人白细胞介素23受体基因的克隆和原核表达

目的:从外周血单个核细胞(PBMC)中克隆人白细胞介素23受体(hIL-23R)编码区序列,构建原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达.方法:分离人外周血单个核细胞(PBMC),提取PBMC的总RNA,应用RT-PCR技术,以PBMC的cDNA为模版,扩增出hIL-23R的编码区(1890bp),将其克隆至pMD 19-T 载体,经酶切和测序鉴定后,亚克隆于pGEX-4T-1中构建原核表达载体pGEX-4T-1-hIL-23R,转化大肠杆菌感受态细胞BL-21(DE3),异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后收集菌体蛋白,经Western-blot对融合蛋白进行鉴定.结果:获得了hIL-23R编码区序列,构建原核表达载体并在大肠杆菌中表达,表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,其相对分子质量Mr为97KDa.结论:成功构建hIL-23R原核表达载体并在大肠杆菌中表达hIL-23R融合蛋白.     

一种新的黑色素瘤相关抗原MAGE-C2的基因克隆及表达

目的:克隆人黑色素瘤相关抗原MAGE-C2的cDNA,构建真核、原核表达载体并转入相应细胞获得表达.方法:采用RT-PCR技术,从直肠癌细胞系SW480的总RNA中克隆了MAGE-C2 cDNA序列,并将开放读框分别插入质粒pEGFP-C1和pGEX-4T-3中,获得pEGFP-MAGE-C2绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体和pGEX-MAGE-C2谷胱甘肽转移酶(GST)融合蛋白表达载体,将pEGFP-MAGE-C2转染293T细胞,观察绿色荧光融合蛋白在细胞中的定位;将pGEX-MAGE-C2转化大肠杆菌BL21株,经IPTG诱导表达GST融合蛋白,并用谷胱甘肽亲和层析法纯化重组蛋白.结果:获得MAGE-C2开放读框并构建表达载体,测序结果与GenBank收录的序列相一致.真核表达载体转染293T细胞后显示MAGE-C2蛋白定位于细胞核;原核重组蛋白大部分以可溶性形式表达,亲和层析后,获得了较高纯度的MAGE-C2-GST融合蛋白.分析显示原核表达GST融合蛋白的相对分子质量为70 000,使用抗GST单克隆抗体进行Western blot分析证实为目的蛋白.结论:成功的获得MAGE-C2基因,构建了其表达载体并获得表达,为进一步制备MAGE-C2特异性单抗及深入探讨MAGE-C2可能参与肿瘤发生发展的机制提供了重要条件.     

hnRNP A2/B1基因的蛋白表达初步探讨

目的：克隆hnRNPA2／B1基因并构建全长cDNA的原核表达载体，在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR法从人平滑肌肌细胞总RNA中克隆hnRNPA2／B1eDNA，连接至pGEX-4T—1载体，构建重组表达质粒，转化感受态E．coli BL21进行诱导表达。结果：克隆hnRNPA2／Bl基因全长eDNA序列，经DNA测序证明与GenBank一致。进而构建重组表达载体PCEX—A2／B1，在E．coli中表达出相对分子量约63kD的融合蛋白，免疫分析证实为hnRNPA2／B1蛋白。结论：成功克隆hnRNPA2／B1基因。在E.coli获得融合表达，为进一步研究其功能及应用提供基础。     

RNF8在前列腺癌细胞中的表达与定位

目的:构建Flag-RNF8真核表达质粒,证实融合蛋白在前列腺癌细胞内的表达与定位。方法:提取人前列腺癌细胞CWR22RV1总RNA,反转录为cDNA。PCR扩增RNF8全长编码区cDNA序列,亚克隆至含有Flag标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到前列腺癌细胞CWR22RV1中,提取细胞蛋白进行Western blot检测,同时利用共聚焦激光扫描显微镜观察Flag-RNF8在CWR22RV1细胞内定位。使用免疫沉淀的方法纯化RNF8蛋白。结果:RNF8蛋白全长编码区cDNA克隆到了真核表达载体pcDNA3-Flag中,酶切鉴定片段约为1500bp。Western blot检测到了融合蛋白Flag-RNF8的表达,分子量约为57kDa。Flag-RNF8在CWR22RV1细胞中表达并定位在细胞核中。成功纯化RNF8蛋白。结论:成功构建了Flag-RNF8全长编码区cDNA的真核表达质粒;鉴定了Flag-RNF8融合蛋白的表达并纯化RNF8蛋白;在CWR22RV1细胞中,Flag-RNF8蛋白主要定位在细胞核中。为进一步研究RNF8的生物学特性及其功能奠定了基础。     

