PIB基因点突变与淋病奈瑟菌对青霉素和四环素耐药相关性的研究

目的:了解浙江地区分离的淋病奈瑟菌临床菌株对青霉素和四环素的耐药率及该菌PIB基因G120和A121点突变与青霉素和四环素耐药性的关系。方法:采用高保真PCR扩增25株淋病奈瑟菌PIB基因序列,T-A克隆后测序。分析测序菌株PIB基因中与耐药性密切相关的G120和A121变异情况,采用二倍琼脂稀释法确定PIB菌株的耐药性。结果:25株淋病奈瑟菌临床菌株对青霉素和四环素均耐药,耐药率为100%。经测序的25株PIB淋病奈瑟菌中,1株(4.0%)G120或A121均未突变,其对青霉素和四环素的M IC分别为8μg/m l和4μg/m l。5株(20.0%)G120D/N突变而A121不变,1株(4.0%)G120不变而A121G突变,2株(8.0%)G120N突变但A121缺失,16株(64.0%)G120K和A121D双位点突变。24株G120和/或A121突变的PIB菌株均对青霉素和四环素的M IC为4~128μg/m l不等。结论:浙江地区分离的PIB型淋病奈瑟菌对青霉素和四环素的耐药率为100%。上述淋病奈瑟菌对青霉素和四环素的耐药与PIB基因氨基酸序列G120和/或A121突变密切相关。     

淋病奈瑟菌临床菌株porB基因分型及其突变与耐药相关性研究

目的:分析本地区淋病奈瑟菌临床菌株porB基因分型特点及其Gly120和Ala121突变与耐药性关系。方法:多重PCR扩增非产酶淋病奈瑟菌临床菌株porB基因、测序分析Gly120和Ala121突变,并与药敏试验比较。结果:154株非产酶淋病奈瑟菌临床菌株中,porB1A型和porB1B型临床菌株分别占29.9%和70.1%。porB1A型菌株均出现Gly120Asp/Ala121Gly双突变,对青霉素和四环素的耐药率分别为15.2%和10.9%;95.4%porB1B菌株存在出现Gly120和/或Ala121突变,耐药率分别为99.1%和97.2%,其中4株porB1B菌株121和122位氨基酸存在删除突变的菌株对青霉素和四环素的MICs分别高达为8 mg/L～16mg/L和8 mg/L。结论:建立的多重PCR可用于淋病奈瑟菌porB基因分型。本地区流行的非产酶淋病奈瑟菌主要携带porB1B基因,不同基因型临床菌株对抗生素的耐药率有显著性差异(P<0.05)。Gly120和/或Ala121突变增强耐药性仅限于porB1B菌株。     

80株淋球菌分离株青霉素耐药性与penA及ponA基因的关系

目的探讨淋球菌青霉素耐药性与青霉素结合蛋白1基因和2基因（ponA、penA）突变的关系。方法采用琼脂稀释法对淋球菌临床分离株进行青霉素敏感性测定，分别运用聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）和PCR-限制性片段长度多态性（RFLP）对淋球菌penA及ponA基因进行分析。结果在检测出的80株淋球菌临床分离株中，所有菌株的penA基因均发生了（Asp345A）的插入突变，而菌株表现出对青霉素不同程度的耐药性；通过RFLP分析检测出有近93．7％的菌株发生了ponA基因第421位氨基酸由亮氨酸变成脯氨酸（Leu421→Pro）的突变。同时研究还表明所有的PPNG菌株也可同时发生penA基因的突变，除2例ponA基因未突变外，94．4％（34／36）的PPNG可发生ponA基因的突变。结论在淋球菌流行株中染色体介导和质粒介导两种方式协同作用造成了淋球菌对抗生素的高度耐药性。     

