Study of the effects of Moerella iridescens polysaccharide on hepatitis B virus transfected HepG2 cells

目的 研究彩虹明樱蛤多糖(MIP)对转染HBV的HepG2细胞表达功能的影响.方法 以不同浓度( 10-2～ 104μg/ml) MIP作用于体外培养的HepG2.2.15细胞,采用MTT法、时间分辨免疫分析法(TRHA)和ELISA法检测MIP对HepG2.2.15细胞的毒性作用及HBsAg、HBeAg、Pre-S1Ag表达的影响,采用FQPCR检测MIP对HBV DNA复制的抑制作用.结果 MIP在10-2～102μg/ml浓度范围内对HepG2.2.15细胞无毒性作用,TC50为4633μg/ml.MIP在10-2～102μg/ml浓度范围内,对HBsAg、HBeAg、Pre-S1Ag以及HBV DNA均有一定抑制作用,相应的治疗指数分别为129、28、20和83.结论 MIP具有一定的抗HBV活性.     

绿原酸对抗乙肝病毒-HBsAg和HBeAg的抑制作用

目的观察绿原酸对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用。方法以2.2.15细胞为研究对象,通过细胞毒性实验确定绿原酸对细胞的最大无毒浓度,在最大无毒浓度以下将药物用培养液对倍稀释成250、125、62.5μg/ml,加入2.2.15细胞进行培养,每4d换同浓度药物培养液,分别收集第4、8天的培养液,酶联免疫法测定HBsAg、HBeAg含量。结果绿原酸对2.2.15细胞最大无毒浓度为250μg/ml。在最大无毒浓度（250μg/ml）时,两批试验对HBsAg、HBeAg均具有明显的抑制作用。第4、8天时对HBeAg的平均抑制率分别为89.45%、82.00%,对HBsAg的抑制率分别为86.54%、88.00%。结论绿原酸对2.2.15细胞分泌的HBsAg、HBeAg有显著的抑制作用。     

泛昔洛韦等3种药物抗乙型肝炎病毒的体外实验研究

 目的评价泛昔洛韦、膦甲酸钠及氧化苦参碱的体外抗HBV作用.方法采用MTT法检测3种药物对HepG2.2.15细胞的半数毒性浓度(TC5o),并在此基础上观察不同浓度药物作用于HepG2.2.15细胞后第3、5、7和9天培养上清中HBsAg、HBeAg及HBV DNA含量的变化,比较不同药物抗HBV的效果.结果泛昔洛韦和氧化苦参碱对HepG2.2.15细胞有明显的抗HBV活性,在实验浓度范围内,随着药物浓度增加和作用时间延长,其抗HBV活性增强;膦甲酸钠对HBV无明显抑制作用.结论泛昔洛韦和氧化苦参碱具有明显体外抗HBV活性,而膦甲酸钠体外对HBV无明显抑制作用.     

靶向HBV C基因的siRNA在HepG2.2.15细胞中对HBV的抑制作用

目的研究靶向HBV C基因的短发夹状RNA(shRNA)表达质粒对HepG2.2.15细胞中HBV的抑制作用。方法设计构建两个靶向HBV C基因的shRNA表达质粒S1和S2,以及用于对照的非同源shRNA表达质粒S3。转染HepG2.2.15细胞后,通过RT-PCR和ELISA方法分别检测细胞中HBV C基因表达和细胞上清中HBV DNA、HBsAg和HBeAg表达。结果在转染后24 h时,HBV C基因mRNA表达量下降58%～83%,HBV DNA下降了2.44～3.36个log值,HBsAg和HBeAg的表达水平分别降低了51%～79%和50%～77%。S1、S2联合运用可以提高对HBV的抑制作用,而S3无抑制效果。结论靶向HBV C基因的shRNA表达质粒S1、S2及其联合运用,均能有效地抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制和表达。     

