人可溶性CD40L cDNA的克隆及表达

目的: 利用基因技术克隆CD40L分子的胞外区184～831片断cDNA,构建其原核表达载体,从而建立原核表达体系. 方法: 采用RT-PCR 方法从人扁桃体的总RNA中扩增CD40L分子184～831片断的cDNA,以限制性酶切和DNA 测序进行鉴定,并将目的片断克隆至原核表达载体pET-28a ,让重组质粒在BL21中表达,利用Western blot鉴定目的蛋白. 结果: 克隆到人sCD40L分子184～831片断的cDNA,DNA测序结果与报道的完全一致;构建了该片断的原核表达载体, 且目的蛋白能在BL21中表达. 结论: 成功克隆人sCD40L分子184～831片断的cDNA并构建了其原核表达载体. 在BL21中成功表达了目的蛋白.     

人酪氨酸酶相关蛋白-2的cDNA克隆及表达

目的 克隆酪氨酸酶相关蛋白－2（TRP－2）编码基因，表达TRP－2蛋白。方法 从培养的人黑素细胞中提取总RNA，反转录成cDNA，通过PCR方法扩增TRP－2编码基因，克隆至pUC19载体并测序，再亚克隆至谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融全表达载体pGEX-4T-1，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达TRP－2／GST融合蛋白。结果 从培养的人黑素细胞中扩增出编码TRP－2的cDNA，序列测定证实与文献报道的序列一致；成功构建了GST融合表达载体pGEX-4T-1/TRP-2,表达了TRP－2／GST融合蛋白。结论 成功克隆了人TRP－2基因，构建了GST融合表达载体并表达了TRP－2／GST融合蛋白。     

人源脂肪细胞SH2B1β基因的克隆表达

目的获取人源脂肪细胞SH2B1β基因序列,构建SH2B1β-pET28a(+)重组表达质粒,在大肠杆菌中对其进行表达。方法利用RT-PCR方法从人源分化成熟的脂肪细胞RNA中扩增出SH2B1β的cDNA片段,并插入pET28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),通过IPTG诱导表达带6×His标签的融合蛋白。结果PCR和酶切电泳鉴定结果显示SH2B1β基因克隆入载体中,测序结果证实克隆的基因序列与GenBank中的人源SH2B1β序列相符,SDS-PAGE电泳结果表明获得相对分子质量约75000的目的蛋白。结论成功获取了人源脂肪细胞的SH2B1β基因,并在BL21(DE3)中高效表达目的蛋白,为下一步表达纯化SH2B1β重组蛋白及蛋白的初步功能研究奠定基础。     

EBV-LMP1 cDNA的克隆测序与原核表达质粒构建

目的：克隆EBV－LMP1 cDNA，构建EBV－LMP1基因的原核表达重组质粒。方法：通过RT－PCR技术从B95－8细胞中扩增EBV－LMP1 cDNA，克隆至pGEM-T easy载体上并测序；利用引物上的BamH I与HindⅢ酶切位点将LMP1基因插入载体pET-32a，转化JM109菌。提取质粒，限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果：扩增的LMP1 cDNA长度为1158bp，测序结果与已知序列吻合，重组原核表达质粒经酶切鉴定表明获得正确重组子。结论：成功克隆了EBV－LMP1 cDNA，并构建了pET-32a-LMP1原核表达载体，为研究LMP1在EBV致瘤中的作用及肿瘤疫苗奠定了基础。     

人TRAIL分子胞外区的克隆及新型表达载体的构建

目的：利用基因工程技术克隆人TRAIL分子胞外区41－281片断的cDNA，构建其原核表达载体，从而建立原核表达体系。方法：采用RT－PCR方法从人早幼粒白血病细胞系HL－60的总RNA中扩增TRAIL分子41－281片断的cDNA，以限制性酶切和DNA测序进行鉴定，并将目的片断克隆至原核表达载体pQE-80L。结果：克隆到人TRAIL分子41－281片断的cDNA,DNA测序结果与报道的完全一致；构建了该片断的原核表达载体，为后续基因工程研究打下了基础。结论：成功克隆人TRALL分子41－281片断的cDNA并构建了其原核表达载体。     