淋病奈瑟菌pI优势基因型及其G120/A121突变与耐药性关系

目的 分析浙江省上虞地区淋病奈瑟菌临床菌株外膜孔蛋白优势基因型及其G120和A121突变与耐药性关系.方法 建立能同时检测pIA和pIB基因的双重PCR.目的 扩增产物T-A克隆后测序,以分析G120和A121突变情况及证实双重PCR的检测特异性.采用酸性纸片法和二倍琼脂稀释法,分别检测pIA~+和pIB~+菌株产β-内酰胺酶情况以及对6种抗生素的耐药性.结果 多重PCR可准确地对所有受检淋病奈瑟菌临床菌株进行porin I(pI)基因分型,其检测灵敏度为1 ng DNA模板.116株淋病奈瑟菌临床菌株中,30.2%(35/116)为pIA~+菌株,69.8%(81/136)为pIB~+菌株.所有pIA~+菌株出现G120D/A121G双突变(88.6%)或A121G单突变(11.4%),98.8%pIB~+菌株出现G120K/A121D(65.0%)、G120K/A121G或G120N/A121D(13.8%)双突变以及G120D/N/K单突变(21.3%).34.5%(40/116)菌株产β-内酰胺酶,其中pIA+菌株产酶率(20%)明显低于pIB~+菌株(40.7%)(P＜0.05).上述临床菌株对青霉素、四环素、环丙沙星和阿奇霉素耐药率高达75.0%～90.5%,仅有3株菌株对头孢曲松耐药,未发现大观霉素耐药菌株.100%和71.4%不产β-内酰胺酶、G120和/或A121突变pIA~+菌株分别对青霉素和四环素敏感,但不产β-内酰胺酶G120和/或A121突变的pIB~+菌株对该2种抗生素耐药率均为100%.结论 所建立的多重PCR可用于淋病奈瑟菌pI基因快速和准确分型.上虞地区流行的淋病奈瑟菌主要携带pIB基因.大观霉素和头孢曲松仍可作为治疗淋病的首选药物.G120和/或A121突变增强对青霉素和四环素耐药性仅限于pIB~+菌株.     

广州地区人巨细胞病毒临床低传代病毒株<i>UL142</i>基因的序列特征分析

目的探讨广州地区人巨细胞病毒(HCMV)临床低传代病毒株UL142基因的序列特征。 方法选取2014年3月至2015年12月在广州医科大学附属广东省妇儿医院儿科就诊的10例HCMV症状性感染患儿的尿液标本为研究对象。将从HCMV症状性感染患儿尿液标本中分离出的病毒株进行多重PCR鉴定,对UL142基因全序列克隆到pMD18-T载体上扩增并将产物进行测序,将测序结果提交GenBank并与GenBank收录的其他10株HCMV病毒株的UL142基因进行比对分析。 结果从广州地区HCMV症状性感染患儿尿液中成功分离2株HCMV临床病毒株,分别命名为HCMV D2和D3;克隆测序后由GenBank收录,收录号分别为DQ180384和DQ180370。各HCMV病毒株的UL142基因同源性比对分析发现：UL142基因序列较保守,有69处碱基发生变异,且均为点突变,无插入及缺失突变;编码蛋白的氨基酸残基为306个,序列也较保守,其中28处点突变导致编码氨基酸的改变,其余点突变均未导致编码氨基酸改变。不同HCMV病毒株中UL142基因所编码的氨基酸变异率为0.9%～6.5%。各HCMV病毒株UL142基因编码蛋白的二级结构的氨基酸数目不同,但所有HCMV病毒株UL142基因编码蛋白的等电点均在6.48～8.27。 结论广州地区HCMV临床低传代病毒株ULl42基因序列及其编码产物的氨基酸序列均较为保守,但仍存在一定的多态性,这提示UL142基因在HCMV感染与致病机制的研究中可能具有重要作用。     

广州地区人巨细胞病毒临床低传代病毒株UL142基因的序列特征分析

目的探讨广州地区人巨细胞病毒(HCMV)临床低传代病毒株UL142基因的序列特征。方法选取2014年3月至2015年12月在广州医科大学附属广东省妇儿医院儿科就诊的10例HCMV症状性感染患儿的尿液标本为研究对象。将从HCMV症状性感染患儿尿液标本中分离出的病毒株进行多重PCR鉴定,对UL142基因全序列克隆到pMD18-T载体上扩增并将产物进行测序,将测序结果提交GenBank并与GenBank收录的其他10株HCMV病毒株的UL142基因进行比对分析。结果从广州地区HCMV症状性感染患儿尿液中成功分离2株HCMV临床病毒株,分别命名为HCMV D2和D3;克隆测序后由GenBank收录,收录号分别为DQ180384和DQ180370。各HCMV病毒株的UL142基因同源性比对分析发现:UL142基因序列较保守,有69处碱基发生变异,且均为点突变,无插入及缺失突变;编码蛋白的氨基酸残基为306个,序列也较保守,其中28处点突变导致编码氨基酸的改变,其余点突变均未导致编码氨基酸改变。不同HCMV病毒株中UL142基因所编码的氨基酸变异率为0.9%~6.5%。各HCMV病毒株UL142基因编码蛋白的二级结构的氨基酸数目不同,但所有HCMV病毒株UL142基因编码蛋白的等电点均在6.48~8.27。结论广州地区HCMV临床低传代病毒株ULl42基因序列及其编码产物的氨基酸序列均较为保守,但仍存在一定的多态性,这提示UL142基因在HCMV感染与致病机制的研究中可能具有重要作用。     