LSM14A蛋白通过活化IRF3抑制乙型肝炎病毒的复制

目的 探讨RNA相关蛋白LSM家族成员14A(LSM14A)在乙型肝炎病毒(HBV)感染中的功能及其潜在的分子机制.方法 通过慢病毒包装方法构建稳定敲低LSM14A的HepG2.2.15细胞株和稳定过表达LSM14A的HepG2.2.15细胞株,利用CRISPR/Cas9技术构建LSM14A敲除的HepG2.2.15细胞.采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白免疫印迹(Western印迹)检测敲低、过表达和敲除效果.利用RT-qPCR和Northern印迹杂交检测HBV RNA的表达水平;RT-qPCR检测HBV DNA的表达水平;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和乙肝病毒e抗原(HBeAg)的表达水平.利用Western印迹检测下游分子,RT-qPCR检测干扰素的分泌.结果 在HepG2.2.15细胞中过表达LSMJ 4A可显著抑制HBV的复制,而敲低或敲除LSM14A可显著促进HBV的复制.过表达LSM14A后,p-TBK1、p-IRF3、Ⅰ型和Ⅱ型干扰素的表达水平均显著增加.结论 在HepG2.2.15细胞中LSM14A蛋白通过促进IRF3的磷酸化诱导Ⅰ型和Ⅱ型干扰素的表达,进而抑制HBV的复制.     

替芬泰对HepG2-2.2.15细胞HBV-DNA的抑制作用

目的探讨替芬泰对Hep G2-2.2.15细胞HBV-DNA的抑制作用。方法以Hep G2-2.2.15细胞作为实验模型,通过MTT法检测替芬泰对Hep G2-2.2.15细胞的毒性,确定替芬泰对Hep G2-2.2.15细胞的半数中毒浓度(TC50)。在替芬泰浓度为50μg·ml-1时未见明显的细胞毒性,所以设替芬泰3个剂量组为50、25、12.5μg·ml-1,拉米夫定50μg·ml-1作为阳性对照药,收集给药3、6 d的细胞。用实时荧光定量PCR法检测DNA载量。结果替芬泰对Hep G2-2.2.15细胞的TC50为180.70μg·ml-1。随着替芬泰药物浓度的增加,Hep G2-2.2.15细胞内的HBV-DNA拷贝数相应减少,并有明显的浓度依赖性。结论替芬泰对Hep G2-2.2.15细胞内HBV-DNA有显著的抑制作用,有效浓度为12.5μg·ml-1,最佳浓度为50μg·ml-1。     

猕猴桃根提取物抗肝细胞癌作用及相关机制研究

目的探讨猕猴桃根提取物抗肝细胞癌(HCC)的作用及相关机制。方法选取HCC细胞系HepG2和HUH7,根据猕猴桃根浓度分为0μg/ml(对照组)、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml组。采用噻唑蓝(MTT)和克隆实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡;划痕实验和Transwell实验研究细胞的侵袭和转移;Real-time PCR和Western blot检测相关基因和蛋白表达。结果猕猴桃根对HCC增殖的抑制作用存在剂量和时间依赖性。克隆实验发现,与对照组比较,不同浓度猕猴桃根抑制HepG2和HUH7细胞增殖,且随浓度的增加,抑制作用逐渐增强,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术检测结果发现,与对照组比较,50μg/ml、100μg/ml猕猴桃根促进细胞由G1期进入S期,抑制DNA复制,促进HepG2和HUH7细胞凋亡,差异均有统计学意义(P<0.05)。划痕实验结果发现,与对照组比较,猕猴桃根显著促进HepG2和HUH7细胞迁移,具有剂量依懒性(P<0.05)。猕猴桃根促进Akt基因和蛋白表达,抑制p-Akt表达,抑制Akt磷酸化比例,促进PTEN基因和蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05)。结论猕猴桃根通过p-Akt/PTEN调控HCC细胞增殖、周期停滞及细胞凋亡。     

DDX41蛋白通过活化IRF3抑制乙型肝炎病毒的复制

目的 探讨含DEAD框解旋酶41 (DDX41)基因对乙型肝炎病毒(HBV)复制能力的影响及其作用机制.方法 通过慢病毒包装将稳定过表达DDX41或特异敲低DDX41的短发卡RNA (shRNA)重组质粒转染至HepG2.2.15细胞系,筛选和建立稳定过表达或敲低DDX41的细胞株;通过CRISPR-Cas9技术构建敲除DDX41的HepG2.2.15细胞株;蛋白免疫印迹法检测DDX41蛋白表达水平以及通路验证;酶联免疫吸附法(ELISA)检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)表达水平;实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测HBV复制相关DNA、RNA以及干扰素mRNA表达水平;Noahern印迹法检测HBV总RNA.结果 过表达DDX41可显著抑制HepG2.2.15细胞系中HBV的复制;而敲低或敲除DDX41可显著促进HepG2.2.15细胞系中HBV的复制.过表达DDX41可显著促进干扰素调节因子3(IRF3)的磷酸化和干扰素β(IFN-β)的表达;而敲低或敲除DDX41可显著抑制IRF3的磷酸化和IFN-β的表达.结论 在肝癌细胞系HepG2.2.15中,DDX41蛋白通过促进IRF3的磷酸化并诱导干扰素β的表达,进而发挥抑制HBV复制的功能.     

