新生大鼠脑缺氧缺血后热休克蛋白表达与KATP通道开放剂的脑保护作用

目的观察KATP通道开放剂克罗吗啉对新生大鼠脑缺氧缺血后热休克蛋白70表达、病理学损伤变化的影响.从基础水平探讨KATP通道开放剂保护脑的作用机制,为其在实际应用上寻求依据.方法实验选用72只7日龄新生大鼠,随机分为4组,分别为缺氧缺血组(结扎左颈总动脉后予8%氧2 h),给药组(缺氧缺血前给予克罗吗啉),正常对照组,假手术组.每组再分为24,48,72 h 3个亚组,共12组,每组6只.每组分别在24,48,72 h用免疫组织化学及苏木精-伊红染色方法检测缺氧缺血和克罗吗啉干预后不同时间点脑皮质热休克蛋白阳性细胞数表达情况及病理学改变.结果干预后24,48,72 h给药组大鼠脑皮质中热休克蛋白70阳性细胞数[(40.87±7.97),(82.25±8.50)(77.75±10.35)个/视野]明显多于缺氧缺血组[(17.25±2.30),(51.75±9.00)(44.37±6.14)个/视野](P＜0.05).干预后24,48,72 h缺氧缺血组大鼠脑皮质中热休克蛋白70阳性细胞数明显多于正常组(P＜0.01).结论KATP通道开放剂对缺氧缺血后脑损伤有保护作用,可能与其诱导神经元热休克蛋白70合成的增加,阻滞了细胞凋亡有关.     

新生大鼠缺氧缺血性脑损伤时血红素氧化酶-1mRNA及其蛋白的表达

探讨新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemia brain damage。HIBD)后海马区血红素氧化酶-1(heine oxygenase-1，HO-1)mRNA和蛋白表达的变化及作用。方法：7d龄sD仔鼠72只，完全随机分为HIBD组和假手术对照组。用原位杂交及免疫组化观测两组在不同时间点海马区HO-1mRNA及蛋白阳性细胞数量的变化。结果：HIBD组右侧海马HO-1mRNA表达4h开始升高(42．8&;#177;6．1，t=25，P&;lt;0．05)，12h达高峰(85．7&;#177;6．4)，48h开始略有下降(67．7&;#177;6．1)，72h后(52．3&;#177;5．2)仍高于对照组(25．0&;#177;5．1，t=9．2，P&;lt;0．01)。HO-1蛋白的表达与HO-1 mRNA表达变化规律相一致。结论：HO-l mRNA及其蛋白表达的增加在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的发病机制中有重要作用。     

促红细胞生成素对大鼠脑组织缺血再灌注海马CA1区神经元的作用

目的：观察促红细胞生成素对缺血再灌注大鼠脑组织海马CA1区神经元数量以及凋亡细胞数量变化、热休克蛋白70表达的影响。方法：实验于2003—03／2004-12在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室完成。选择健康清洁级Wistar大鼠66只，随机分为正常对照组6只、缺血再灌注生理盐水组30只(生理盐水对照组)、缺血再灌注促红细胞生成素组30只(促红细胞生成素治疗组)。线栓法制备大鼠大脑中动脉阻断局灶性脑缺血模型，缺血2h后再灌注，促红细胞生成素治疗组经腹腔按200U／b注入生理盐水稀释的重组人红细胞生成素(200U／mL)，生理盐水对照组经腹腔注入等量的生理盐水。再灌注后观察时相点为2，6，12，24，48h，应用苏木精-伊红染色观察脑海马CA1区细胞数量情况，应用末端脱氧核苷酸转移酶缺口标记法检测海马CA1区神经元凋亡情况，应用免疫组织化学法测定热休克蛋白70表达情况。结果：66只大鼠全部进入结果分析。①脑海马CA1区细胞的计数：生理盐水对照组再灌注后12，24，48h比正常对照组细胞数明显减少[(268．6&;#177;44．5)个／视野。(240．8&;#177;22．5)个／视野，(201．8&;#177;30．7)个／视野，(337．3&;#177;45．3)个／视野，t=2．845—5．587，P&;lt;0．01]，促红细胞生成素治疗组再灌注后12，24，48h比生理盐水对照组细胞数明显增加[(286．7&;#177;33．8)个／视野，(271．9&;#177;30．4)个／视野，(258．3&;#177;29．5)个／视野，t=3．189—5．589，P&;lt;0．01]。②脑海马CA1区凋亡细胞计数：生理盐水对照组再灌注后2，6，12，24、48h比正常对照组脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记阳性细胞数明显增多[(16．5&;#177;3．5)个／视野，(28．4&;#177;6．5)个／视野，(48．8&;#177;7．6)个／视野，(60．7&;#177;10．2)个／视野，(81．6&;#177;12．3)个／视野，(8．8&;#177;2．1)个／视野，t=2．985—6．324，P&;lt;0．01]，促红细胞生成素治疗组再灌注后2，6，12，24，48h比生理盐水对照组脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记阳性细胞数明显减少[(12．7&;#177;3．4)个／视野，(21．5&;#177;5．8)个／视野，(32．7&;#177;4．6)个／视野，(42．8&;#177;6．6)个／视野，(51．8&;#177;9．5)个／视野，t=3．457—6．347，P&;lt;0．01]。③脑海马CA1区热休克蛋白70表达水平：生理盐水对照组再灌注后2，6，12，24，48h比正常对照组热休克蛋白70表达明显增多(0．264&;#177;0．027，0．328&;#177;0．053，0．475&;#177;0．067，0．587&;#177;0．095，0．512&;#177;0．063，0．225&;#177;0．024，t=3．254—6．028，P&;lt;0．01)，促红细胞生成素治疗组再灌注后2，6，12h比生理盐水对照组热休克蛋白70表达明显增多(0．335&;#177;0．033，0．448&;#177;0．055，0．647&;#177;0．078，t=3．262—5．483．P&;lt;0．01)。结论：促红细胞生成素治疗可增加大鼠局灶性脑缺血再灌注组织海马CA1区细胞存活数量，对海马CA1区细胞凋亡具有阻抑作用，使热休克蛋白70表达上调，从而起到了对神经细胞的保护作用。     

