真核表达载体pcDNA3.1(-)-转化生长因子β3的构建

目的为研究成纤维细胞基因转染的可行性创造条件，从而为转化生长因子（TGF）83转基因治疗创面与病理性瘢痕的研究奠定基础。方法应用基因重组技术和限制性内切酶酶切构建并鉴定pcDNA3．1（-）-hTGFβ3真核表达载体，经脂质体Lipofectamlne^TM 2000介导质粒转染NIH3T3细胞后应用逆转录．聚合酶链反应（RT—PCR）检测hTGFβ3 mRNA在真核细胞中的表达。结果重组真核表达载体pcDNA3，1（-）-hTGFβ3经限制性内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ酶切，电泳后显示1253hp的hTGFβ3目的片段和5．40kb的pcDNA3．1（-）载体片段，测序证实酶切片段与GenBank中登记的TGFβ3全长序列相同，证实pcDNA3．1（-）-hTGFβ3真核表达载体构建成功，经RT-PCR检测了hTGFβ3在转录水平mRNA的表达情况，表明质粒转染NIH3T3细胞后hTGFβ3 mRNA的表达明显增强。结论重组真核表达载体构建正确，并能在NIH3T3成纤维细胞中表达hTGFβ3 mRNA，为其在创面与病理性瘢痕的转基因治疗奠定了基础。     

骨形成蛋白-2和转化生长因子-β1双基因真核表达载体的构建

目的 构建骨形成蛋白(BMP)-2、转化牛长因子(TCF)-β1双基因真核表达载体.方法 以pGEM-T-BMP-2及pGEM-T-TGF-β1两个质粒为模板,分别用引入新的酶切位点引物,PCR扩增出长度为1188 bp的BMP-2和1 173 bp的TGF-β1两个目基因片段;将其分别定向连入真核双基因表达载体plRES;酶切分析及序列测定重组子.结果 双酶切分析电泳可见长度为1188bp的BMP-2条带和1 173 bo的TGF-β1条带,核酸序列测定证实重组质粒pIRES-BMP-2-TGF-β1构建正确.结论 成功构建了BMP-2及TGF-β1双基因真核表达载体.     

pcDNA3.1-BMP-2真核表达载体构建及转染兔骨髓基质细胞的实验研究

目的 构建人骨形态发生蛋白2(BMP-2)真核表达载体，鉴定并转染兔骨髓基质细胞，为转基因治疗骨缺失疾病提供实验基础。方法 双酶切克隆载体将BMP-2目的基因与真核表达载体pcDNA3．1连接，免疫组化及Western blotting检测转染BMP-2基因骨髓基质细胞的表达效果。结果 成功构建BMP-2真核表达载体，转染骨髓基质细胞后，有BMP-2表达。结论 骨髓基质细胞经基因转染后可以表达BMP-2。为进一步实验研究提供基础。     

转化生长因子-β1及受体在自体血管移植后的表达

我们通过建立自体血管移植动物模型 ,观察转化生长因子 β1 (ＴＧＦ β1 )、转化生长因子 β受体 1 (ＴＧＦ βＲ1 )及ＴＧＦ β1ｍＲＮＡ表达水平的变化并探讨其参与内膜增生的机制。一、材料与方法1 .试剂 :ＴＧＦ β1和ＴＧＦ βＲ1多克隆抗体 (ＳａｎｔａＣｒｕｚ生物技术公司 ) ,即用型ＳＰ试剂盒 (90 0 2 ) (Ｚｙｍｅｄ公司 ) ,原位杂交ＴＧＦ β1ｃＤＮＡ探针 (北京大学分子病理中心 ) ,探针Ｄｉｇ标记及检测试剂盒(ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭｅｎｎｈｅｉｍ公司 )。2 .方法 :Ｗｉｓｔａｒ大鼠 2 4 0只 ,雌雄不限 ,体重 (2 0 0± 30 ) …     