中国流行的C基因型HBV稳定复制表达细胞系的建立

目的 建立中国流行的C基因型HBV的稳定复制表达细胞系.方法 从1例慢性乙肝患者血清中分离克隆得到1株C基因型病毒DNA全序列,以此为模板扩增产生1.3倍体HBV DNA,包含完整基因组(3.2kb)、从1825位点(polyA)至2599位点大小为775bp的3′端冗余序列,以及至1400位点大小为425bp的5′端冗余序列,将其连接改建重组后的pcDNA3.1(+)载体,构建pN31-51-6-1表达质粒,转染肝癌细胞系HepG2.采用ELISA检测HBsAg、HBeAg的瞬时表达情况,选择双高表达细胞孔进一步行G418筛选稳定表达细胞系.通过ELISA、免疫组化、直接免疫荧光流式细胞术以及HBV复制中间体核心颗粒DNA、细胞内cccDNA、分泌上清中病毒DNA的RT-PCR检测等方法评估稳定细胞克隆的复制表达情况.结果 获得1株具有高抗原表达和高复制能力的细胞克隆HepG2-51-6-1,已稳定传代26代.检测HBsAg、HBeAg吸光度(A)值分别为>3.5和1.29;直接免疫荧光流式细胞术证实细胞表面存在s抗原,免疫组化染色可见细胞内病毒表达.分泌到培养上清中的HBV DNA和细胞内的HBV复制中间体水平分别为2.0×104和5.5×105拷贝/ml,HBV cccDNA为6～8拷贝/细胞.结论 成功获得HBV-1.3倍体转染的C基因型HBV稳定复制表达细胞系,为研究我国流行HBV的生物特性和抗HBV新药筛选奠定了基础.     

增强子Ⅰ对乙型肝炎病毒DNA疫苗免疫应答的影响

目的 研究乙型肝炎病毒（HBV）自身增强子I（enhancerI，ENHI）对HBV DNA疫苗免疫应答的影响。方法 采用PCR法以HBVadr亚型全基因DNA序列为模板分别扩增表面抗原（HBsAg）和HBsA-ENHI基因片段，重组到载体VR1012中，构建两种HBV DNA疫苗，转染CADS-7细胞及HepG2细胞并免疫BALB／c小鼠。采用蛋白印迹、ELISA、ELISPOT等方法检测其在COS-7和HepG2细胞内的表达及小鼠的体液及细胞免疫应答效果。结果 转染的HepG2和COS-7细胞均表达HBsAg;连接ENHI的HBV DNA疫苗转染HepG2细胞后HBsAg表达量明显升高，两种疫苗转染COS-7细胞表达HBsAg无明显差异；免疫小鼠后第2周产生HBsAb及HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL），两种疫苗免疫产生的HBsAb及HBsAg特异性CTL无明显差异。结论ENHI可使HBV DNA疫苗转染HepG2细胞表达HBsAg明显增加，对转染COS-7细胞表达HBsAg及接种BALB／C小鼠引起的免疫应答无明显影响。     

水芹总酚酸对2．2．15细胞分泌HBsAg与HBeAg的抑制作用

目的观察水芹总酚酸对2．2．15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用。方法以2．2．15细胞为研究对象,通过细胞毒性实验确定水芹总酚酸对细胞的最大无毒浓度（TC0）,在最大无毒浓度以下将药物用培养液对倍稀释成500、250、125μg·mL^-1加入2．2．15细胞进行培养,每4d换同浓度药物培养液;分别收集第4、8天以及停药后4d的培养液,酶联免疫法（ELISA）测定HBsAg、HBeAg含量。结果水芹总酚酸最大无毒浓度为500μg·mL^-1,在最大无毒浓度时对HBsAg、HBeAg具有明显的抑制作用,第8天时的抑制率分别为59．33％和90％,半数抑制浓度（IC50）分别为484．17、379．89μg·mL^-1,治疗指数（TI）分别为3．158、4．025,其中对HBeAg的抑制作用优于HBsAg。结论水芹总酚酸对2．2．15细胞分泌的HBsAg、HBeAg有显著的抑制作用。     