氦氖激光与电针穴位刺激对新生大鼠脑缺血缺氧后海马神经元存活的影响

背景：缺血缺氧性脑病(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是引起脑性瘫痪的常见病，目前对其治疗尚未有特效的方法。目的：探讨氮氖激光穴位照射与电针穴位刺激两种疗法对新生大鼠脑缺血缺氧后海马神经元存活、发育及其脑源性神经营养因子(brah-derived neurotrophic factor，BDNF)、胆碱乙酰基转移酶(choline acetyl tranderase，CHAT)表达的作用，比较与分析两种疗法作用的差异，探讨治疗HIBD的新方法。设计：完全随机设计，实验对照研究。地点与材料：研究的地点为第二军医大学和郑州大学解剖教研室。材料为58只7d龄Wistar大鼠(购自河南省实验动物中心)，体质量12—15g，雌雄不拘。干预：随机分为4组：对照组、缺血缺氧组、缺血缺氧后氮氖激光穴位照射组(简称激光组)和缺血缺氧后电针穴位刺激组(简称电针组)。缺血缺氧组-电针组动物参照于晓虹的半球性脑缺血缺氧实验模型法制作左半球缺血缺氧模型，激光组-电针组均选择“大椎”和“百会”穴位分别给予激光照射与电针刺激，22d后取脑作组织切片，HE、Nissl染色以及BDNF和ChAT免疫组织化学染色。主要观察指标：光镜下观察神经元及其尼氏体，检测灰度值与记数ChAT和BDNF阳性细胞以及统计学处理。结果：①对照组海马神经元结构清晰，胞浆内充满深蓝色尼氏体(灰度值122．90&;#177;12．10)；缺血缺氧组海马神经元变性、坏死，尼氏体明显减少(灰度值188．31&;#177;10．43)；激光组-电针组海马神经元变性、坏死以及尼氏体丢失减轻，灰度值分别降低(130．56&;#177;6．16．135．19&;#177;7．00)。②对照组海马ChAT和BDNF免疫阳性细胞数分别为29．74&;#177;4．85和13．42&;#177;5．56；缺血缺氧组海马ChAT免疫阳性细胞数减少(13．96&;#177;7．62)，BDNF免疫阳性细胞稍增多(21．93&;#177;5．12)；激光组海马ChAT和BDNF免疫阳性细胞均显著增多(26．42&;#177;6．02和33．02&;#177;7．58)；电针组海马ChAT和BDNF免疫阳性细胞亦有增加(25．54&;#177;5．05和27．63&;#177;7．15)。③对照组与治疗组神经元灰度值、ChAT和BDNF阳性细胞数差异均有显著性意义(P&;lt;0．05)，且激光组较电针组变化明显。结论：氮氖激光和电针穴位刺激对缺血缺氧后海马神经元具有保护作用，对神经元的存活、发育及其功能具有促进作用；并且氮氖激光效应较电针者为强，这一作用差异的机制推测氮氖激光除与电针共有的生物效应外，是否还兼有改善损伤神经元某些修复酶的作用，有待进一步宴验证宴。     

脑缺血预处理后Caspase-8蛋白的表达与神经元的保护作用

目的：探讨脑缺血预处理后凋亡相关基因Caspase-8蛋白表达与神经元保护作用的关系。方法：雄性Wistar大鼠70只，随机分为对照组（10只)、预处理组(10只)、缺血预处理组(25只)和缺血组(25只)。四血管阻断法复制全脑缺血模型，尼氏和TUNEL染色法观察脑皮质及海马CA1区神经元数和凋亡细胞数，免疫组化方法检测Caspase-8蛋白在缺血预处理后表达变化情况。结果：①缺血7d时，缺血预处理组皮质及海马CA1区神经元数无显著变化[(2.68&;#177;8．5)个／视野]，缺血组神经元数则显著减少[（135.0&;#177;5.6）个／视野]。②缺血预处理组Caspase-8蛋白缺血12h表达升高[(125.6&;#177;9.0)个／视野]，24h达高峰[(167.0&;#177;8.1)个／视野]：缺血组(caspase-8蛋白缺血6h表达升高[(154．2&;#177;18.4)个／视野]，12h达高峰[（222.8&;#177;17.1)个／视野]：各对应时点缺血组Caspase-8蛋白阳性表达细胞较缺血预处理组明显增多。③缺血预处理组和缺血组均在缺血12h皮质及海马CA1区凋亡细胞数开始增多[(15．5&;#177;2．1)，（39.8&;#177;3．9)个／视野]，缺血48h凋亡细胞数达高峰[(68.3&;#177;13.6），(328.4&;#177;24．0)个／视野]，但缺血组凋亡细胞数较缺血预处理组显著增多。结论：全脑缺血可能通过诱导Caspase-8蛋白的表达增多，启动细胞凋亡，导致缺血后神经元凋亡的发生，缺血预处理延缓并降低缺血后Caspase-8蛋白表达并减少细胞凋亡的发生可能是其神经元保护作用机制之一。     