COPS3基因cDNA的克隆及表达

目的:克隆COPS3基因cDNA,构建其原核融合蛋白表达载体并表达和鉴定。方法:从培养的人骨肉瘤细胞系SOSP-9607细胞中提取总RNA,经RT-PCR获得COPS3基因。将该基因克隆到pGEM-T-Easy载体中,酶切及测序鉴定。将COPS3基因插入pET28 a融合蛋白表达载体中,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE分析。免疫印迹法鉴定COPS3蛋白的表达。结果:cDNA测序证明,获得了COPS3基因cDNA,其序列与Genebank中报道序列完全一致。酶切分析表明,成功构建了含COPS3基因的pET28 a融合蛋白表达载体。SDS-PAGE以及免疫印迹法鉴定分析表明,COPS3蛋白获得高效表达,分子质量为51Ku,表达量约占菌体总蛋白的30%。结论:成功克隆和表达了COPS3 cDNA。     

截短的食管癌相关基因ECRG4在大肠杆菌中的可溶性表达及纯化

目的本实验旨在构建ECRG4的原核表达载体，在大肠杆菌中表达并纯化ECRG4所编码的蛋白，为进一步研究奠定基础。方法将ECRG4基因序列前端编码疏水性跨膜区28个氨基酸的cDNA序列截去，再将截短的cDNA序列克隆到原核表达载体Pet30（＋）上，重组表达载体转化感受态表达菌株BL21（DE3），低浓度IPTG低温诱导融合蛋白的表达。采用Western blot鉴定目的蛋白的表达，使用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。结果构建了截短的ECRG4．pET30a（＋）基因的原核表达载体，IPTG低温诱导得到大量可溶性蛋白，并且通过亲和层析纯化了重组融合蛋白。结论成功获得了高效表达的、具有一定的生物学活性的ECRG4原核表达产物，并为进一步研究ECRG4的结构和功能打下基础。     

COPS3基因cDNA的克隆及表达

目的：克隆COPS3基因cDNA,构建其原核融合蛋白表达载体并表达和鉴定。方法：从培养的人骨肉瘤细胞系SOSP-9607细胞中提取总RNA,经RT-PCR获得COPS3基因。将该基因克隆到pGEM-T-Easy载体中,酶切及测序鉴定。将COPS3基因插入pET28a融合蛋白表达载体中,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE分析。免疫印迹法鉴定COPS3蛋白的表达。结果：cDNA测序证明,获得了COPS3基因cDNA,其序列与Genebank中报道序列完全一致。酶切分析表明,成功构建了含COPS3基因的pET28a融合蛋白表达载体。SDS-PAGE以及免疫印迹法鉴定分析表明,COPS3蛋白获得高效表达,分子质量为51Ku,表达量约占菌体总蛋白的30%。结论：成功克隆和表达了COPS3 cDNA。     

食管癌相关基因1编码蛋白的相互作用蛋白筛选

目的　筛选与食管癌相关基因 1(ECRG 1)编码蛋白相互作用的蛋白 ,为其功能研究奠定基础。方法　将编码ECRG 1羧基端 378个氨基酸的DNA序列插入到pGBKT7 DNA BD载体 ,与编码Gal4DNA结合结构域的DNA序列拼接做融合基因 ,将此重组质粒与已克隆到pACT2载体上的人肝脏cDNA文库 (与编码Gal4激活结构域的DNA序列融合 )共转化酵母细胞AH10 9。ECRG 1与相应的人肝脏cDNA片段编码的蛋白发生相互作用后 ,可激活报告基因的表达。排除假阳性后 ,阳性克隆中的文库cDNA进行测序分析。同源性检索搜寻GenBank中与之相同或相似的序列。结果　共转化得到约 3× 10 6个转化子 ,2 3个克隆有报告基因的表达。排除假阳性后 ,得到 2个阳性克隆 ,它们分别编码Miz 1(myc interactingznfingerprotein 1)和FLNA(actin bindingprotein 2 80 )。结论　ECRG 1基因编码蛋白在酵母中可特异性的结合Miz 1和FLNA ,提示ECRG 1可能通过与MIZ 1、FLNA相互作用参与调控细胞周期的运行。     

