miR-34a通过靶向调控Notch1表达影响乳腺癌细胞的增殖

目的探讨miR-34a通过靶向调控Notch1表达影响乳腺癌细胞的增殖。方法乳腺癌细胞MCF-7转染miR-34a mimics及miR-34a NC,RT-PCR法检测细胞中miR-34a表达,MTT,克隆形成实验,Hoechst染色及流式细胞术分别检测miR-34a mimics对乳腺癌MCF-7细胞活力、克隆能力、凋亡情况及细胞周期的影响;通过双荧光素酶报告基因实验,western blot及RT-PCR检测Notch1是否是miR-34a的下游靶基因。结果与miR-34a NC比较,miR-34 mimics组中miR-34a表达量上调,细胞活力降低(P0.01),细胞凋亡率显著提高(P0.01),细胞克隆数目减少(P0.01),细胞周期阻滞在G1期(P0.01),Notch1蛋白及mRNA表达量都显著降低(P0.01),同时荧光素酶报告基因实验也证实miR-34a mimics能与报告基因结合。结论 miR-34a mimics能通过负性调控Notch1表达,从而显著的抑制MCF-7乳腺癌细胞增值,并诱导细胞凋亡。     

miR-30-5p在食管癌中的表达及对食管癌细胞增殖和迁移的影响

目的：探讨miR-30-5p对食管癌细胞增殖和迁移的影响及分子机制。方法：选取开封市中心医院心胸血管外科和河南省人民医院胸外科2014年6月到2019年6月收集的食管癌和癌旁组织样本各120例,采用荧光定量PCR测定miR-30-5p mRNA表达水平。采用慢病毒建立食管癌细胞系EC109中建立miR-30-5p过表达稳定细胞系（miR-30-5p组）和对照细胞系（miR-control组）。采用EdU染色分析2组细胞的增殖情况;采用Transwell分析2组细胞的迁移情况;采用生物信息学和双荧光素酶报告基因分析miR-30-5p的靶基因;在miR-30-5p组和miR-control组过表达靶基因对细胞增殖和迁移的影响。结果：与癌旁组织比较,食管癌组织中miR-30-5p mRNA表达水平明显上调,差异有统计学意义（P<0.05）。与miR-control组比较,miR-30-5p组细胞增殖能力和细胞迁移能力明显下降,差异有统计学意义（P<0.05）。生物信息学和双荧光素酶报告基因显示BCL-9是miR-30-5p的靶基因。在miR-control组细胞中过表达BCL-9,可显著提高细胞的增殖和迁移,差异有统计学意义（P<0.05）。而miR-30-5p组细胞过表达BCL-9,细胞增殖和迁移差异无统计学意义（P<0.05）。结论：miR-30-5p在食管癌中呈低表达,可导致靶基因BCL-9表达上调,进而促进食管癌细胞的增殖和迁移。     

miR-27a对胃癌细胞凋亡影响的体外研究

目的:探讨miR-27a对胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:分别构建miR-27a过表达和敲除FOXO1的SGC-7901细胞株,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。蛋白质印迹法（Western blot）检测细胞凋亡和自噬相关蛋白p53、BCL-2、LC3I、LC3II水平,同时检测上调及下调miRNA-27a的胃癌细胞FOXO1的表达水平。双荧光素酶报告基因分析法验证miR-27a的靶基因。实时聚合酶链式反应（Realtime PCR） 检测miR-27a高表达质粒、miR-27a低表达质粒的转染效率,并检测过表达/敲低miRNA-27a的胃癌细胞中FOXO1 mRNA的水平。结果:（1）上调miR-27a的细胞凋亡率较对照组明显下降,且凋亡相关蛋白BCL-2表达上调,p53水平下降,自噬相关蛋白LC3I、LC3II的表达较对照组下调（P<0.05）。而敲低胃癌细胞中FOXO1后得到了与上调miR-27a相似的实验结果。（2）双荧光素酶报告基因验证结果显示miR-27a与FOXO1存在靶点关系。miR-27a高表达质粒、miR-27a低表达质粒分别成功转染至胃癌细胞中。上调或下调胃癌细胞中miR-27a后,SGC-7901细胞中FOXO1 mRNA水平无明显变化（P>0.05）,FOXO1基因表达在蛋白水平相应下调或上调。结论:体外实验中,miR-27a可通过靶向抑制FOXO1的表达抑制胃癌细胞凋亡,miR-27a/ FOXO1轴可以为胃癌治疗提供新的策略。     