亚低温对缺血再灌注大鼠海马CA1区Bcl-2和Bax表达动态变化的影响

目的：研究脑缺血再灌注后全身亚低温的脑保护作用及其对Bcl-2和Bax表达的动态影响，探讨亚低温脑保护作用的机制。方法：实验于2002-01／12在江苏省麻醉医学研究所(省级重点实验室)完成。实验动物选择126只SD雄性大鼠随机分为假手术组、常温缺血组和亚低温缺血组。采用Pulsinelli四血管阻断法制作大鼠全脑缺血再灌注模型，即刻全身亚低温4h，分别在再灌注后4，8，24，48，72，96h，7d，7个时间点取脑标本，进行Bcl-2和Bax免疫组织化学及苏木精-伊红染色。结果：与常温组相比，全身亚低温组海马CA1区死亡细胞数明显减少[常温比亚低温24h：(195&;#177;18)比(214&;#177;20)个／mm，P&;lt;0．05；48h：(185&;#177;17)比(215&;#177;21)个／min．P&;lt;0．01；72h：(130&;#177;20)比(200&;#177;17)个／mm，P&;lt;0．01)]；Bcl-2蛋白免疫反应强度峰值增高，持续时间延长[灰度值：常温比低温：24h(40&;#177;8比57&;#177;8，P&;lt;0．01)；48h(42&;#177;6比55&;#177;8，P&;lt;0．01)；72h(38&;#177;4比41&;#177;6，P&;lt;0．01)]。Bax蛋白免疫反应强度峰值减低，持续时间缩短[灰度值：常温比低温24h(32&;#177;4比24&;#177;5．P&;lt;0．05)；48h(30&;#177;7比24&;#177;6，P&;lt;0．05)；72h(26&;#177;4比22&;#177;5，P&;lt;0．05)]。结论：全身亚低温对缺血性锥体细胞损害有较好的保护作用。可增强具有抗凋亡的Bcl-2蛋白的表达，延长其表达持续时间，而减弱具有促凋亡的Bax表达，同时缩短其表达持续时间，此可能是亚低温对缺血性脑组织损害产生保护作用的分子机制之一。     

碱性成纤维细胞生长因子及WTp53在大鼠视网膜缺血再灌注损伤中的作用

目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)在大鼠视网膜缺血冉灌注损伤中的作用及其机制。方法：随机将28只大鼠分为正常组和手术组．其中手术组夫鼠左眼为缺血再灌注组，右眼为治疗组(玻璃体腔内注射bFCF]，观察再灌注后不同时间段1，6，12，24，48，72h视网膜组织中细胞凋亡情况及WTp53的表达变化。前房加压法制作大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型。应用末端脱氧核酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记(TUNEL)法检测视网膜组织中凋亡细胞数，免疫组织化学SABC法检测视网膜组织中WTp53蛋白的表达。结果：视网膜神经细胞的凋亡出现于再灌注后6h，并逐渐递增，24h达到高峰，48h开始下降，72h组不明显、WTp53蛋白表达改变与凋亡的神经细胞改变基本致。治疗组各观察指标表达变化规律与缺血再灌注组基本一致，但凋亡细胞数目在6～48h[6，12，14，48h分别为(358.3&;#177;43．4)．(859．5&;#177;12.0)，(1006．5&;#177;49．4)，(695．7&;#177;71.2）个／mm^2]明显低于缺血再灌注组[(444．8&;#177;89．7)，(1053.0&;#177;96．1)，(1254．0&;#177;164．8)，(891.0&;#177;87．2)个／mm^2](t=2．9131～4.299．P均&;lt;0.05)；WTp53表达在6～48h缺血再灌注组显著下降(t=3.342～4.781，P&;lt;0.05；t=52．586，P&;lt;0．01)。结论：WTp53参与视网膜缺血-灌注损伤，促进神经静细胞的凋亡；bFGF可抑制WTp53的表达，减少神经节细胞凋亡，对视网膜缺血再灌注损伤有治疗作用。     

