HIV-1整合酶酶联免疫吸附试验的建立和应用

目的：建立一种检测人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)整合酶的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,用于筛选HIV-1整合酶抑制剂。方法：将质粒F185K／C2280SIN1—288转化到大肠杆菌中,经IPTG诱导表达,柱亲和层析纯化,获得HIV-1整合酶融合蛋白。建立酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。与^3H同位素标记方法比较,     

检测HIV-1逆转录酶活性的ELISA方法的建立

目的　建立检测HIV 1逆转录酶活性的ELISA方法。方法　应用包被的模板和逆转录酶将生物素标记的dUTP掺入 ,用辣根过氧化物酶反应系统检测酶活性。结果　建立了检测HIV 1逆转录酶活性的ELISA方法 ,并与同位素掺入检测法进行了比较 ,用ELISA法检测了PFA等药物对HIV 1逆转录酶活性的抑制作用 ,对ELISA法的重复性、稳定性及用于抑制剂研究的特异性和敏感性进行了评价。结论　HIV 1RT活性的ELISA检测法具有简便、快速、重复性好、特异性强的特点 ,适用于抗HIV 1逆转录酶药物的大样品量筛选工作 ,并可发展成为高通量技术     

检测人博卡病毒抗体间接酶联免疫吸附法的建立及临床应用

目的 建立间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测人博卡病毒(HBoV)抗体,探讨其临床应用的可行性.方法 以重组表达的HBoV融合蛋白VP2作为包被抗原,建立检测HBoV抗体的间接ELISA,优化该检测方法的最佳条件,观察其精密度、敏感度和特异性,并与荧光定量PCR方法对比检测40份临床样本,同时采用免疫印迹法(Western blot)确认其符合率.结果 所建立的间接ELISA最佳抗原包被浓度为2 mg/L,酶标二抗工作浓度为1∶5000,血清标本最佳稀释度为1∶200.该方法平均批内变异系数为6.87%,平均批间变异系数为4.67%.40份临床样本间接ELISA检测结果与荧光定量PCR及免疫印迹结果一致,符合率100%.结论 利用VP2融合蛋白作为抗原,建立的检测血清HBoV抗体间接ELISA方法特异性强、重复性好,可用于HBoV抗体的定量和定性检测.     

影响HIV-1整合酶活性因素的探讨

目的：探讨HIV－1整合酶活性的影响因素,优化其活性测定条件。方法 以同位素标记的寡核苷酸链为底物,体外模拟HIV－1病毒DNA整合过程,检测HIV－1整合酶的3‘端加工,链转移和去整合活性,并考察HIV－1整合酶活性测定中,二价高子、酸碱度、温度和时间等的影响。结果 Mn^2 对整合酶活性的辅助作用,明显强于Mg^2 ,而3‘端加工反应对二价离子的依赖性较小。酸碱度对各种反应的影响较大,温度和时间影响较小。结论 整合酶活性检测的最佳反应条件为pH7.0-7.5,37℃,15mmol/L M^2 及反应时间1h。     

检测人博卡病毒抗体间接酶联免疫吸附法的建立及临床应用

目的 建立间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测人博卡病毒(HBoV)抗体,探讨其临床应用的可行性.方法 以重组表达的HBoV融合蛋白VP2作为包被抗原,建立检测HBoV抗体的间接ELISA,优化该检测方法的最佳条件,观察其精密度、敏感度和特异性,并与荧光定量PCR方法对比检测40份临床样本,同时采用免疫印迹法(Western blot)确认其符合率.结果 所建立的间接ELISA最佳抗原包被浓度为2 mg/L,酶标二抗工作浓度为1∶5000,血清标本最佳稀释度为1∶200.该方法平均批内变异系数为6.87%,平均批间变异系数为4.67%.40份临床样本间接ELISA检测结果与荧光定量PCR及免疫印迹结果一致,符合率100%.结论 利用VP2融合蛋白作为抗原,建立的检测血清HBoV抗体间接ELISA方法特异性强、重复性好,可用于HBoV抗体的定量和定性检测.     

DNA修复基因OGG1融合蛋白表达及多克隆抗体的制备

目的 表达及纯化8羟基脱氧鸟苷DNA糖苷酶-1(OGG1)融合蛋白制备多克隆抗体.方法 在大肠杆菌BL21中诱导表达OGG1融合蛋白,应用Ni-NTA亲和树脂进行纯化.纯化后的OGG1融合蛋白多次免疫大耳白兔,应用Westernb1otting的方法检测抗体活性,间接酶联免疫吸附分析(ELISA)法检测抗体效价.结果 ...     