miR-181b通过靶向调控N-myc下游调节基因2影响骨肉瘤细胞的迁移和侵袭

目的探讨miR-181b对骨肉瘤细胞迁移和侵袭的影响。方法培养骨肉瘤细胞,实时荧光定量PCR检测miR-181b在骨肉 瘤细胞中的表达。抑制miR-181b的表达,Transwell检测对骨肉瘤迁移和侵袭的影响;生物信息学分析miR-181b靶基因并采用 荧光素酶报告基因分析miR-181b和靶基因在骨肉瘤中是否直接作用,同时采用Western Blotting检测靶基因在骨肉瘤细胞中的 表达以及Transwell检测靶基因对骨肉瘤迁移和侵袭的影响。结果实时荧光定量PCR结果表明miR-181b在骨肉瘤细胞中高 表达。抑制miR-181b 的表达能够抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭;生物信息学分析表明N-myc 下游调节基因2（NDRG2）是 miR-181b直接作用的靶基因,荧光素酶报告基因分析验证了该结果;Western blotting检测表明NDRG2在骨肉瘤中低表达,而 抑制miR-181b 能够显著提高NDRG2 的表达。抑制miR-181b 的表达的同时抑制靶基因NDRG2 的表达,能够逆转抑制 miR-181b的表达对骨肉瘤细胞的迁移和侵袭的影响,从而显著提高骨肉瘤细胞的迁移和侵袭。结论miR-181b在骨肉瘤中过 表达,NDRG2为miR-181b直接调控靶基因,抑制miR-181b能够提高NDRG2的表达从而抑制骨肉瘤细胞的迁移侵袭。     

miR-140在内耳毛细胞中的表达及其对突触蛋白Dynamin-1的调控作用

目的 研究miR-140在正常小鼠内耳毛细胞的表达分布及其对编码突触蛋白Dynamin-1的Dnm1基因的靶向调控作用.方法 取正常成年C57BL/6小鼠耳蜗基底膜,免疫荧光染色和原位杂交法观察Dynamin-1与miR-140的表达定位情况.构建荧光素酶报告基因载体转染293T细胞,通过荧光素酶活性变化明确Dnm1是否是miR-140的靶基因.携带miR-140前体及空载的腺相关病毒(adenoassociatedvirus,AAV) 通过圆窗膜注射传递到耳蜗中, 14 d后RT-PCR检测miR-140及Dnm1的mRNA表达水平,Western blot检测Dynamin-1蛋白的表达水平.结果 miR-140表达于内外毛细胞细胞质,Dynamin-1主要表达于内毛细胞细胞质;荧光素酶活性检测结果 显示,miR-140抑制Dnm1的3'UTR荧光素酶报告基因活性(P＜ 0.05) .RT-PCR及Western blot检测结果 显示: 转染AAV-miR-140后miR-140的相对表达量明显升高,Dnm1的mRNA及其蛋白表达水平显著降低(P＜ 0.05) .结论 Dnm1是miR-140的靶基因,且miR-140可以抑制内耳毛细胞中Dynamin-1的表达,表明miR-140可能通过抑制Dynamin-1蛋白负向调控内毛细胞突触囊泡内吞过程,进而影响听觉信号的传递.     

lncRNA MIR34AHG通过miR-296-5p/SRCIN1轴影响喉癌细胞的恶性生物学行为

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA) MIR34AHG通过miR-296-5p/SRCIN1轴对喉癌细胞增殖和迁移的作用。方法 qPCR检测MIR34AHG在喉癌细胞系(TU686、Hep-2、TU177、AMC-NH-8、TU212)以及支气管上皮细胞系(16HBE)中的表达。选取MIR34AHG表达最低细胞系,分别构建MIR34AHG过表达细胞系(MIR34AHG组)和对照细胞系(对照组)。MTT法、细胞划痕实验分别检测上调MIR34AHG对细胞增殖和迁移的影响。生物信息学工具预测MIR34AHG的靶基因,双荧光素酶报告基因实验检测MIR34AHG与靶基因之间的相互作用。qPCR和Western blot法检测上调MIR34AHG对相关基因和蛋白表达的影响。结果 与16HBE细胞比较,喉癌细胞系中MIR34AHG呈低表达(P<0.01),且以TU686细胞中表达最低(P<0.01)。与对照组比较,MIR34AHG过表达抑制TU686细胞的增殖和迁移(P<0.05)。MIR34AHG和miR-296-5p之间存在靶向关系(P<0.01),miR-296-5p的靶基因可能是SRCIN1。与对照组比较,MIR34AHG过表达抑制miR-296-5p表达(P<0.01),促进SRCIN1基因的表达(P<0.01)。结论 MIR34AHG可能通过下调miR-296-5p的表达、上调SRCIN1的表达从而抑制喉癌细胞的增殖和迁移。     