新生鼠缺氧缺血性脑损伤早期肾上腺髓质素mRNA的表达变化

目的：探讨新生鼠缺氧缺血性脑损伤后早期不同时间点肾上腺髓质素基因表达的改变。方法：实验于2004—03／12在天津医科大学毒理实验室和天津市肿瘤医院中心实验室进行。①分组：取80只新生7d Wistar大鼠，随机分为10组，对照组、缺氧缺血0，2，4，6，8，10，12，24，48h组，每组8只。（爹造模：对照组不结扎也不缺氧，其他各组大鼠结扎左颈总动脉2h后置于2500mL密闭玻璃容器中，以2．0L／min的速度输入体积分数为0．08的氧气2h制备大鼠缺氧缺血性脑损伤模型。⑧观察指标：应用反转录-聚合酶链反应方法测定各组大鼠脑皮质肾上腺髓质素mRNA的表达，以肾上腺髓质素mRNA／B—actin比值来表示。结果：经补充后80只大鼠进入结果分析。对照组肾上腺髓质素mRNA少量表达，缺氧缺血4h组明显高于对照组，缺氧缺血后8h表达达到最高峰（0．406&;#177;0．092，0．680&;#177;0．165，1．180&;#177;0．218，P〈0．01），其后下降，缺氧缺血48h组与对照组无差异（0．518&;#177;0．153）。结论：新生大鼠发生缺氧缺血性脑损伤后肾上腺髓质素系统可能参与其后的病理生理过程，且肾上腺髓质素能作为早期判断缺氧缺血性脑损伤的一种诊断标志物。     

水通道蛋白4基因干预对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑水肿的影响

目的：探讨水通道蛋白(aquaporin，AQP)对缺血再灌注损伤后脑水肿形成过程中的影响作用，寻找防治缺血再灌注损伤后脑水肿的新途径。方法：采用完全随机对照方法，应用白行构建的含AQP4基因的真核表达质粒，在大鼠脑内进行预先转染，观察分析转染后大鼠脑内AQP4表达水平、脑卒中后脑水肿程度和大鼠脑卒中后神经功能缺损程度的变化程度，实验分正常健康组、AQP4基因干预组和基因干预对照组。结果：①单纯给予大鼠脑内注射AQP4基因24h后，大鼠的神经功能缺损评分，局部脑组织的含水量均无明显变化。②AQP4基因干预组在大鼠缺血2h再灌注3，12，24h的神经功能缺损评分分别为9．17&;#177;0．72．7．93&;#177;0．69，7．13&;#177;0．89，明显低于基因干预对照组。③再灌注12h伤侧皮质和皮质下脑水肿程度，在AQP4基因干预组分别为79．76&;#177;0．62，80．94&;#177;0．81，明显高于基因干预对照组。④脑内注射AQP4基因后可升高大鼠脑缺血再灌注损伤早期脑内AQP4的表达水平。结论：①单纯提高脑内AQP4的水平并不影响脑组织的含水量。②预先提高脑内AQP4的水平，可加速脑卒中后脑水肿形成和神经功能缺损程度。③改变脑内AQP4水平或活性可以成为新的防治脑卒中后脑水肿形成、减轻脑损伤的靶点。     

大鼠心肌缺血再灌注损伤与热休克蛋白72的保护作用

目的：观察热休克反应(heat shock response，HSR)后0、24、48、96、192h热休克蛋白72(heat shock protein 72，HSP72)表达水平的变化及再灌注后心肌组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)含量、心肌收缩功能变化，探讨HSP72对缺血再灌注心肌保护的可能机制。方法：Wistar大鼠48只．体质量250—300g，雌雄不均，随机分为6组，每组8只。全身高温42℃维持15min制作热休克模型。各组心脏离体逆行灌注．常温下(37℃)缺血25min，再灌注40min。测定缺血前、再灌注后心肌组织SOD含量，心肌收缩功能，观察各组心肌HSP72表达。结果：实验组再灌注后24h和48h心肌组织SOD活性分别为(22．37&;#177;4．75)、(23．39&;#177;4．86)Nu／mg，明显高于对照组。对照组和热预处理后0 h几乎无HSP72表达(面密度)，其表达高峰在热预处理后24，48h。分别为137．89&;#177;25．25，146．09&;#177;28．34，随后逐渐降低，于192h返回基线水平。HSP72表达与再灌注后心肌组织SOD(r=0．9234)，心功能恢复率LVSP(r=0．9012)呈显著正相关(P&;lt;0．05)．结论：热休克蛋白能提高抗氧化酶活性，减轻心肌缺血再灌注损伤。     