阴道毛滴虫RRas基因的cDNA克隆和原核表达

目的克隆和表达阴道毛滴虫RRas(TvRRas)基因,以便进一步探讨其组织定位及功能。方法应用PCR方法从构建的阴道毛滴虫cDNA表达文库中扩增TvRRas基因片段,克隆至pGEM-T载体,经PCR、酶切和测序鉴定后亚克隆至原核表达载体pET-41a,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21,经异丙基硫代--βD-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,镍-硝基三乙酸(Ni-NTA)柱纯化表达产物后用SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析鉴定。结果从阴道毛滴虫cDNA表达文库中扩增的TvRRas基因片段长522bp,酶切及DNA测序证实pET-41a/TvRRas重组质粒构建正确,表达融合蛋白分子量约为45000u。结论成功构建重组原核表达质粒pET-41a/TvRRas,并能在大肠埃希菌内表达,所表达的融合蛋白分子量大小与预期一致。     

人硫氧还蛋白还原酶cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：克隆人硫氧还蛋白还原酶(TR)基因并构建原核表达载体，获得TR蛋白。方法：采用反转录聚合酶链式反应(RT—PCR)技术，从人胚脑组织中扩增出TRcDNA片段，克隆至pGEM—T载体并转化大肠杆菌DH5α，获得重组质粒pGEM—TR；经序列分析证实后，提取pGEM—TR重组体，由双酶切得到目的片段，并插入pET9c原核表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组质粒pET—rhTR。异丙基硫代—β—D—半乳糖苷(IPTG)诱导pET—rhTR在BL21中表达，用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及免疫蛋白印迹(Western blot)分析重组蛋白。结果：克隆的TRcDNA与人胎盘组织TRcDNA同源性为99％；pET—rhTR在大肠杆菌中高效表达，目的蛋白占菌体总蛋白量的36％，其分子质量为55ku。TRcDNA序列被GenBank收录，登录号为AF208018。结论：成功克隆了人脑组织来源的TR基因，该基因在大肠杆菌中得到高表达，为进一步研究其功能奠定基础。     

小鼠高迁移率族蛋白1cDNA克隆、原核表达与鉴定

目的:克隆并原核表达小鼠高迁移率族蛋白1(high mobility group box1,HMGB1).方法:从小鼠脾脏细胞中提取总RNA,应用RT-PCR获得小鼠HMGB1cDNA,经PCR扩增小鼠HMGB1基因;通过T-A克隆将该基因构建到PMD-18T载体中,测序鉴定;将该基因插入pET-28a(+)表达载体,IPTG诱导后,可表达相对分子质量约30 kDa的蛋白.蛋白质印迹鉴定表达的目的蛋白.结果:经RT-PCR扩增得到648 bp的DNA片段,序列分析显示与基因库中报道的已知序列完全一致;构建了含有HMGB1编码序列的原核表达载体,经诱导表达、蛋白质印迹鉴定,获得相对分子质量约30 kDa的融合蛋白.结论:成功克隆和表达了小鼠HMGB1基因,为HMGB1蛋白的功能试验奠定了基础.     