miR-200c-3p靶向CCNE2抑制肾母细胞瘤细胞增殖

目的 预测和验证miR-200c-3p的靶基因并探讨其对肾母细胞瘤增殖的抑制作用。方法 应用生物信息学软件对miR-200c-3p在肾母细胞瘤中的靶基因进行预测,建立SK-NEP-1及G401的miR-200c-3p过表达及抑制表达的稳定细胞系。实验设未转染组（Blank）、模拟物阴性对照组（mimic NC）、miR-200c-3p模拟物组（miR-200c-3p mimic）、抑制剂阴性对照组（inhibitor NC）及miR-200c-3p抑制剂组（miR-200c-3p inhibitor）。采用 RT-PCR及Western blot方法检测CCNE2在SK-NEP-1及G401不同组中的表达水平,荧光素酶报告基因检测miR-200c-3p 和CCNE2的靶向关系,细胞计数盒（CCK-8）和软琼脂克隆形成实验检测miR-200c-3p对SK-NEP-1及G401细胞增殖的抑制作用。结果 生物信息学方法预测CCNE2为miR-200c-3p的靶基因之一。RT-PCR实验结果示肾母细胞瘤细胞中miR-200c-3p模拟物组的CCNE2的表达水平低于模拟物阴性对照组（P<0.05）;荧光素酶报告基因检测证实CCNE2是miR-200c-3p的靶基因（P<0.01）。Western blot示在肾母细胞瘤细胞中miR-200c-3p模拟物组的CCNE2蛋白的表达水平低于模拟物阴性对照组（P<0.05）;CCK-8和软琼脂克隆形成实验证实miR-200c-3p对肾母细胞瘤细胞的增殖能力有明显抑制作用（P<0.01）;而miR-200c-3p抑制剂组结果相反。结论 miR-200c-3p通过靶基因 CCNE2抑制肾母细胞瘤细胞的增殖。     

miR-181a调控结肠癌细胞生长的作用和机制研究

目的 确定miR-181a对结肠癌细胞生长的作用以及探讨其机制。方法 常规培养结肠癌细胞系TCHu102,利用脂质体转染miR-181a抑制剂/模拟物的方法干预细胞内源性miR-181a的水平。MTT法测定结肠癌细胞的生长活力。生物信息学预测的方法筛选miR-181a的可能靶基因,双荧光素酶报告基因确定miR-181a与靶基因的作用关系。实时定量PCR的方法确定基因表达水平,western blot的方法检测蛋白表达水平。结果 敲低结肠癌细胞TCHu102中miR-181a的水平明显抑制细胞生长活力,为对照组的28.9% (P<0.01)。生物信息学预测发现PRKCD基因可能是miR-181a的靶基因,同时miR-181a能显著抑制含有PRKCD基因3’UTR的荧光素酶活性,在结肠癌细胞中过表达miR-181a后PRKCD的蛋白水平明显降低。结论 miR-181a通过抑制PRKCD的表达调控结肠癌细胞的生长。     

miR-593通过调控PLK1基因的表达抑制结肠癌细胞的增殖

目的探讨miR-593在结肠癌细胞增殖中的作用及分子机制。方法利用生物信息学分析筛选miR-593可能结合的靶基 因为PLK1;利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-593 和PLK1 基因的结合;通过qRT-PCR、Western blotting 验证PLK1 为 miR-593直接作用的靶基因;通过CCK-8实验证明miR-593通过调控PLK1基因的表达抑制结肠癌细胞的增殖。结果运用三 种生物信息学软件对PLK1可能结合的miRNA进行了预测与分析,发现miR-593可能结合PLK1基因;双荧光素酶报告基因实 验证明miR-593 与PLK1 基因发生了结合;Western blotting 结果表明,PLK1 在miR-593 mimic 转染组表达量显著下降,而在 miR-593 inhibitor 组明显升高,相对于对照组均具有统计学差异（P<0.05）;qRT-PCR结果表明,PLK1 RNA水平在各组中表 达水平差异无统计学意义（P>0.05）;细胞增殖实验表明,miR-593与PLK1对结肠癌细胞增殖的影响为相反关系,且共转染miR-593 mimic与PLK1过表达质粒组对细胞增殖的影响介于单独转染miR-593 mimic组与PLK1过表达质粒组之间。结论miR-593通 过调控PLK1基因的表达抑制了结肠癌细胞的增殖,并发挥抑癌miRNA的作用。     