实验性大鼠急性脑缺血细胞凋亡与相关蛋白表达的关系

目的：研究大鼠脑缺血再灌注后细胞凋亡及p53，Bcl-2蛋白家族表达的变化，并探讨它们在细胞凋亡中的作用。方法：实验在华北煤炭医学院形态实验室完成。54只大鼠用随机数字表法随机分成3组：脑缺血组(42只)、假手术组(6只)和正常组(6只)。脑缺血组又分为7组：即缺血2h再灌注1，3，6，12，24，48和72h组(n=6)。采用线栓法制作局灶性脑缺血再灌注模型，用TUNEL法检测细胞凋亡的变化，用免疫组化法检测p53，Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。结果：①缺血2h再灌注1h皮质区可见凋亡细胞[(7．83&;#177;1．72)个／高倍视野]，24～48h达高峰[(43．33&;#177;5．20)个／高倍视野，(48．50&;#177;6．25)个／高倍视野]，72h开始下降[(26．67&;#177;3．56)个／高倍视野](P&;lt;0．05，P&;lt;0．01)；缺血2h再灌注1h皮质区可见p53蛋白阳性细胞[(14．35&;#177;1．92)个／高倍视野]，24h达高峰[(48．00&;#177;6．42)个／高倍视野]，48h后开始下降[(31．00&;#177;6．60)个／高倍视野](P&;lt;0．05，P&;lt;0．01)；缺血2h再灌注1h皮质区可见Bcl-2蛋白阳性细胞[(28．62&;#177;6．80)个／高倍视野]，3h达高峰[(56．50&;#177;7．87)个／高倍视野]，6h后开始下降[(45．00&;#177;6．63)个／高倍视野](P&;lt;0．01)；缺血2h再灌注1h皮质区可见Bax蛋白阳性细胞[(45．83&;#177;4．07)个／高倍视野]，24h达高峰[(61．00&;#177;8．88)个／高倍视野]，48h开始逐渐下降[(45．83&;#177;6．49)个／高倍视野](P&;lt;0．05，P&;lt;0．01)。②缺血再灌注后不同时间点细胞凋亡数与p53及Bax蛋白的阳性表达数呈正相关(r=0．843，P&;lt;0．001；r=0．840，P&;lt;0．001)，与Bcl-2蛋白的阳性表达数呈负相关(r=-0．387，P&;lt;0．05)。结论：大鼠脑缺血再灌注后，缺血周边区发生明显的细胞凋亡，同时伴有p53及Bax蛋白表达增加及Bcl-2表达降低，p53及Bax蛋白表达对细胞凋亡起促进作用，而Bcl-2蛋白表达则对细胞凋亡起抑制作用。     

针刺预处理全脑缺血大鼠海马CA1区细胞凋亡和热休克蛋白70mRNA的表达

目的：探讨针刺预处理对全脑缺血大鼠海马CA1区细胞凋亡及热休克蛋白70mRNA表达的影响，并与缺血预处理的效果进行比较。方法：实验于2003—10在黑龙江中医药大学神经解剖实验室进行。取120只Wistar大鼠随机分为5组，每组24只：①正常对照组：不干预。②假手术组：暴露4条血管，不造模。③脑缺血组：四动脉阻断法全脑缺血10min制作大鼠全脑缺血模型。④脑缺血预处理组：预全脑缺血3min，再灌注24h后再次全脑缺血10min。⑤针刺预处理组：术前7d给予针刺，双侧足三里、曲池穴，双侧连接全能脉冲电疗仪，频率为1Hz，电压为2V，30min／次，针刺百会30min／次，1次／d，7d后全脑缺血10min。每组分别于再灌注12，24，48和72h麻醉状态下取材，采用原位缺口末端标记法检测大鼠脑海马CA1区凋亡细胞数，免疫组织化学法检测大鼠脑海马热休克蛋白70阳性细胞数，原位分子杂交技术检测大鼠脑海马热休克蛋白70mRNA表达。结果：经补充后120只大鼠进入结果分析。①脑海马CA1区凋亡细胞数：正常对照组和假手术组无；脑缺血组再灌注12h即可见，且随时间延长逐渐增多，72h仍具有较高水平[（55．87&;#177;10．68）个／mm^2]，而脑缺血预处理组和针刺预处理组各时间点均显著低于脑缺血组（P〈0．05），但两组间无差异（P〉0．05）。②脑海马热休克蛋白70阳性细胞数：正常对照组和假手术组无；脑缺血组少量表达，再灌注24h为高峰[（20．84&;#177;5．93）个／mm^2]，而脑缺血预处理组和针刺预处理组各时间点均显著高于脑缺血组（P〈0．05），但两组间无差异（P〉0．05）。③脑海马热休克蛋白70mRNA阳性细胞数：正常对照组和假手术组无；脑缺血组少量表达，再灌注48h为高峰[（19．44&;#177;5．55）个／mm^2]，而脑缺血预处理组和针刺预处理组各时间点均显著高于脑缺血组（P〈0．05），但两组间无差异（P〉0．05）。结论：针刺预处理的脑保护机制可能与抑制细胞凋亡及上调热休克蛋白70mRNA、热休克蛋白70表达水平有关，其效果与脑缺血预处理相似。     

局灶性脑缺血再灌注中c-Fos，胶质纤维酸性蛋白的表达和神经保护

目的：研究c-Fos和胶质纤维酸性蛋白(glial fibfillary acidic protein，GFAP)在局灶性脑缺血再灌注中的表达，尼莫地平脑保护作用的时机。方法：采用线栓法大脑中动脉闭塞90min加双侧颈总动脉结扎60min造模，18只SD大鼠随机等分为6组：对照组，I-R组，预防组，缺血治疗组，I-R治疗组，再灌注后治疗组。尼莫地平颈内动脉给药，再灌注后24h行脑功能障碍评分，再灌注72h处死测量脑组织梗死体积．并行苏木精一伊红染色，c-Fos，GFAP免疫组化染色。另选18只动物，I-R组9只和I-R治疗组9只各再分为再灌注后2，24和48h，行苏木精一伊红染色，c-Fos，GFAP免疫组化染色。结果：苏木精-伊红染色示预防组，I-R治疗组，再灌注后治疗组较之I-R组缺血半暗区神经元损伤明显减轻。再灌24h后神经功能障碍评分为：缺血治疗组(2．3&;#177;0．8)分≥I-R组(2．2&;#177;1．0)分&;gt;再灌注后治疗组(1．8&;#177;0．6)分&;gt;预防组(1．5&;#177;1．2)分&;gt;I-R治疗组(1．3&;#177;0．5)分&;gt;对照组(0．8&;#177;1．1)分，治疗组中除缺血治疗组外均较I-R组梗死体积小，但较对照组大，差异有统计学意义。治疗组皮质缺血半暗带，海马CA1区GFAP阳性细胞数均较I-R组少(P&;lt;0．05)．但齿状回减少程度较轻；给药后皮质缺血半暗带以及海马各区c-Fos阳性细胞数明显减少。GFAP在再灌注2h大量表达，48h达高峰，且反应性星型胶质细胞居多，72h持续表达；c-Fos 2h反应最为强烈，24h仍大量表达，48h后明显下降，72h少量表达。结论：预防性及再灌注早期尼莫地平动脉给药对局灶性脑缺血再灌注治疗效果较好；反应性胶质细胞对脑缺血后神经元存活起着重要作用；c-fos基因参与了脑缺血损伤的信号转导。     