三种酶联免疫吸附法筛选"渗漏"型SCID小鼠的比较

目的　选择简单的方法筛选“渗漏”型SCID小鼠。　方法　采用 3种酶联免疫吸附法 (双抗夹心ELISA、双抗夹心间接ELISA及生物素 亲和素夹心ELISA)测定SCID小鼠血清中IgG含量。　结果　生物素 亲和素夹心ELISA法灵敏度最高 ,用此法共检测了 4 1只 6～ 8周龄小鼠 ,其中 4 0只的IgG含量为 0 2 4± 0 16mg L ;只有 1只小鼠IgG含量为 2 3mg L ,渗漏比例为 2 4 %。　结论　用生物素 亲和素夹心ELISA法对SCID小鼠“渗漏”进行初筛 ,是简便、敏感、可行的方法     

酶标记A蛋白酶联免疫吸附试验(PPA-ELISA)检测日本血吸虫及弓形虫抗体

<正> 近年来酶联免疫吸附试验(ELISA)已广泛应用于寄生虫病的诊断。本研究应用过氧化物酶标记金葡菌 A 蛋白(PPA)代替羊抗人或羊抗兔 IgG 作 ELISA 试验检测日本血吸虫及弓形虫 IgG 抗体。     

双抗原夹心法检测抗HIV-1/2总抗体方法的建立和评价

目的 进一步提高HIv感染诊断试剂的敏感性。方法 以人工合成的HIv—1 gp41．1(sP1)、gp41．2(sP2)、gp120(sP3)、P24(sP4)和HIV—2gp36(sP5)5条多肽，采用双抗原夹心酶链免疫吸附试验(ELISA)原理，以sP1、sP3、sP4和sP5混合包被酶标板作为因相抗原，辣根过氧化物酶标记sp1、sp2、sP4和sP5多肽为标记物，建立了检测抗HIV—1／2总抗体的双抗原夹心ELISA法。结果 检测卫生部药品生物制品检定所第2代40份质控参比血清，其特异性和灵敏度均为100％，高于间接ELISA法(特异性为90％，灵敏度为65％)。检测210份其他病种患者血清均为阴性，与雅培HIVAB试剂比较检测如份健康献血员血清和88份HIv感染者血清，符合率为100％。结论 本方法特异性强、敏感性高，操作简便，适用于献血员的筛选和临床HIv感染的检测。     

夹心ELISA检测N端利用物因子A(NusA)标签融合蛋白

目的创建基于夹心ELISA原理的定性和定量检测N端利用物因子A(NusA)标签融合蛋白的方法,为NusA标签融合蛋白的鉴定提供新的手段。方法以NusA标签蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,制备特异性识别NusA标签蛋白的单克隆抗体(mAb),常规标记辣根过氧化物酶,方阵法筛选夹心ELISA的配对抗体。结果获得14株NusA标签蛋白特异性mAb并最终确定一对可用于夹心ELISA检测的NusA特异性mAb。以NusA No.1作为捕获抗体, NusA No.10为检测抗体。结论成功建立双抗体夹心ELISA检测NusA标签融合蛋白的方法,检测敏感度可达1.5 ng/mL。     

五种药用石斛内生真菌抑制HIV-1整合酶活性研究

目的 评价5种药用石斛内生真菌发酵产物抑制HIV-1整合酶的活性.方法 将分离自石斛的202株内生真菌提取物共404个采用高通量ELISA法评价其抑制HIV-l整合酶活性;对抑制活性大于100％的样品进行量效关系考察并进行体外抑制肿瘤细胞活性筛选.结果 筛选得到19个对HIV-l整合酶抑制活性大于80％的样品,其中样品5119F、5297F、5097F、5140J和5211F的抑制率分别达到117.96％、113.53％、108.62％、103.74％和109.02％,其对应的IC50值分别为0.02024、0.003125、0.00862、0.01007 和 0.01192 mg/ml.结论石斛属药用植物内生真菌是一个潜在的、丰富的用于筛选HIV-1整合酶抑制剂的资源库,值得进一步研究和开发.     

A high-throughput assay for HIV-1 integrase 3'-processing activity using time-resolved fluorescence

HIV-1 integrase (HIV-1 IN), a well-validated antiviral drug target, catalyzes multistep reactions to incorporate viral DNA into the genome of the host cell; these include both a 3'-processing (3'P) reaction and a strand transfer reaction. These enzymatic activities can be measured in vitro with short DNA oligonucleotides that mimic a single viral LTR DNA end and purified IN. A highly sensitive and reproducible time-resolved fluorescence (TRF)-based assay for HIV-1 IN 3'P activity is now reported. This assay was optimized with respect to time and concentrations of metal ions, substrate and enzyme. The assay has now been used successfully to measure HIV-1 IN 3'P activity and has been shown to detect the anti-IN activity of several known 3'P inhibition compounds accurately. This assay, which is amenable to high-throughput screening, will be useful for identification of additional HIV-1 IN 3'P inhibitors.     