MicroRNA-34a通过靶基因c-Met抑制施万细胞增殖

目的:探讨坐骨神经横断后,microRNA-34a(miR-34a)对c-Met(肝细胞生长因子受体)的调控作用及对施万细胞增殖的影响。方法:采用Real-time PCR检测miR-34a和c-Met在坐骨神经横断后近侧端的表达变化;Edu染色法检测miR-34a对原代培养的施万细胞增殖能力的影响;双荧光素酶报告基因系统检测miR-34a对c-Met 3’UTR的直接靶向作用。结果:miR-34a与c-Met在坐骨神经横断后近侧端的表达呈负相关,能够抑制原代培养的施万细胞的增殖,并可直接作用于c-Met基因的3’UTR。结论:miR-34a可以直接靶向c-Met的3’UTR,从而通过下调靶基因c-Met的表达抑制施万细胞的增殖。     

人miR-34a靶基因的生物信息学分析及载体构建

目的对人miR-34a（hsa-miR-34a）下游靶基因进行预测,并构建含自噬相关基因靶结合序列的GFP报告基因载体。方法使用TargetScan Release 5.1和RNA22软件分析hsa-miR-34a可能的靶基因,并利用Gominer软件对靶基因功能进行分析。根据预测结果,合成含自噬相关基因hsa-miR-34a靶序列的寡核苷酸,以pEGFPC2为载体构建系列质粒,并检测各载体的真核表达情况。结果预测结果显示hsa-miR-34a共有2904个下游靶基因,功能涵盖生物过程、细胞组分、分子功能三大类,其中与自噬作用直接相关的靶基因有beclin 1和sestrin 2。构建含beclin 1和sestrin 2作用位点的GFP载体共5个,质粒转染Hela细胞后在荧光显微镜下可见绿色荧光。结论成功构建hsa-miR-34a下游自噬相关基因靶位点序列GFP报告基因载体,为进一步研究hsa-miR-34a对自噬的调控作用奠定基础。     

miR-125a/TRAF6调控通路在破骨细胞分化中的作用研究

目的研究miR-125a在破骨细胞分化过程中的作用及其作用机制,方法单核细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子-κB配体的受体激活剂(RANKL)诱导CD_(14)⁺PBMCs向破骨细胞分化。生物信息学运算预测miR-125a的靶基因以及结合于miR-125a启动子区域的转录因子。实时定量PCR法检测miR-125a以及其他相关基因的表达。过表达实验和抑制试验用于研究miR-125a在破骨细胞分化中的作用及其与靶基因之间的相互关系。荧光素酶报告基因实验验证miR-125a与其靶基因之间的结合。结果(1)miR-125a表达在CD_(14)+PBMCs向破骨细胞分化。生物信息学运算预测miR-125a的靶基因以及结合于miR-125a启动子区域的转录因子。实时定量PCR法检测miR-125a以及其他相关基因的表达。过表达实验和抑制试验用于研究miR-125a在破骨细胞分化中的作用及其与靶基因之间的相互关系。荧光素酶报告基因实验验证miR-125a与其靶基因之间的结合。结果(1)miR-125a表达在CD_(14)⁺PBMCs前体细胞高表达,随着诱导时间的延续逐渐下降,在诱导第5天开始明显下降并在第15天达到最低值,表明miR-125a的表达在破骨细胞分化过程中呈现明显下降趋势。(2)miR-125a参与调控RANKL和M-CSF诱导的破骨细胞分化,过表达miR-125a明显抑制了TRAP和NFATc1的mRNA表达和CD_(14)+PBMCs前体细胞高表达,随着诱导时间的延续逐渐下降,在诱导第5天开始明显下降并在第15天达到最低值,表明miR-125a的表达在破骨细胞分化过程中呈现明显下降趋势。(2)miR-125a参与调控RANKL和M-CSF诱导的破骨细胞分化,过表达miR-125a明显抑制了TRAP和NFATc1的mRNA表达和CD_(14)⁺PBMCs向破骨细胞的分化。(3)miR-125a直接作用于靶基因肿瘤坏死因子相关因子6(TRAF6),TRAF6是RANKL/RANK/NFATc1信号转导通路的转录因子,过表达miR-125a降低了TRAF6的蛋白表达水平,而TRAF6的mRNA水平无明显改变。结论 miR-125a通过作用于新的FRAF6/NFATC1/miR-125a负反馈调控环路在破骨细胞的分化中发挥了重要的调控作用,调控miR-125a的表达可能成为骨代谢疾病新的治疗靶点。     