pcDNA3.1(+)-ABCG2真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建人的ABCG2基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-ABCG2,并在ABCG2阴性SMMC7721肝癌细胞中表达.方法 以人的癌细胞为材料提取RNA,经反转录得到cDNA,利用PCR方法,根据人ABCG2基因62526032(NM_004827.2)序列信息设计引物,扩增ABCG2基因的CDS序列,将其克隆到pcDNA3.1+表达载体中.酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至ABCG2阴性SMMC7721肝癌细胞中.采用Western blot法检测外源基因ABCG2的表达.结果 PCR扩增片段大小与理论片段大小相符,酶切大小与理论大小相符,阳性的克隆测序鉴定正确,表明人ABCG2基因克隆及真核表达载体pcDNA3.1(+)-ABCG2构建成功.在蛋白水平,转染72h后的细胞中外源基因ABCG2表达均明显增加.结论 成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-ABCG2,并在ABCG2阴性SMMC7721肝癌细胞中进行了表达.     

转化生长因子-β1反义RNA腺病毒载体的构建

目的构建含转化生长因子β1(TGF-β1)反义RNA的重组腺病毒重组体。方法将TGF-β1的cDNA5＇端630bp片段反向插入穿梭载体pAdTraek-CMV,构建为TGF-β1反义RNA的重组体(pAdTrack-antiTGFβ1),将重组体pAdTrack-antiTGFβ1与包装质粒pAdEasy-1共转染BJ5183细菌。用选择培养基筛选同源重组的阳性克隆,同源重组的腺病毒载体转染293细胞,在荧光显微镜下观察细胞中的绿色荧光蛋白(GFP)及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。结果构建了含rGF-β1反义RNA的重组腺病毒,其滴度为2.4×10     

转化生长因子-β1在脑血管畸形中的表达

转化生长因子 β(TGF β)具有细胞生长与分化、细胞黏连与细胞外基质的形成、修复损伤、免疫调节以及胚胎发育等多种生物学功能[1,2 ] 。小鼠体内实验显示TGF β能快速诱导血管形成,在体外实验中也观察到促进胶原蛋白的形成[3 ] 。我们采用TGF β1RNA狭缝杂交观察TGF β1在脑血管畸形(AVMs)中的作用。一、材料和方法1.标本来源:取自我院和华山医院神经外科(陈衔成教授提供部分标本)手术切除14例脑AVMs及其周围脑组织标本和8例正常脑血管和脑组织标本液氮速冻,-70℃保存。2 .总RNA提取、RNA电泳:用Trizol试剂提取总RNA电泳…     

孕激素调节人成有细胞转化生长因子—β1、β2的表达

目的　研究孕激素对正常成人成骨细胞转化生长因子 (TGF) β1、TGF β2表达的调节作用 ,探讨孕激素治疗绝经后骨质疏松症 (OP)的作用机制。方法　鉴定成人成骨细胞 (hOB) ,测定碱性磷酸酶 (ALP)活性、骨钙素分泌 ,VanGieson氏苦味酸酸性复红染色法进行Ⅰ型胶原染色。hOB用孕酮干预。Northern杂交、ELISA分别检测hOBTGF β1、TGF β2mRNA和蛋白质分泌。结果　观察到hOB分泌的ALP活性为 (74 3± 4 7)mU/mg蛋白 ,培养上清液骨钙素含量为 (3 84± 0 3 9)ng/ml蛋白 ,Ⅰ型胶原染色呈红色。观察到孕酮增强hOBTGF β1、TGF β2mRNA表达呈剂量依赖性 (P <0 0 0 1) ;10 -9mol/L孕酮诱导 12～ 2 4h促进TGF β1、TGF β2mRNA表达 ,呈时间依从性。孕酮促进hOBTGF β1、TGF β2蛋白质分泌呈剂量依赖性 (P <0 0 0 1) ;10 -9mol/L孕酮诱导 12～ 2 4h促进TGF β1、TGF β2蛋白质分泌 ,呈时间依从性。结论　孕激素可能通过诱导成骨细胞TGF β1、TGF β2表达 ,促进成骨细胞增殖与分化 ,增强成骨功能及骨基质合成 ,促进骨形成     