脑缺血预处理对再次脑缺血大鼠神经功能、脑含水量及脑组织中Bcl-xl和P53蛋白表达的影响

目的：研究脑缺血预处理对再次脑缺血的神经功能、脑含水量以及脑组织中Bcl-xl蛋白、P53蛋白表达的影响，探讨脑缺血耐受引起的脑保护机制。方法：实验于2002-09／2003-10在锦州医学院科学实验中心进行，取48只雄性SD大鼠随机分成3组。假手术组(n=16)：颈部正中切口暴露颈总动脉后缝合皮肤；预处理组(n=16)：按Longa线栓法制成局灶-局灶脑缺血模型，将事先备好的线栓经右颈内动脉人颅插至大脑中动脉；缺血30min后，拔出线栓，缝合血管和皮肤；24h后如上步骤线栓再插至右侧大脑中动脉，再缺血时间为24h：脑缺血组(n=16)：线栓插至右侧大脑中动脉，缺血时间为24h。分别观察3组动物的以下指标：按Bederson6级5分进行神经功能评价；以干湿重法计算脑含水量；用免疫组织化学方法分别检测大鼠额顶叶皮质、海马及纹状体中Bcl-xl蛋白及．P53蛋白的表达。结果：神经功能评分：假手术组为0分，预处理组为(1．12&;#177;0．64)分，脑缺血组为(2．33&;#177;0．98)分，预处理组神经功能评分明显低于脑缺血组(P&;lt;0．05)。脑含水量测定：假手术组为(66．02&;#177;0．49)％，预处理组为(79．13&;#177;0．84)％，脑缺血组为(84．59&;#177;1．19)％，预处理组明显低于脑缺血组(P&;lt;0．05)。蛋白表达检测：预处理组额顶叶皮质、海马及纹状体中Bcl-xl蛋白表达均高于脑缺血组(P&;lt;0．05)，P53蛋白表达均低于脑缺血组(P&;lt;0．01)。结论：预处理组神经功能好于脑缺血组，再次缺血时脑水肿程度减轻，抑凋亡基因bcl-xl表达增多，促凋亡基因P53表达减少，提示缺血预处理后的脑组织耐受性明显增强，对再次缺血产生保护作用。     

电针对成年脑缺血大鼠缺血侧神经干细胞巢蛋白表达的影响

目的：观察电针治疗对成年人鼠脑缺血后缺血侧神经干细胞特异性标记物巢蛋白表达的影响。方法：实验于2003—06／2004—03在广州中医药夫学实验动物中心进行。取清洁级SD雄性大鼠72只，随机分为两组，即模型组（n=36）与电针组（n=36），均采用开颅热凝闭法制作人鼠局灶性脑缺血模型，按缺血时间3，7，14和21d将模型组与电针组又各分为4组，即8个亚组（n=9）。对电针组采用1寸毫针针刺大椎、百会．联接G6805-1型电针治疗仪，选择5～10Hz频率的等幅疏密波，刺激强度以大鼠身体轻微颤动为宜，持续30min。模型组大鼠只予以同等条件抓取，但不实施电针治疗处理。观察不同时相脑缺血情况，采用巢蛋白免疫组化法记录大鼠巢蛋白表达阳性细胞的数量，其数量增加表明神经干细胞的增殖。结果：①模型组脑缺血后不同时相（3，7，14和21d）巢蛋白在缺血侧脑皮质、海马齿状回均有阳性表达细胞[（5．20&;#177;1．70，14．16&;#177;3．95，9．26&;#177;3．29，6．70&;#177;2．27），（13．58&;#177;2．33，20．34&;#177;2．73，13．12&;#177;2．25．8．64&;#177;1．56）1，其中7d的阳性细胞数量比其他时相明显增加，差异显著（P〈0．05）；（爹电针组在不同时相的巢蛋白阳性细胞数量均较同时相模型组有明显的增加（缺血侧脑皮质：11．50&;#177;3．39，26．40&;#177;4．65，18．16&;#177;3．03，12．66&;#177;2．57；海马齿状回：20．04&;#177;3．60，29．26&;#177;3．16，18．78&;#177;2．24，13．52&;#177;2．10），差异显著（P〈0．05）。结论：电针具有促进大鼠脑缺血后巢蛋白在缺血侧阳性表达保持在较高水平的作用.     