中国黄热疫苗减毒株和世界卫生组织黄热疫苗标准株基因全序列分析

目的研究中国黄热疫苗生产用减毒株与世界卫生组织（WHO）黄热疫苗标准株的基因序列,了解其核苷酸序列变异程度,和与其相关的氨基酸是否发生突变。方法根据基因库（GenBank）中收录的黄热病毒（Yellow Fever Virus,YFV）17D序列设计引物,提取该两株YFV的核酸,逆转录后进行聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）扩增病毒各部分基因片段,PCR产物纯化后直接测序,5＇和3＇端TA克隆后进行测序,然后进行遗传进化分析。经核苷酸序列测定进行序列比对分析。结果经序列测定后,进行两株YFV的序列比对,并与GenBank中收录的其它相关YFV17D疫苗株和野毒株进行序列比对,发现中国黄热疫苗生产株与WHO黄热疫苗标准株间的核苷酸序列并未发生较大变异,核苷酸和氨基酸的同源性分别约为99%和99%。其重要病毒抗原E蛋白也未发生较大突变,但发现E区与毒力密切相关的173位氨基酸发生回复突变,进一步通过系统发生分析说明两者亲缘关系十分接近。结论传代过程中,中国黄热疫苗株和WHO黄热疫苗标准株在基因水平上除个别外未发生较大改变,其基因组具有一定的稳定性。     

淋病奈瑟氏菌对环丙沙星耐药性与喹诺酮类耐药决定区突变的关系

目的了解上海地区淋球菌流行株对喹诺酮类抗生素的敏感性,探讨淋球菌耐药株gyrA与parC基因突变与淋球菌耐氟喹诺酮类药物之间的关系.方法采用琼脂扩散法对淋球菌临床分离株对行喹诺酮类抗生素敏感性测定,同时运用PCR技术扩增gyrA基因和parC基因的喹诺酮类耐药决定区,并对典型株的PCR产物直接进行测序分析.结果所分离的80株菌株对环丙沙星MIC为敏感、中介、耐药分别为1株、3株和76株;产物测序结果显示淋球菌敏感株只检出了gyrA基因在Asp95处的单位点突变;中介及耐药株在gyrA基因均检出有Ser-91→Phe突变并伴有Asp95或者Ala92位突变;6株检出有parC基因的86、87、91位点突变及其他位置的一些无义突变.结论gyrA基因突变是淋球菌耐喹诺酮类抗生素的重要机制,其中Ser-91→Phe更是引起对喹诺酮类耐药非常关键的突变,而parC基因的突变只会伴随gyrA基因突变同时出现,可能会对淋球菌耐喹诺酮类抗生素起促进作用.     

人巨细胞病毒临床分离株的鉴定及UL148基因分析

目的:研究广州地区先天性感染患儿体内人巨细胞病毒(HCMV)临床低传代分离株的鉴定及其UL148基因的序列特征分析。方法:收集广州地区感染HCMV的新生儿尿液标本,从中分离低传代临床病毒株,应用多重PCR方法鉴定,对其进行UL148基因全序列扩增,扩增产物克隆到pMD18-T载体后进行序列测定及分析。结果:成功分离出3株HCMV低传代病毒株(D2、D3、D52),经鉴定后的UL148基因序列被GenBank收录,序列号为:DQ180380,DQ180363和DQ180354。序列分析显示,3株临床分离株中UL148序列高度保守;在UL148全基因序列951个核苷酸中,所有变异均为碱基替换,无插入及缺失突变;编码蛋白由316个氨基酸残基组成,氨基酸序列也比较保守,各分离株中变异率为0.3%～1.9%;编码蛋白翻译后修饰位点包括细胞黏附相关的特征序列、PKC磷酸化位点、酪氨酸激酶II磷酸化位点、cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点等;其编码蛋白等电点为9.17～9.37。结论:广州地区HCMV UL148基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列极为保守,但仍具有一定的多态性,提示UL148 ORF可能是一个重要的功能基因。     