人存活素cDNA的克隆和原核表达

目的克隆人存活素(survivin)编码区基因并在大肠杆菌中表达。方法采用RT-PCR法得到人存活素编码区cDNA,克隆入原核表达载体pRSETB,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)PlyS,0.1mMβ-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后收集菌体蛋白,经SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定。结果获得人存活素编码区cDNA,构建原核表达载体pRSETB-survivin,转化菌株可表达人存活素蛋白,蛋白分子量约为20KD,蛋白表达量约为菌体总蛋白的13%。Western blot表明融合蛋白能与人存活素多克隆抗体特异性结合。结论获得人存活素编码区cDNA,并在大肠杆菌中表达了人存活素-组氨酸融合蛋白。     

人LY6D基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

目的:构建人LY6D真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达和定位。方法:提取HEK293T细胞的mRNA，反转录为cDNA。PCR扩增LY6D基因的CDS序列，并将其亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。进一步将构建的重组质粒进行酶切和测序鉴定，并转染到工具细胞HEK293T中，提取细胞总蛋白进行Western blot检测。然后利用激光扫描共聚焦显微镜观察LY6D在HEK293T细胞内的定位，最后Q-PCR检测过表达LY6D真核表达载体影响EMT关键基因的表达。结果:LY6D基因cDNA的编码区序列克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中，酶切鉴定片断为387 bp，并进一步测序成功。Western blot检测到了pEGFP-LY6D融合蛋白的表达，分子量约为41 kDa。pEGFP-LY6D融合蛋白在HEK293T细胞中主要定位于细胞膜和细胞质。过表达LY6D真核表达载体减少E-cadherin的表达。结论:成功构建了LY6D基因cDNA的CDS序列的真核表达载体，pEGFP-LY6D蛋白在HEK293T细胞中主要定位于细胞膜和细胞质，LY6D过表达可以降低E-cadherin的表达。     

Survivin基因真核表达载体的构建及其在cos-7中的表达

[目的]克隆人survivin基因并在真核细胞中表达。[方法]以人喉癌组织中提取总RNA为模版，采用反转录聚合酶链RT-PCR法获得survivin cDNA。将该基因克隆到pcDNA3．0载体中，构建真核细胞表达载体pcDNA3．0／survivin，将测序正确的survivin基因通过脂质体介导下转染cos-7,Westem blot检测survivin蛋白在cos-7中表达。[结果]DNA测序证明获得了survivin基因，其序列与GeneBank中报道序列完全一致。Western blot检测survivin蛋白获得高效表达，其相对分子质量为16．5kD。[结论]Survivin基因的克隆和表达均获得了成功，为进一步探讨survivin基因在喉癌诊治中应用奠定了基础。     

CD44基因变异体对人乳腺癌细胞株MCF-7的侵袭作用

目的 探讨一种新的CD44基因变异体(CD44v17)对人乳腺癌细胞株MCF-7侵袭能力的影响及其机制.方法 以人乳腺癌耐阿霉素细胞株(MCF-7/ADR)cDNA为模板,采用聚合酶链反应(PCR)扩增目的片段,将其T-A克隆后,进行测序;构建CD44v17质粒真核表达载体(pcDNA3.1-CD44v17);应用脂质体转染法将pcDNA3.1-CD44v17转染入MCF-7细胞中,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及明胶酶谱法测定转染细胞基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的表达;Transwell法检测CD44v17对MCF-7细胞的侵袭力;Western blot检测胞外信号调节蛋白激酶(ERK)及磷酸化蛋白激酶(p-ERK)变化.结果 限制性内切酶消化证实,重组载体已正确克隆;DNA序列分析显示,CD44v17包含CD44基因1～4号外显子、16～17号外显子、18号外显子1～205位碱基(GeneBank NO.FJ216964).MCF-7细胞转染peDNA3.1-CD44v17后,CD44 mRNA表达量和蛋白表达率分别为0.92±0.22和(70.0±2.5)%;透明质酸(HA)处理后,MMP-2 mRNA表达量和蛋白活性分别为0.72±0.22和1.14.4-0.12,MMP-9 mRNA表达量和蛋白活性分别为0.85±0.19和1.23±0.25,细胞侵袭能力明显增加,侵袭细胞数目为352±33个/视野,而CD44单抗可以阻断这种作用;CD44单抗和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路抑制剂预处理转染细胞后,显著阻断了P-ERK的表达.结论 在MCF-7/ADR细胞中发现CD44v17,并成功克隆和建立pcDNA3.1-CDd4v17;HA与CD44v17受体结合,通过CD44→ras→MAPK信号传导通路调节MMP-2和MMP-9的表达,从而增加MCF-7细胞的侵袭力.     