肿瘤坏死因子-α在大鼠脑缺血再灌注中的表达及对神经细胞凋亡的影响

目的：观察大鼠脑缺血再灌注损伤后肿瘤坏死因子-α(tumor necmsis factor-alpha，TNF-α)表达及细胞凋亡情况，探讨TNF-α在脑缺血再灌注损伤中的作用。方法：采用大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，分为3组：脑缺血再灌注组大鼠大脑中动脉阻塞2h，再灌注2，6，12，24，48，72，96h、假手术组及永久缺血组，分别测定TNF-α表达(用免疫组织化学法)及细胞凋亡数(原位凋亡检测试剂盒)。结果：脑缺血再灌注组TNF-α表达水平[6h：(15．0&;#177;3．21)个／mm^2，12h：(47．0&;#177;0．87)个／mm^2，24h：(49．0&;#177;10．3)个／mm^2，48h：(44．8&;#177;6．9)个／mm^2，96h:(37．9&;#177;6.4)个／mm^2、细胞凋亡数[2h：(33．3&;#177;0．8)个／mm^2，6h:(56．6&;#177;1．6)个／mm^2，12h:(72．3&;#177;4.2)个／mm^2．24h：(86．6&;#177;5．5)个／mm^2，48h：(96．8&;#177;0．9)个／mm^2]明显高于假手术组(P&;lt;0.01)及永久缺血组(P&;lt;0.05)；且TNF-α表达与细胞凋亡数关系密切(r=0．567．P&;lt;0，01)。结论：大鼠脑缺血再灌注损伤后TNF-α在神经元迟发性坏死中起着重要作用。     

脊髓缺血再灌注损伤后神经元凋亡与热休克蛋白：全部还是部分影响

目的：诱导抗细胞凋亡的热休克蛋白大量表达，观察其对兔热休克模型脊髓缺血再灌注损伤神经元凋亡的影响。方法：实验于2004-06／09在苏州大学附属第一医院骨科实验室完成。6～8个月新西兰大白兔66只，随机分为3组：①热休克组30只，先制成兔热休克模型，24h后再按脊髓缺血再灌注模型操作。②缺血组30只，单纯制成脊髓缺血再灌注模型。③假手术组6只。除不夹闭腹主动脉外，其余操作同缺血组。④实验过程：于再灌注后8，16，24，48，72h 5个时间点热休克组及缺血组各随机抽取6只兔（假手术组6只于8h取出）后肢运动功能进行评分（0分为全瘫，5分为正常）采用Jacob法。后肢运动功能评分后，处死兔并取L2-5。脊髓组织观察热休克蛋白70的表达量行免疫组织化学染色法，观察脊髓神经元凋亡情况采用原位缺口末端标记法染色法。计算脊髓前角神经元凋亡率[凋亡率=阳性神经元数／（阳性神经元数＋阴性神经元数）&;#215;100％]。结果：66只白兔均进入结果分析。①兔后肢运动功能Jacob评分：24，48，72h热休克组明显优于缺血组（t=2．825-2．953，P〈0．05）。②兔脊髓组织热休克蛋白表达情况：8，16，24，48h热休克组表达量显著高于缺血组（t=8．337～20．470，P〈0．01）。③兔脊髓灰质神经元凋亡结果：8，16，24h热休克组明显少于缺血组[（19．73&;#177;3．71）％比（20．87&;#177;3．33）％，（27．29&;#177;4．20）％比（36．05&;#177;5．20）％，（20．64&;#177;4．34）％比（35．28&;#177;4．27）％，（t=3．884～5．462，P〈0．05）]。结论：热休克蛋白可以明显抑制脊髓缺血再灌注损伤后的神经元凋亡，保护脊髓功能。同时提示热休克蛋白不能全方位地抑制神经元凋亡，部分神经元的凋亡对兔后肢运动不产生显著影响。     

促红细胞生成素对全脑缺血再灌注后神经细胞凋亡和诱导型一氧化氮合酶蛋白的影响

目的：观察促红细胞生成素(EPO)对短暂性全脑缺血再灌注后海马CA1区iNOS蛋白表达的影响，探讨其对缺血脑组织保护的可能机制。方法：应用四动脉血流阻断法制作大鼠短暂性全脑缺血再灌注模型；于再灌注开始时经腹腔注射EPO(3000U／kg)；48h灌注取脑。苏木精一伊红染色和TUNEL法染色观察海马CA1区神经细胞坏死和凋亡。应用免疫组织化学方法检测iNOS蛋白的表达。结果：短暂性全脑缺血15min再灌注后48h，苏木精一伊红染色海马CA1区存活神经元细胞数正常组(211．28&;#177;7．95)个／视野，假手术组为(209．28&;#177;11．34)个／视野，EPO治疗组海马CA1区存活神经元细胞数为(170．28&;#177;8．12)个／视野，缺血组为(146．84&;#177;8．35)个／视野。EPO治疗组与缺血组比较差异有显著性意义(P&;lt;0．01)。TUNEL法凋亡细胞测定，正常组无阳性细胞，假手术组阳性细胞(152．48&;#177;18．52)个／视野，EPO治疗组有(1797．51&;#177;151．35)个／视野，缺血组有(2250．41&;#177;180．06)个／视野，两者比较差异有显著性意义(P&;lt;0．01)。iNOS蛋白的表达测定，正常组无阳性细胞，假手术组海马CA1区阳性细胞区灰度值为5．36&;#177;1．54，EPO治疗组为31．80&;#177;6．42，缺血组为49．46&;#177;8．96。EPO治疗组与缺血组比较，两者差异有显著性意义(P&;lt;0．01)。结论：EPO可减少大鼠短暂性全脑缺血再灌注后神经元的死亡和凋亡，抑制iNOS蛋白的表达。     