2型登革病毒基因部分序列测定及氨基酸分析

目的 对登革病毒(DEN)-2贵州分离株的NS1、E基因部分序列进行测定并作氨基酸序列的预测分析。方法 碘化钠-异硫氰酸胍-氯仿法提取RNA，用DENNSl基因区通用引物和DEN-2E基因区特异性引物经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增登革病毒核酸，用纯化PCR产物测序后，用DNASIS软件进行氨基酸序列的预测。结果 DEN-2贵州分离株部分基因测序及氨基酸序列预测结果与DEN-2NGC株比较。分离株的NSl基因区有8个碱基发生点突变和2个位点氨基酸改变，E基因区有1个碱基的插入和1个位点氨基酸改变。结论 DEN-2贵州分离株和NGC株NS1、E基因区基因序列存在差异。     

珠海地区淋球菌耐药性监测及耐药质粒分型

目的 监测珠海地区2015-2016年淋球菌临床分离株对常用抗菌药物的敏感性,了解质粒介导的TEM-1和tetM基因分子流行情况.方法 用琼脂稀释法测定淋球菌对7种抗菌药物(青霉素、四环素、环丙沙星、头孢克肟、大观霉素和阿奇霉素)的最低抑菌浓度(MIC).采用纸片酸度法测定产青霉素酶淋球菌(PPNG),PCR方法分别扩增TIEM-1和tetM耐药质粒基因片段,电泳分析其耐药质粒型别.结果 93株淋球菌中检出PPNG共26株(27.96％)、耐四环素淋球菌(TRNG)24株(25.81％).93株淋球菌对青霉素、四环素、环丙沙星、阿奇霉素的耐药率分别40.86％、75.27％、100.00％、7.53％,青霉素低敏率为51.61％;未发现对大观霉素、头孢曲松、头孢克肟耐药菌株,但对头孢克肟的低敏率达到30.11％.耐药质粒分型结果PPNG亚洲型15株(57.69％),非洲型11株(42.31％),未检出多伦多/里约型;TRNG荷兰型23株(95.83％),美国型1株(4.17％).结论 珠海地区淋球菌对四环素、环丙沙星、青霉素耐药率较高,但对头孢曲松和大观霉素敏感率高,可作为治疗淋病的首选药物;PPNG以亚洲型和非洲型为主,TRNG以荷兰型为主,偶见美国型.     

多重PCR同时检测淋病奈瑟球菌及其青霉素、四环素耐药基因的研究

目的建立一种多重PCR方法,在同一扩增体系内同时检测淋病奈瑟球菌及其青霉素、四环素耐药基因,探讨采用多重PCR同时检测淋菌及其耐药基因的可行性. 方法根据淋菌CPPB、TeM-1、Tet-M基因序列,分别设计了3对引物,并在同一扩增体系内行PCR扩增,扩增的靶序列分别为150 bp、224 bp、316 bp. 结果淋菌及其青霉素、四环素耐药的标准菌株,上述3个基因位点的检测均为阳性,对125例临床标本同时进行传统培养、药敏和多重PCR检测,结果显示淋菌的检出率:培养法为20.0%,PCR法为24.8%;PPNG检出率:药敏法为16.0%,PCR法为20.8;TRNG检出率:药敏法为14.4%,PCR法为19.2%. 结论该法与传统的培养及药敏试验相比具敏感、特异、迅速、标本不受淋菌存活以及药敏试验诸多因素的影响,是一种简便、快速、可靠的方法.     

淋球菌临床分离株PI基因序列的测定与分析

目的：分析比较4株临床分离的淋球菌和2株标准菌株外膜蛋白IP基因及蛋白质序列，初步探索我国淋球菌的变异情况，为淋球菌多态性研究、IP基因的表达和疫苗研制提供依据。方法：构建pBS-T-IP克隆重组子并进行测序，用hlastn和CLUSTAL W分析基因和蛋白质序列的相似性，并与已发表的序列进行比较，预测并分析所得IP基因的loop(表面暴露区域)结构。结果：在GenBank中搜索到相似性大于98％的序列，6条序列分别属于PIA和PIB两个亚型，其中IP4的序列与GenBank中的相应序列有18个位点的差异，可能为我国特有的流行株。位于7个loop结构中的变异位点占3条PIA蛋白间总变异的67％，占3条FIB蛋白间总变异的84％，变异程度较高。结论：成功克隆了临床分离的淋球菌株和标准菌株的IP基因并进行序列分析，为深入研究我国流行的淋球菌菌株的多态性、IP基因的表达和疫苗研制奠定了基础。     

