并对结果进行了对比分析。结果 乙肝大 三阳患者HBV-DNA阳性率达100％(95／95),显著高于其他各组(P<0．01),HBV-DNA含量平均 为4．8×10~7copy／ml;小三阳患者HBV-DNA阳性率低于大三阳组(P<0．01),但平均病毒含量与大 三阳组无差异(P>0．05),高达2．1×10~7copy／ml;单独HBsAg阳性和单独HBsAb阳性组HBV- DNA阳性率分别为54％、33％,平均病毒含量分别为5．6×10~5copy／ml、3．8×10~4copy／ml;56例献血员 血清仍有3例HBV-DNA阳性,其病毒含量低于其他组。结论 荧光定量PCR检测HBV-DNA含 量比ELISA法具有更好的灵敏度和特异性,能准确反映HBV在体内的复制情况,这对临床上抗病毒药 物的选择和判断疾病的预后意义重大。     

新型HBV-DNA实时荧光定量PCR试剂盒的应用

目的:观察新型HBV-DNA荧光定量PCR试剂盒的临床应用价值。方法:采用荧光定量PCR检测法,用10份正常血清、10份HBV高滴度(106 IU/ml)血清和梯度稀释的HBV克隆质粒标准品,验证该试剂盒检测结果的重复性、特异性和灵敏度;并将该10份HBV高滴度(106 IU/ml)血清结果与同时用传统方法所测结果进行配对检验。结果:10份正常血清标本均无假阳性HBV-DNA检测结果,特异性极好;灵敏度可达到103 IU/ml,重复性和准确性两者之间差异无显著性(t=1.15,P>0.05)。结论:该方法特异性和灵敏度高,方便、快捷,可替代传统试剂盒用于HBV的临床检测和科学研究。     

实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞CD_(58)基因的表达

目的:应用实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)CD58基因的表达。方法:提取PBMC总RNA并逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR法分别检测43例HBV感染者及11例正常对照的PBMCCD58基因的表达水平,同时检测血清ALT、AST水平。结果:乙型肝炎各组患者PBMCCD58mRNA表达水平较正常对照组明显增高,差异均有显著性。乙型肝炎患者PBMCCD58mRNA水平与血清ALT、AST呈显著正相关。结论:实时荧光定量PCR可以准确定量检测基因的表达;乙型肝炎患者PBMCCD58基因表达水平与疾病严重程度及肝细胞损伤严重程度有关。     

实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌femA表达水平

目的探讨实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌乒,以表达的方法。方法以BB270femA基因表达为标准,建立实时荧光定量PCR方法,对实验菌株femA表达进行相对定量。结果建立的实时荧光定量PCR方法所得结果标准曲线线性关系好,熔解峰单一。随MIC变化,金黄色葡萄球菌femA表达水平也随之变化。结论用实时荧光定量PCR方法研究金黄色葡萄球菌femA表达量结果可靠、敏感、重复性好。     

实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的临床应用价值

目的: 探讨实时荧光定量PCR(F Q-PCR)检测乙型肝炎病毒DNA的临床应用价值。方法: 采用FQ-PCR方法检测196例患者血清中HBV-DNA。结果: 112例HBeAg(+)/HBeAb(-)标本中FQ-PCR均阳性,HBV-DNA拷贝数1.08×107/ml;68例HBeAg(-)/HBeAb(+)标本中,平均拷贝数6.12×105/ml,其阳性率为66.2%;16例HBeAg(-)/HBeAb(-)标本中,平均拷贝数为2.72×104/ml。结论: 实时FQ-PCR可以实现准确定量,是了解HBV在体内复制和判断疗效的有利手段。     

应用于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法

目的建立特异灵敏的适应于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法.方法于细菌样本离心所得沉淀中加入提取液(25% Chelex-100,0.5%NP40,TE配制,pH=9.0);56℃孵育30 min;100℃水浴10 min;离心后所得上清即为DNA.电泳、PCR及Real-time PCR扩增评价该方法的特异性及灵敏度.结果本方法所提细菌DNA电泳条带清晰,未见假阳性,D(260)/D(280)=(1.79±0.03);PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,灵敏度达101/ml细菌浓度.结论本研究细菌DNA提取方法特异灵敏,适应于PCR及Real-time PCR.