苯丙氨酸二肽类化合物073对2．2．15细胞分泌HBsAg和HBeAg的影响

目的观察苯丙氨酸二肽类化合物073对2．2．15细胞分泌HBsAg、HBeAg的影响。方法以2．2．15细胞为研究对象,通过细胞毒性实验确定苯丙氨酸二肽类化合物073对细胞的最大无毒浓度（TC0）,在最大无毒浓度以下将药物用培养液对倍稀释成50、25、12．5μg·mL^-1加入2．2．15细胞进行培养,每4d换同浓度药物培养液;分别收集第4、8天以及停药后4天的培养液上清,酶联免疫法（ELISA）测定HBsAg、HBeAg含量。结果苯丙氨酸二肽类化合物073最大无毒浓度为50μg·mL^-1,在最大无毒浓度时对HBsAg有明显的抑制作用,第8天时的抑制率为59．3％,半数抑制浓度（IC50）为22．9μg·mL^-1,治疗指数（TI）为3．1;但对HBeAg无明显抑制作用,第8天时的抑制率仅为25．5％。结论苯丙氨酸二肽类化合物073对2．2．15细胞HBsAg有显著的抑制作用。     

皱瘤海鞘体外抗乙肝病毒作用的初步研究

目的：研究皱瘤海鞘乙醇提取物的体外抗乙肝病毒作用。方法：用2.2.15细胞株进行抗HBsAg、HBeAg的试验研究。结果：海鞘醇提取物对HBsAg、HBeAg的分泌均呈现较明显的抑制作用，对细胞的毒性低，其治疗指数均在10以上。结论：海鞘醇提取物体具有明显的抗乙肝病毒作用。     

乙型肝炎血清前S1抗原与HBV-DNA和HBeAg相关性分析

目的探讨乙型肝炎血清前S1抗原(PreS1Ag)临床应用的价值。方法对365例乙型肝炎患者血清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HBV血清标志物和PreS1Ag,用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法检测HBV-DNA。结果 HBV-DNA和PreS1Ag的阳性率在110例HBV大三阳中,分别为86.4%和89.1%;在66例HBV小三阳中,分别为36.4%和40.9%;在37例HBsAg、HBcAb中,分别为32.4%和41.7%;在39例HBeAg、HBcAb阳性中,分别为15.4%和15.4%;在113例HBsAb阳性中,分别为5.3%和8.0%。HBeAg、PreS1Ag阳性率随不同载量HBV-DNA升高而增高,但PreS1Ag比HBeAg增高更明显(P<0.05)。结论 PreS1Ag和HBV-DNA一样都是乙型肝炎病毒复制的敏感指标,虽然PreS1Ag和HBeAg都随HBV-DNA载量增加而升高,但PreS1Ag较HBeAg更能敏感,因此PreS1Ag具有重要的临床应用价值。     

PreSlAg、HBeAg和HBV—DNA的对比检测与分析

目的：通过对比检测和分析739份血清中preS1蛋白、HmAg和HBV—DNA的检测阳性率，为临床正确选用实验室指标防治乙型肝炎提供依据。方法：应用ELISA法对739份血清进行PreSlAg和HBV血清标志物检测，并与实时荧光定量PCR检测HBV—DNA结果进行比较。结果：所有739份血清中，PmSlAg阳性率为34．6％（256／739），HmAg阳性率为觚7％（227／739），HBV—DNA阳性率为58.9％（435／739）。227份HBeAg阳性血清中，PreSlAg阳性率55．9％（127／227），HBV-DNA阳性率96．0％（218／227）；512份HBeAg阴性血清中，PreSlAg阳性率25．2％（129／512），HBV—DNA阳性率为42．4％（217／512）。HBeAg、HBV—DNA和PreSl的阳性率有显著差异（P〈0．05），阳性率高低依次为HBV—DNA〉PreSl〉HBeAg；HBeAg阳性血清中PreSlAg（55．9％）阳性率显著高于HmAg阴性血清PreSlAg（25．2％）阳性率（x^2=36．5，P〈0．01）；HBV—DNA阳性血清的PreSlAg检出率58．9％（256／435）显著高于HBV—DNA阴性血清的PreSlAg检出率1＆4％（56／304）（P〈0.01）；PreSl抗原与HBV—DNA阳性符合率为（200／256）7＆1％，阴性符合率为（248／483）51．3％。598份HBeAg阳性血清（阳性率为80．9%，598／739）中HBeAg、PreSl和HBV—DNA阳性数（率）分别是224（37．5%）、253（42．3oA）、417（69．7％）。结论：PreSlAg、HBV—DNA、HBeAg的阳性率有显著性差异（P〈0．05）。作为HBV感染和复制的指标，以检测HBV—DNA最为可靠，而PmSlAg可能较HBeAg更敏感。在HBV感染的不同时期，如何理解和使用上述指标对防治乙型肝炎有重要意义。     