多种单抗联合检测HIV抗原

目的 建立多种单抗联合早期检测HIV抗原的夹心ELISA方法.方法 以SAS盐析沉淀法和亲和层析法纯化抗HIV-1 p24、gp41、gp120及抗HIV-2 gp36的腹水型单克隆抗体(McAb),用高碘酸钠法将纯化的McAb以HRP进行标记.建立针对单个抗原的双抗体夹心ELISA法,对其灵敏度及特异性进行检测.将筛选得到的4株捕获McAb按比例混合作为捕获抗体,4株酶标McAb按比例混合作为检测抗体,建立多种单抗联合检测HIV抗原的夹心ELISA方法,检测混合HIV抗原.结果 按确定的最优反应条件建立的多种McAb联合夹心ELISA方法,检测到的最高稀释度的HIV混合抗原中各抗原的终浓度分别为:重组HIV-1 p24:0.625 pg/ml,gp41:6.25 ng/ml,gp120:6.25 ng/ml;HIV-2 gp36:9.25 ng/ml.结论 建立了具有高度敏感性的鸡尾酒式多种单抗联合检测HIV抗原的夹心ELISA法,为早期榆测HIV抗原提供了新的思路,为后续的研究奠定了一定基础.     

多种单抗联合检测HIV抗原

目的 建立多种单抗联合早期检测HIV抗原的夹心ELISA方法.方法 以SAS盐析沉淀法和亲和层析法纯化抗HIV-1 p24、gp41、gp120及抗HIV-2 gp36的腹水型单克隆抗体(McAb),用高碘酸钠法将纯化的McAb以HRP进行标记.建立针对单个抗原的双抗体夹心ELISA法,对其灵敏度及特异性进行检测.将筛选得到的4株捕获McAb按比例混合作为捕获抗体,4株酶标McAb按比例混合作为检测抗体,建立多种单抗联合检测HIV抗原的夹心ELISA方法,检测混合HIV抗原.结果 按确定的最优反应条件建立的多种McAb联合夹心ELISA方法,检测到的最高稀释度的HIV混合抗原中各抗原的终浓度分别为:重组HIV-1 p24:0.625 pg/ml,gp41:6.25 ng/ml,gp120:6.25 ng/ml;HIV-2 gp36:9.25 ng/ml.结论 建立了具有高度敏感性的鸡尾酒式多种单抗联合检测HIV抗原的夹心ELISA法,为早期榆测HIV抗原提供了新的思路,为后续的研究奠定了一定基础.     

A screening assay for antiviral compounds targeted to the HIV-1 gp41 core structure using a conformation-specific monoclonal antibody.

The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) gp41 plays an important role in membrane fusion between viruses and target cells. The gp41 ectodomain contains two heptad repeat regions adjacent to the N and C-termini. Peptides derived from these two regions, designated N and C-peptides, are potent inhibitors of HIV-1 infection and can interact with each other to form a six-stranded coiled-coil, representing the fusogenic core structure of gp41. A monoclonal antibody was generated, designated NC-1, which specifically binds to the complex formed by the N and C-peptides, but not to the individual peptides. An enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was developed using NC-1 for detecting complex formed by N and C-peptides and for screening of organic compounds for antiviral agents that may interfere with complex formation and inhibit HIV-1 infection. Single point mutations in the C-peptides abolish the complex formation also eliminate their anti-HIV-1 activity. A phenylazo-naphthalene sulfonic acid derivative, designated ADS-J1, was found to inhibit both formation of NC-1 detectable complex and HIV-1-mediated membrane fusion, suggesting that the described ELISA is applicable to rapid screening of libraries of organic compounds for HIV-1 inhibitors targeted to the HIV-1 gp41 core structure.     

A genotypic assay for the amplification and sequencing of integrase from diverse HIV-1 group M subtypes

Recently, the Food and Drug Administration (FDA) of the USA approved the first integrase inhibitor for inclusion in treatment regimens of HIV-1 patients failing their current regimens with multi-drug resistant strains. However, treatment failure has been observed during integrase inhibitor-containing therapy. Several mutational pathways have been described with signature mutations at integrase positions 66, 92, 148 and 155. Therefore, a genotypic assay for the amplification and sequencing of HIV-1 integrase was developed. The assay displayed a detection limit of 10 HIV-1 III(B) RNA copies/ml plasma. As the HIV-1 pandemic is characterised by a large genetic diversity, the new assay was evaluated on a panel of 74 genetically divergent samples belonging to the following genetic forms A, B, C, D, F, G, J, CRF01-AE, CRF02-AG, CRFF03-AB, CRF12-BF and CRF13-cpx. Their viral load ranged from 178 until >500,000 RNA copies/ml. The amplification and sequencing was successful for 70 samples (a success rate of 95%). The four failures were most probably due to low viral load or poor quality of RNA and not to subtype issues. Some of the sequences obtained from integrase inhibitor-na?ve patients displayed polymorphisms at integrase positions associated with resistance: 74IV, 138D, 151I, 157Q and 163AE. The relevance of these polymorphisms in the absence of the signature mutations remains unclear.     

Genotypic antiretroviral resistance testing for human immunodeficiency virus type 1 integrase inhibitors by use of the TruGene sequencing system

A sequencing assay for detection of mutations conferring resistance to human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) integrase inhibitors raltegravir and elvitegravir was developed using the automated TruGene sequencing system. The assay returned clear sequencing results for samples with ≥500 RNA copies/ml for mutation detection and HIV-1 subtyping across a spectrum of HIV-1 subtypes.