鼠转化生长因子-β1基因的克隆及其在成骨细胞中的表达

目的 克隆鼠转化生长因子－β１（ＴＧＦ－β１）基因并研究其在转染的成骨细胞中表达情况。方法 采用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）可从大鼠淋巴细胞中扩增出１．２ｋｂ特异性片段,经酶切鉴定证实为鼠ＴＧＦ－β１ ｃＤＮＡ。将此片段插入５．４Ｋｂ的ｐｃＤＮＡ表达载体,构建得到６．６Ｋｂ的ｐｃＤＮＡ－ＴＧＦ－β１重组质粒。应用脂质体介导的基因转移技术将ＴＧＦ－β１表达载体导入鼠成骨细胞,４８ｈ后用ＳＡＢ     

肾小管间质纤维化中转化生长因子β1的表达特征

目的 研究大鼠肾小管间质纤维化中转化生长因子β１（ＴＧＦ－β１）的表达特征。方法 以腺嘌呤灌胃法建立大鼠肾小管间质纤维化实验模型,应用免疫组织化学（组化）、逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）、原位杂交及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ检测６只正常及３０只模型大鼠肾组织ＴＧＦ－β１蛋白及基因表达。结果 ６只正常大鼠肾组织ＴＧＦ－β１主要位于皮髓交界处肾小管上皮细胞,ＴＧＦ－β１免疫组化平均阳性表达率为（     

转化生长因子-β1和结缔组织生长因子在慢性胰腺炎组织中的表达及其意义

我们通过建立大鼠慢性胰腺炎 (CP)模型 ,用免疫组织化学技术 ,对转化生长因子 β1(TGF β1)和结缔组织生长因子(CTGF)在CP形成过程中的表达进行动态观察 ,探讨其作用。一、材料和方法1.试剂与仪器 :三硝基苯磺酸Sigma公司产品 ,恒流静脉泵TE 3 11型 ,Teru mo公司产品 ,兔抗大鼠TGF β1单克隆抗体 ,兔抗大鼠Ⅰ型胶原多克隆抗体SantaCruz公司产品 ,兔抗大鼠CTGF单克隆抗体和EnVisionTM试剂盒购自Dako公司。2 .模型制备[1] :48只SD大鼠 (必凯公司 ) ,体重 2 5 0～ 3 0 0 g ,随机分为两组 :(1)CP组 (n =2 4)。氯胺酮 (10 0mg/kg)…     

大鼠小肠转化生长因子β1重组腺病毒载体的构建和表达

目的 构建可调控性大鼠小肠TGF-β1表达的重组腺病毒载体.方法 按RNA提取试剂(TRIzol Reagent)说明书步骤从大鼠小肠组织抽提总RNA,克隆TGF-β1基因;经穿梭载体与可调控性腺病毒载体骨架连接,鉴定后在HEK293细胞包装.获得高滴度病毒后,取上清检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,观察目的 基因的表达情况.结果 扩增出与预期大小一致的cDNA片段,其中TGF-β1大小为1173 bp;其基因序列与GenBank登录的大鼠TGF-β1基因序列完全一致.重组TGF-β1腺病毒获得的滴度约为1012 PFU/ml;病毒包装后绿色荧光蛋白表达的检测结果显示,绿色荧光蛋白随着时间的延长,表达量逐渐增高;与预期结果一致.结论 构建的可调控性大鼠小肠TGF-β1重组腺病毒载体得到了正确表达,为进一步研究TGF-β1干扰树突状细胞分化成熟诱导小肠移植免疫耐受提供了依据.     