人黑色素瘤抗原MAGE-3 肿瘤疫苗的构建及其诱导HLA-A *0201 转基因小鼠CTL活性的观察

 目的 通过基因工程的方法获得人黑色素瘤抗原MAGE-3的DNA和蛋白疫苗，并观察其对HLA-A＊0201转基因小鼠的CTL活性的影响。方法 用RT-PCR的方法，从人黑色素瘤细胞株A375中扩增MAGE-3的cDNA片段，分别将其插入到pcDNA3．1／v5-His真核扣pET32a原核表达载体。将pcDNA-MAGE-3转染B16肿瘤细胞观察其是否能在真核细胞中表达；将pET32a-MAGE-3转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，SDS-PAGE观察融合蛋白表达情况。并用镍柱亲和层析的方法纯化融合蛋白。然后，采用DNA疫苗初次免疫和蛋白疫苗加强的策略免疫HL-A＊0201转基因小鼠，LDH方法检测CTL活性。结果 酶切结果证实，成功地构建了pcDNA-MAGE-3真核表达载体和pET32a-MAGE-3原核表达载体，并在真核细胞B16和原核细胞大肠杆菌中获稳定表达，原核表达产物为融合蛋白且分布于包涵体。用DNA疫苗进行初次免疫，镍柱纯化的融合蛋白加强免疫后，可成功地诱导HL-A＊0201转基因小鼠CTL活性。结论 成功地获得了MAGE-3肿瘤抗原，为进一步完善MAGE-3肿瘤疫苗打下了基础。     

pcDNA3.0/PNP-CD和pcDNA3.0/PNP表达载体的克隆和表达

目的 :构建新型PNP/Mep dR自杀基因系统的融合和单基因表达载体。方法 :利用DNA重组技术制备融合自杀基因PNP CD ,将其和PNP单基因分别插入真核表达载体pcDNA 3 0中 ,构建融合与单自杀基因表达载体pcDNA 3 0 /PNP CD和pcD NA 3 0 /PNP ;酶切、PCR及测序鉴定两重组体。结果 :成功构建了两个新型自杀基因载体并实现在HepG2肝癌细胞株中的表达。结论 :两个新型自杀基因表达载体 ,尤其是PNP CD融合自杀基因载体 ,是肿瘤基因治疗中广谱、高效的治疗载体。     

S100A13 基因真核表达载体的构建及其在COS-7 细胞中的表达

 目的 构建以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的重组表达质粒pcDNA3.1/NT-GFP-S100A13,观察S100A13基因在COS-7细胞中的表达及定位。方法 采用克隆和亚克隆技术构建S100A13基因真核表达载体,脂质体介导转染COS-7细胞,RT-PCR和western-blot验证其mRNA和蛋白的表达,荧光显微镜观察该基因亚细胞定位。结果 酶切和测序结果证实重组质粒含有S100A13编码区序列且插入方向正确,转染后观察该基因亚细胞定位于全胞浆。结论 成功构建了S100A13基因真核表达载体,该基因在COS-7细胞中成功表达,S100A13基因表达定位于全胞浆。     