人膜联蛋白Ⅴ基因的克隆及原核表达

目的构建人膜联蛋白ⅤcDNA的原核表达载体并诱导其表达。方法利用RT-PCR技术从人胎盘组织总RNA扩增膜联蛋白Ⅴ基因的编码序列,将扩增产物克隆至GST融合表达载体pGEX-2T,以IPTG诱导GST融合人膜联蛋白Ⅴ的表达。结果凝胶电泳显示人胎盘组织PCR扩增产物的分子质量大小与目的片段大小相符。对重组质粒分析表明,插入片段的序列与发表的人膜联蛋白Ⅴ基因编码序列一致。在IPTG的诱导下,BL21重组菌高效表达出一个相对分子质量约为60000的产物。结论人膜联蛋白Ⅴ编码序列已被克隆至GST融合表达载体pGEX-2T。     

人类5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶N端部分的克隆和表达

目的 :克隆人 5 ,10 亚甲基四氢叶酸还原酶 (MTH FR)N端部分编码基因 ,构建重组表达载体并对其诱导表达 .方法 :通过RT PCR方法扩增出人胎肝组织MTHFR的N端部分 1116bp的核苷酸序列 ,克隆于载体pGEM Teasy ,测序分析后亚克隆于表达载体pGEX 4T 2 ,构建重组表达载体pGEX MTHFR(N) .结果 :经过转化E .coliJM10 9和BL2 1后 ,诱导表达出Mr 为 66× 10 3的蛋白 .SDS PAGE分析显示 ,表达量占全菌总蛋白质的 3 1%.结论 :获得了人MTHFR(N)编码基因及其原核表达菌株 ,对研究人MTHFR的生物学功能具有重要的意义 .     

人高迁移率族蛋白1基因的克隆和表达

目的：克隆人高迁移率族蛋白1(HMG—1)编码基因，构建重组表达载体并对其诱导表达．方法：通过RT—PCR方法扩增出人外周血单个核细胞中HMG—1的编码基因，克隆于载体pGEM—T easy，测序分析后亚克隆于表达载体pGEx—4T—2，测序证实序列正确后转化大肠杆菌DH5α，经IPTG诱导4h后可表达M，约56000的融合蛋白GST—HMGl．结果：克隆了人HMG—1的编码基因，构建了融合蛋白的重组表达质粒pGEx—HMGl，表达的融合蛋白产物经凝胶薄层扫描检测，占全菌总蛋白的0．23．结论：获得了人HMG—1编码基因及其原核表达产物，对研究人HMG—1的生物学功能及其mAb的制备具有重要意义．     

人神经营养素-4基因的克隆及表达

目的 通过基因工程的方法扩增人神经营养素-4(hNT-4)cDNA,在大肠杆菌中表达hNT-4,为研究hNT-4的生物学作用提供材料.方法 以人胎脑RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增hNT-4 cDNA,将其插入的质粒pGEM-T中.将经过序列分析确定的hNT-4 cDNA插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组表达载体pGEX-6p-1-NT-4,用SDS-PAGE法测定融合蛋白在大肠杆菌中的表达.结果 经序列测定分析,克隆的hNT-4 cDNA核苷酸序列与已发表序列(GenBank,M86528)完全一致,并获得了高效表达hNT-4的重组菌株.结论 体外成功扩增hNT-4 cDNA,并在原核细胞中高效表达了hNT-4.     

人胰高血糖素样肽-1 cDNA的克隆与表达

目的：克隆人胰高血糖素样肽-1（hGLP-1)cDNA,构建原核表达质粒pGEX-4T-3/hGLP-1cDNA,并诱导表达谷胱甘肽疏基转移酶-hGLP-1(GST-hGLP-1)融合蛋白。方法：采用亚磷酸二酯法合成6个hGLP-1cDNA的寡核苷酸片段,拼接成完整的hGLP-1cDNA,克隆至pBSSK( /-)载体中,经双酶切鉴定和测序后把hGLP-1cDNA定向插入融合基因表达体pGEX-4T-3的多克隆位点上,构建重组质粒pGEX-4T-3/hGLP-1cDNA,并转化大肠杆菌TG1。结果：经限制性内切酶合蛋白GST-hGLP-1,为进一步获得大量可供实验研究和临床应用的重组hGLP-1创造条件。     