大鼠小肠转化生长因子β1重组腺病毒载体的构建和表达

目的构建可调控性大鼠小肠TGF-β1表达的重组腺病毒载体。方法按RNA提取试剂（TRIzol Reagent）说明书步骤从大鼠小肠组织抽提总RNA，克隆TGF-β1基因；经穿梭载体与可调控性腺病毒载体骨架连接，鉴定后在HEK293细胞包装。获得高滴度病毒后。取上清检测绿色荧光蛋白（GFP）的表达，观察目的基因的表达情况。结果扩增出与预期大小一致的cDNA片段，其中TGF-β1大小为1173bp；其基因序列与GenBank登录的大鼠TGF-β1基因序列完全一致。重组TGF-β1腺病毒获得的滴度约为10nPFU／ml；病毒包装后绿色荧光蛋白表达的检测结果显示，绿色荧光蛋白随着时间的延长，表达量逐渐增高；与预期结果一致。结论构建的可调控性大鼠小肠TGF-β1重组腺病毒载体得到了正确表达，为进一步研究TGF-β1干扰树突状细胞分化成熟诱导小肠移植免疫耐受提供了依据。     

输精管阻断对大鼠睾丸转化生长因子β1表达的影响

目的　了解大鼠输精管阻断和阻断解除后睾丸内TGFβ1表达状况。　方法　大鼠 90只 ,随机分为输精管阻断 (VG)组 35只 ,输精管阻断解除 (VOG)组 2 0只 ,假手术组 (SOG) 35只 ,采用免疫组织化学染色和原位杂交技术检测TGFβ1的表达。　结果　VG组从实验第 8周起近基底膜的管周细胞和精原细胞TGFβ1表达较SOG组增强 ,其中 8、16、2 0、2 4周与SOG组相比差异有显著性意义 (P <0 .0 5 )。表达量在 8周后并不随结扎时间延长而改变 ,而是维持在相对稳定的水平。VOG组TGFβ1表达亦较SOG组显著增高。　结论　输精管阻断后TGFβ1表达升高可能是导致睾丸细胞凋亡的原因 ,而阻断解除后TGFβ1水平无明显下降可能是导致生精功能恢复不完全的原因。     

pcDNA3+转化生长因子-β1单独转染及其与pAT153+胰岛素样生长因子-1共转染兔软骨细胞的研究

目的 探讨重组大鼠转化生长因子-β1基因（pcDNA3＋TGF-β1）单独转染及其与重组大鼠胰岛素样生长因子-1基因（pAT153＋IGF-1）共转染兔软骨细胞后细胞增殖及所分泌的TGF-β1因子、IGF-1因子、Ⅱ型胶原的变化。方法 兔软骨细胞体外分别用pcDNA3＋TGF-β1单转染、pcDNA3＋TGF-β1和pAT153＋IGF-1共转染，筛选阳性克隆后，进行原位杂交、免疫组织化学、免疫荧光检测、流式细胞仪检测、^3H．TdR（^3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷）检测。结果 基因转染组与空白组相比，TGF-^31、IGF-1、Ⅱ型胶原的含量均明显提高，空白组、基因单转染组、基因双转染组软骨细胞位于S期的比例分别为5．6％、33．4％、40．1％，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 基因pcDNA3＋TGF-β1、pAT153＋IGF-1转染软骨细胞后，细胞分泌的TGF-Ⅱ1、IGF-1及Ⅱ型胶原显著增多，细胞增殖明显增强，上述基因转染有助于软骨细胞活力的提高；pcDNA3＋TGF-β1和pAT153＋IGF-1双基因共转染软骨细胞后，细胞分裂增生活跃程度及分泌的TGF-β1、IGF-1和Ⅱ型胶原含量高于pcDNA3＋TGF-β1单基因转染，多基因共转染作为将来骨性关节炎基因治疗的方法，其治疗效果可能会优于单基因转染。     

转化生长因子-β1基因转染骨髓基质细胞的瞬时表达与稳定表达

目的 探讨转化生长因子-β1（TGF-β1）基因转染骨髓基质细胞（BMSCs）的表达能力。方法 取6周龄新西兰白兔BMSCs,传代培养后以3μl阳离子脂质体（Lipofectamine):1μg pcD-NA3J-TGF-β1的比例转染,通过免疫组织化学染色及图像分析对3组15份样本检测TGF-β1表达水平;利用水貂肺上皮细胞生长抑制法检测TGF-β1生物活性,分析转染的量效关系和时效关系。结果 瞬时表达组转染后48h免疫组织化学染色部分细胞呈强阳性,稳定表达组全部细胞呈强阳性表达持续4周以上。图像分析显示转染细胞TGF-β1表达显著增强,与对照组比较差异有非常显著性（P＜0．01）。量效关系显示,在转染体系中pcDNA3-TGF--β1(μg）：阳离子脂质体（μl）为1：3时,TGF-β1表达效率最高;时效关系显示,稳定表达组TGF-β1表达活性较瞬时表达组更强。结论 TGF-β1基因转染可使BMSCs有效地表达活性TGF-β1而产生生物效应。     