血管内皮生长因子基因诱导脑梗死大鼠热休克蛋白70变化与其梗死体积的关系

目的：观察血管内皮生长因子165基因治疗大鼠脑梗死前后热休克蛋白70表达的变化，进一步研究热休克蛋白70在脑梗死中的神经保护作用。方法：实验于2003-03／2004-03在郧阳医学院附属太和医院神经科学研究所完成。选择雌性Winstar大鼠40只，常规饲养观察1周后，随机分为正常对照组5只，不造模，余35只造模后分为假手术组5只，单纯梗死组10只，空载质粒对照组10只，血管内皮生长因子基因治疗组10只。采用改进的线栓法制成Wistar大鼠永久性大脑中动脉闭塞模型，空载质粒对照组和血管内皮生长因子基因治疗组用50μL微量进样器进针约3．5mm，分别注入5μL空载质粒和质粒载体与血管内皮生长因子165基因构成的重组DNA到梗死区．7d后断头取脑。用热休克蛋白70免疫组化染色的方法显示脑中的热休克蛋白70的表达情况；用苏木精-伊红染色显示梗死区，用图像分析仪测定梗死面积。结果：40只大鼠全部进入结果分析。①热休克蛋白70的着色部位在神经细胞的细胞浆和细胞膜，黄褐色细胞即为阳性细胞。②热休克蛋白70的表达：正常对照组与假手术组基本相似[(3．00&;#177;0．89)个／高倍视野，(6．31&;#177;0．63)个／高倍视野，(P&;gt;0．05)]，单纯梗死组与空载质粒对照组基本相似[(23．98&;#177;3．25)个／高倍视野，(23．31&;#177;2．77)个／高倍视野，(P&;gt;0．05)]，单纯梗死组比正常对照组和假手术组明显增加(P&;lt;0．01)。血管内皮生长因子基因治疗组均明显高于与各组[(57．60&;#177;3．46)个／高倍视野(P均&;lt;0．01)]。⑧血管内皮生长因子基因治疗组梗死体积百分率[(9．52&;#177;1．99)％]显著低于单纯梗死组(22．31&;#177;4．18)％和空载质粒对照组[(24．48&;#177;3．51)％，P&;lt;0．01]。空载质粒组与单纯梗死组梗死体积百分率比较基本一致(P&;gt;0.05)。结论：血管内皮生长因子基因可诱导热休克蛋白70的表达增高，脑梗死体积百分率降低。说明热休克蛋白70表达增多与脑梗死体积缩小之间有一种正向关系，亦证明其可能是与缺血有关的一种保护性蛋白。     

纳洛酮对缺氧大鼠皮质神经元的保护作用

背景：纳洛酮对脑缺血再灌注损伤细胞的保护作用机制尚不明确。选择体外培养皮质神经元研究纳洛酮疗效可排除多重因素干扰。目的：观察缺氧对体外培养大鼠皮质神经元的影响及纳洛酮的保护机制。设计：重复测量设计。地点和对象：实验地点：军事医学科学院神经生物学研究室。研究对象：体外培养12d的Wistar大鼠皮质神经元。干预：取体外培养12d的Wistar大鼠皮质神经元，随机分为正常对照组、缺氧组、纳洛酮组(缺氧前24h加纳洛酮预处理)；缺氧6h后在常氧下继续培养24h。主要观察指标：观察各种条件下神经元的存活率和形态学的改变，测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量。结果：缺氧后可见神经元胞体肿胀、细胞死亡，LDH渗出量增多[6h：正常对照组为(78．68&;#177;7．34)％，缺氧组为(194．38&;#177;22．32)％；12h：正常对照组为(77．98&;#177;8．85)％，缺氧组为(331．66&;#177;36．12)％]，细胞存活率减少[6h：正常对照组为(91．82&;#177;2．89)％，缺氧组为(66．96&;#177;4．98)％；12h：正常对照组为(90．84&;#177;2．61)％，缺氧组为(32．02&;#177;6．34)％]，差异有显著性意义(P&;lt;0．01)。经纳洛酮预处理的神经元，缺氧后神经元胞体肿胀、细胞死亡程度轻于缺氧组，LDH渗出[6h：(159．86&;#177;34．03)％；12h：(256．28&;#177;28．29)％]显著低于缺氧组(P&;lt;0．01)，而存活率[6h：(78．08&;#177;4．15)％：12h：(53．68&;#177;4．32)％]明显高于缺氧组，差异有显著性意义(P&;lt;0．01)。结论：对缺氧诱导的皮质神经元的损伤，纳洛酮具有明显的保护作用。