VEGFR-3胞外区基因真核表达载体的构建-与鉴定

目的构建VEGFR-3胞外区基因真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,并在体外进行表达和鉴定。方法采用 RT-PCR技术,扩增C57BL/6小鼠胚胎VEGFR-3胞外区cDNA片段,通过基因重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组质粒pcDNA3.1-VR-3。经限制性酶切鉴定和DNA 序列测定结果证实后,将重组质粒经脂质体法转染COS-7细胞, Western blotting检测其蛋白表达。结果克隆了C57BL/6小鼠胚胎VEGFR-3胞外区cDNA片段,并构建了真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,Western blot 证实目的基因可在COS-7细胞中表达。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,可在真核细胞内正确表达,这为进一步的动物实验奠定了基础。     

人NY-ESO-1基因的原核表达、纯化和初步应用

目的：克隆人NY-ESO-1基因，进行原核表达和分离纯化，并初步应用于肝癌患者血清NY-ESO-1抗体的检测。方法：通过RT-PCR技术从人肝癌组织中扩增NY-ESO-1基因片段，插入原核表达载体pGEX4T-1( )中，构建重组表达质粒pGEx／ESO1，导入大肠杆菌BL21(DE3)，诱导目的蛋白表达，经包涵体透析复性和GSTrap亲和层析纯化目的蛋白，Westem blot鉴定。应用间接ELISA方法初步检测50例肝癌患者血清和20例正常人血清NY-ESO-1抗体的表达。结果：扩增得到NY-ESO-1基因3′端276bp片段，与GeneBank公布序列一致，构建的pGEX／ESO1原核表达质粒经IPTG诱导，在大肠杆菌中表达分子量约36kD的GST-ESO1融合蛋白，纯化后蛋白纯度为90％。50例肝细胞癌患者血清中4例检测到NY-ESO-1抗体(8％)，正常人血清均为阴性。结论：成功构建pGEX／ESO1重组表达质粒，得到有活性的NY-ESO-1融合蛋白，对肝癌患者血清NY-ESO-1抗体的检测有-定的应用价值。     

T-bet对小鼠巨噬细胞(Raw264.7)生物学功能的影响

背景与目的:T-bet(TboxexpressedinTcells)是一种特异性调控Th1淋巴细胞的核转录因子,它广泛调控多种免疫细胞(如Th1、NK、CD8 、DC、B细胞等)的生物学活性。本研究观察转染小鼠T-bet基因(pcDNA3.0-mT-bet)对小鼠巨噬细胞Raw264.7生物学功能的影响。方法:构建含T-bet的真核表达载体pcDNA3.0-mT-bet,通过双酶切鉴定及测序、PCR鉴定其准确性,RT-PCR及Westernblot检测其在Raw264.7细胞中的表达。以PBS、pcDNA3.0空载体作为对照,将其瞬时转染入Raw264.7细胞,48h后观察其对细胞周期、细胞表面分子MHCⅠ/Ⅱ表达的影响,以及对FITC-右旋糖酐(FITC-dextran)的吞噬能力、一氧化氮(nitricoxide,NO)分泌水平及T-bet对小鼠白血病细胞L1210的杀伤活性。结果:载体pcDNA3.0-mT-bet构建成功并在Raw264.7细胞中表达;T-bet对Raw264.7细胞周期没有影响(P>0.05);经T-bet修饰后,细胞表面MHCⅠ类分子的表达(24.8±0.6)高于空载体组(20.8±0.7),有统计学意义(P<0.05);但两组间MHCⅡ类分子的表达无显著性差异(P>0.05)。T-bet修饰组吞噬Dextran的平均荧光强度(32.8±0.8)高于空载体组(28.2±0.4),有统计学意义(P<0.05)。在无脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激时,T-bet组NO的产生量[(1.7±0.6)pmol]高于空载体组,两组相比差异有显著性(P<0.05);经10μg/mlLPS持续刺激20h后,T-bet组NO的产生量[(15.6±1.6)pmol]显著高于空载体组[(10.5±1.3)pmol](P<0.05)。pcDNA3.0-mT-bet对L1210细胞的体外杀伤活性[(51.9±3.5)%]明显高于空载体组[(35.6±2.1)%],差异有显著性(P<0.05)。结论:T-bet可诱导Raw264.7细胞表达MHCⅠ类分子,增强其对Dextran的吞噬能力,促进其分泌NO,增加其对L1210细胞的杀伤活性,但对其细胞周期及MHCⅡ类分子的表达无影响。