膀胱癌转移生长因子β1过表达的临床意义

目的探讨膀胱移行细胞癌TGFβ1蛋白及mRNA异常表达的临床意义. 方法采用SP法检测74例膀胱癌组织中TGFβ1蛋白的表达;QRT-PCR方法检测43例膀胱癌TGFβ1 mRNA转录水平. 结果膀胱癌TGFβ1蛋白表达阳性率为89.2%,T2～T4浸润性膀胱癌TGFβ1过表达率为83.8%,明显高于Ta～T1表浅性膀胱癌(33.3%),P<0.05;复发转移组30例中TGFβ1过表达29例,而无瘤存活组44例中过表达30例,P<0.005;膀胱癌组织TGFβ1 mRNA含量明显高于正常膀胱组织. 结论 TGFβ1过表达与膀胱癌浸润生长方式和预后等有密切关系,可能成为评价膀胱癌预后的有效指标之一.     

转化生长因子-β1在慢性同种移植肾病大鼠早期中的表达

慢性同种移植肾病(chronic allograft nephropathy,CAN)是肾移植一年后晚期移植物丢失的主要原因,但其精确的发病机制并不清楚.近年来有研究发现转化生长因子-β1(TG F-β1)直接参与CAN的发病过程[1～3].但关于TGF-β1在CAN发病早期的表达情况报道甚少.我们利用国际标准CAN大鼠模型观察TGF-β1在CAN发病早期中的表达情况.     

LeftyA真核表达载体的构建及其对转化生长因子-β1诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 构建pcDNA3.1-LeftyA真核表达载体,观察其对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)转分化(EMT)的影响.方法 基因克隆技术构建pcDNA3.1-LeftyA真核表达载体,将其瞬时转染HK-2细胞,TGF-β1(10μg/L)刺激后,观察细胞形态变化,检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)基因及蛋白的表达.结果 TGF-β1刺激后HK-2细胞内E-cadherin mRNA和蛋白时间依赖性表达下调,α-SMA mRNA和蛋白时间依赖性表达上调,同时E-cadherin表达变化早于α-SMA;LeftyA蛋白可以显著抑制E-cadherin蛋白的下调表达(P＜0.05),其表达比同时间点单纯刺激组高17.6%;同时可逆转α-SMA蛋白的上调表达(P＜0.05),其蛋白表达比单纯刺激组低14.0%.结论 LeftyA蛋白可以抑制TGF-β1所致的EMT.

Abstract：

Objective To construct the eukaryotic expression vector for LeftyA and study the effects of LeftyA on epithelial to mesenchymal transition of human proximal tubular epithelial cells induced by transforming growth factor-β1 ( TGF-β1 ). Methods The pcDNA3. 1-LeftyA was constructed by recombinant DNA technique. After transfection with pcDNA3. 1-LeftyA HK-2 cells were stimulated by TGF-β1( 10 μg/L). The morphological changes, and the expression of E-cadherin, α-SMA and LeftyA mRNA and protein were observed and detected, respectively. Results TGF-β1 could markedly decrease the expression of E-cadherin mRNA and protein in HK-2 cells induced, and dramatically increase the expression of α-SMA mRNA and protein in a time-dependent manner. Forced expression of exogenous LeftyA led to a blockage of TGF-β1 -induced E-cadherin ( 17.6% ) suppression and α-SMA induction ( 14. 0% ). Conclusion Disruption of cell adherence is the beginning stage of EMT, and overexpression of LeftyA can suppress EMT induced by TGF-β1, which suggests a alprostadil role for LeftyA in TGF-β1-induced tubular EMT and renal fibrosis.