Factors Related to Increasing Prevalence of Resistance to Ciprofloxacin and Other Antimicrobial Drugs in Neisseria gonorrhoeae, United States

Using data from the Gonococcal Isolate Surveillance Project, we studied changes in ciprofloxacin resistance in Neisseria gonorrhoeae isolates in the United States during 2002-2007. Compared with prevalence in heterosexual men, prevalence of ciprofloxacin-resistant N. gonorrhoeae infections showed a more pronounced increase in men who have sex with men (MSM), particularly through an increase in prevalence of strains also resistant to tetracycline and penicillin. Moreover, that multidrug resistance profile among MSM was negatively associated with recent travel. Across the surveillance project sites, first appearance of ciprofloxacin resistance in heterosexual men was positively correlated with such resistance for MSM. The increase in prevalence of ciprofloxacin resistance may have been facilitated by use of fluoroquinolones for treating gonorrhea and other conditions. The prominence of multidrug resistance suggests that using other classes of antimicrobial drugs for purposes other than treating gonorrhea helped increase the prevalence of ciprofloxacin-resistant strains that are also resistant to those drugs.     

Increased Neisseria gonorrhoeae quinolone resistance in Amsterdam

In addition to a rise in the number of cases of gonorrhoea, the susceptibility of Neisseria gonorrhoeae to antibiotics is also a cause for concern. After a period of high resistance rates to penicillin and tetracycline between 1985 and 1995, resistance rates have dropped considerably in recent years, probably due to changes in treatment regimens. However, recently we have seen an increasing number of quinolone-resistant N. gonorrhoeae isolates in Amsterdam, the Netherlands, a development that has previously been reported in other parts of the world. Some form of national resistance monitoring for gonococci is therefore urgently required to allow timely detection of changes in N. gonorrhoeae resistance.     

Antimicrobial resistance of Neisseria gonorrhoeae in Liberia.

The prevalence and molecular characteristics of penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae (PPNG) and tetracycline-resistant N. gonorrhoeae (TRNG) were determined in 10 clinics in Monrovia, Liberia, to assess the likely effectiveness of the current standard treatment with penicillin or tetracycline. One hundred gonococcal strains were isolated from 146 urethral swabs and 261 cervical swabs and screened for susceptibility to ceftriaxone, penicillin, spectinomycin and tetracycline by the disk diffusion method; 83% were resistant to penicillin and 63% to tetracycline. Twenty-one strains from 18 men and 3 women with uncomplicated gonorrhoea were subjected to more detailed characterization. These 21 strains belonged to 5 auxotype/serovar classes; 86% were PPNG/TRNG. Three PPNG harboured the 4.4 MDa penicillinase plasmid and 16 the 3.2 MDa plasmid. All TRNG harboured the 25.2 MDa plasmid and their MICs for tetracycline were > 32 mg/L. They gave a PCR product which, according to its restriction pattern, corresponded to the American type tetM gene. By the agar dilution method, all strains exhibited intermediate resistance to sulphamethoxazole-trimethoprim (19:1) (co-trimoxazole) with MICs of 8-32 mg/L. All strains were susceptible to spectinomycin and ciprofloxacin. The MICs for gentamicin were 4-8 mg/L. The use of effective and affordable antimicrobial chemotherapy with either 500 mg ciprofloxacin or a single dose of gentamicin is discussed, with consideration of molecular biological, pharmacological and public health aspects.     

Fluoroquinolone-resistance in Neisseria gonorrhoeae, Hawaii, 1999, and decreased susceptibility to azithromycin in N. gonorrhoeae, Missouri, 1999

In 1999, 360,076 cases of gonorrhea were reported in the United States (1). Gonorrhea is a major cause of pelvic inflammatory disease, often leading to ectopic pregnancy and infertility, and it can facilitate human immunodeficiency virus (HIV) transmission (2). During the 1980s, resistance to penicillin and tetracycline among gonococcal isolates became widespread; as a result, CDC recommended that other antimicrobial agents be used to treat gonorrhea. This report summarizes investigations of an increase in fluoroquinolone-resistant Neisseria gonorrhoeae in Hawaii and of a cluster of N. gonorrhoeae infections with decreased susceptibility to azithromycin in Missouri.