PreS1Ag、HBeAg和HBV-DNA的对比检测与分析

目的:通过对比检测和分析739份血清中preS1蛋白、HBeAg和HBV-DNA的检测阳性率,为临床正确选用实验室指标防治乙型肝炎提供依据。方法:应用ELISA法对739份血清进行PreS1Ag和HBV血清标志物检测,并与实时荧光定量PCR检测HBV-DNA结果进行比较。结果:所有739份血清中,PreS1Ag阳性率为34.6%(256/739),HBeAg阳性率为30.7%(227/739),HBV-DNA阳性率为58.9%(435/739)。227份HBeAg阳性血清中,PreS1Ag阳性率55.9%(127/227),HBV-DNA阳性率96.0%(218/227);512份HBeAg阴性血清中,PreS1Ag阳性率25.2%(129/512),HBV-DNA阳性率为42.4%(217/512)。HBeAg、HBV-DNA和PreS1的阳性率有显著差异(P<0.05),阳性率高低依次为HBV-DNA>PreS1>HBeAg;HBeAg阳性血清中PreS1Ag(55.9%)阳性率显著高于HBeAg阴性血清PreS1Ag(25.2%)阳性率(χ2=36.5,P<0.01);HBV-DNA阳性血清的PreS1Ag检出率58.9%(256/435)显著高于HBV-DNA阴性血清的PreS1Ag检出率18.4%(56/304)(P<0.01);PreS1抗原与HBV-DNA阳性符合率为(200/256)78.1%,阴性符合率为(248/483)51.3%。598份HBsAg阳性血清(阳性率为80.9%,598/739)中HBeAg、PreS1和HBV-DNA阳性数(率)分别是224(37.5%)、253(42.3%)、417(69.7%)。结论:PreS1Ag、HBV-DNA、HBeAg的阳性率有显著性差异(P<0.05)。作为HBV感染和复制的指标,以检测HBV-DNA最为可靠,而PreS1Ag可能较HBeAg更敏感。在HBV感染的不同时期,如何理解和使用上述指标对防治乙型肝炎有重要意义。     

前S1抗原与乙肝标志物检测的对比分析

目的　探讨前S1和HBV M的关系及其临床意义。方法　采用酶联免疫吸附法对 2 90 2份临床血清进行前S1蛋白和乙肝标志物的检测 ,并对检测结果进行比较分析。结果　HBsAg阳性血清 918份 ,前S1抗原检出 4 5 2例(4 9.2 4 % ) ,其中e抗原阳性 2 2 7例 ,前S1检出 2 0 1例 (88.5 4 % ) ,e抗原阴性 6 91例 ,前S1检出 2 5 1例 (36 .32 % ) ,二者相差显著 (P <0 .0 1)。HBsAg阴性血清中未检出前S1。前S1的阳性检出率与HBsAg滴度呈正相关。结论　前S1是HBV复制的可靠指标 ,与乙肝标志物联合检测可相互补充。     

白细胞介素-18逆转录病毒载体的构建及抗乙型肝炎病毒的研究

研究鼠白细胞介素－18（IL－18）基因的转移、表达及其抗乙型肝炎病毒（HBV）的作用。以逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术从受植物凝血素（PHA）和脂多糖（LPS）刺激BALB/c小鼠脾脏细胞中扩增出IL－18的cDNA，并构建表达IL－8基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-IL-18，转染PA317细胞，以逆转录巢式RT－PCR方法，验证细胞培养液上清分泌的假病毒颗粒中IL－18的表达，将假病毒颗粒感染2．2．15细胞，酶联免疫吸附法（ELISA）检测其上清HBsAg和HBeAg，定量检测HBV DNA。成功克隆出580bp的小鼠IL－18全基因并构建逆转录病毒载体，在转染PA317细胞的上清中检测出含IL－18假病毒颗粒，上清感染2．2．15细胞后第3、5、7、14天，HBsAg、HBeAg逐渐下降，到14天时HBsAg已变为阴性，对HBV DNA有明显抑制作用。IL－18能成功地在逆转录病毒载体中表达，并有抑制HBsAg、HBeAg表达的作用。