克隆人膀胱癌UROC28基因及其原核表达

目的：克隆人膀胱癌UROC28基因并在原核细胞中表达．方法：用RT—PCR从人膀胱癌患组织中扩增UROC28基因cDNA,并克隆到载体pUC-19中．经测序证实后,用HindⅢ／EcoRⅠ双酶切,亚克隆到原核表达载体pGEX—4T—1,并转化E．coli DH5α菌株．取工程菌,用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS—PAGE鉴定．结果：①经RT—PCR、测序和酶切鉴定,成功地克隆了人膀胱癌UROC28基因;②经IPTG诱导的重组质粒pGEX4T—UROC28表达出Mr约为42000的融合蛋白,与预期的结果相符．结论：成功克隆到人膀胱癌UROC28基因,并在E．coli DH5α中表达出GST—UROC28融合蛋白。     

人羧肽酶A1活性中心基因的克隆及原核表达

目的：克隆人羧肽酶A1(carboxyrpeptidase A1，CPA1)活性中心基因，构建重组表达载体并对其进行诱导表达。方法：通过RT-PCR方法扩增出正常胰腺组织中CPA1活性中心基因，克隆入载体pGEM-Teasyr，测序分析．将该目的基因亚克隆于表达载体pGEX-4T-1，测序证实序列正确后转化大肠杆菌DH5α，经IPTG诱导表达重组蛋白。结果：获得了人CPA1活性中心基因，构建了重组表达质粒，表达的蛋白以SDS-PAGE分析，在Mr约46000处出现一条新生蛋白带，经凝胶薄层扫描检测，表达量约占菌体总蛋白的22．1％。结论：成功克隆人CPA1活性中心基因并得到了其原核表达产物，为获得分子量小而具有相似活性的蛋白奠定了基础。     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白—2基因克隆及其在大肠杆菌中 …

目的：克隆恶性疟原虫裂殖子表面蛋白２全基因,并在大肠杆菌中进行表达。方法：采用ＰＣＲ扩增恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ＭＳＰ２基因,克隆插入ｐＵＣ１９,并重组人表达质粒载体中,转化大肠杆菌,诱导重组质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ／ｍｓｐ２表达ＭＳＰ２蛋白抗原,对表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｗｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增出８２４ｂｐＤＮＡ片段,经酶切鉴定和部分序列测定证实为Ｍ     

Migfilin基因的克隆和真核表达载体的构建

目的 克隆Migfilin全长cDNA,构建Flag-migfilin真核表达载体并进行序列测定,为研究migfilin与疾病的关系奠定基础.方法 根据人全长migfilin cDNA序列,设计PCR引物,以人前列腺癌cDNA文库为模板,利用PCR技术克隆migfilin全长cDNA.将扩增出的目的基因克隆至pCR 2.1载体,经Xba I/Hind Ⅲ双酶切后进行重组质粒鉴定,DNA序列测定.将测序正确的目的基因克隆至Flag载体并鉴定.结果 成功克隆了migfi-lin全长cDNA,序列测定表明与已知migfilin基因序列一致.在此基础上,构建了flag-migfilin真核表达载体并进行了鉴定.结论 Flag-migfilin真核表达载体构建成功,为深入探讨migfilin在大肠癌中的作用奠定了基础.     

人bit1 cDNA基因的克隆、测序及表达

目的: 克隆并在大肠杆菌中表达人bit1 cDNA基因. 方法: 从新鲜的胎盘组织中提取总RNA,经反转录成单链cDNA, 以此为模板扩增出人bit1 cDNA基因,将该基因克隆入载体pUC19中,测序正确后亚克隆入表达载体pGEX-4T3中进行表达. 结果: 利用所设计的引物扩增出完整的人bit1 cDNA基因.以大肠杆菌为宿主在IPTG的诱导下获得表达,激光薄层扫描显示表达蛋白占总蛋白的40.6%. 结论: 获得了人bit1 cDNA基因及其原核表达产物,对研究人Bit1蛋白的功能具有重要的意义.