miR-34a靶向调控NOTCH1基因对SW480细胞增殖的影响

目的 探讨miR-34a靶向调控NOTCH1基因表达而对结肠癌SW480细胞增殖的影响.方法 通过生物信息学预测,NOTCH1为miR-34a特异性靶基因.构建含miR-34a结合位点的NOTCH1基因3 '-UTR域荧光素酶报告载体.通过荧光素酶报告载体系统检测miR-34a与NOTCH1的3’-UTR相互作用对荧光素酶活性的影响;免疫印迹技术检测miR-34a对NOTCH1蛋白表达的影响.采用MTT法及流式细胞检测转染miR-34a对SW480细胞增殖的影响.结果 经过酶切及基因测序鉴定,NOTCH1基因3'-UTR序列的双荧光素酶报告重组质粒构建成功;荧光素酶结果显示在SW480细胞中加入miR-34a的类似物和重组载体,荧光素酶的活性是只加入空载体的SW480组53.4％ (P=0.003 8);而在HEK293细胞中加入miR-34a的抑制物和重组载体,荧光素酶的活性是只加入空载体的HEK293组145％(P=0.002 1),说明miR-34a有与NOTCH1的3’-UTR位点相结合.免疫印迹结果显示在SW480细胞中加入miR-34a的类似物,NOTCH1蛋白的表达水平是未处理SW480组下降53.6％(P＜0.05);而在HEK293细胞中加入miR-34a的抑制物,NOTCH1蛋白的表达水平较未处理HEK293组升高78.9％ (P =0.03),说明miR-34a负性调控NOTCHl蛋白的表达.miR-34a过表达的SW480细胞较未处理的SW480的生长速度明显减慢(P＜0.05),且阻滞在G0～G1期,说明miR-34a过表达后能抑制SW480细胞增殖.结论 miR-34a负性靶向调控NOTCH1基因的表达而抑制SW480细胞的增殖.     

miR-34b促进关节软骨细胞基质退变的分子机制研究

目的探讨微小RNA-34b（miR-34b）促进关节软骨细胞基质退变的分子机制。方法提取10例骨关节炎（OA）患者和7例创伤性截肢者的膝关节软骨组织,实时定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）法检测组织标本中miR-34b表达水平。利用Targetscan基因信息软件预测得到miR-34b靶基因为Smad3,构建Smad3野生型及突变型3′非编码区（3′-UTR）-荧光素酶报告载体,利用荧光素酶报告基因实验检测miR-34b对Smad3基因野生型及突变型3′-UTR荧光素酶活性的影响。体外培养SW1353细胞,分为A、B、C和D组,分别加入等量脂质体、无义序列、miR-34b模拟物（miR-34bmimic）和miR-34b抑制物（miR-34binhibitor）。RT-qPCR法检测miR-34b、Smad3、Ⅱ型胶原和基质金属蛋白酶-13（MMP-13）的表达水平。结果OA软骨组织中miR-34b表达水平较正常膝关节软骨组织明显上调（P＜0.05）。SW1353细胞转染后,与A组比较,C组miR-34b表达水平明显升高（P＜0.05）,D组明显降低（P＜0.05）;A组与B组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。TargetsCan软件预测miR-34b的潜在靶基因为Smad3,荧光素酶报告基因实验证实miR-34b直接靶向抑制靶基因Smad3;转染miR-34bmimic和miR-34inhibitor后,与A组比较,C组Smad3mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）,D组明显升高（P＜0.05）;A组与B组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。转染后,与A组比较,C组Ⅱ型胶原mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）,D组明显升高（P＜0.05）;C组MMP-13mRNA明显升高（P＜0.05）,D组明显降低（P＜0.05）。结论miR-34b可能通过抑制其靶基因Smad3的表达进而诱导人关节软骨细胞基质退变,从而促进OA的发生、发展。     

miR-383调控血管生成因子VEGFA的表达并抑制血管生成

目的 探讨miR-383对血管生成的影响及分子机制。 方法 通过生物信息学数据库进行预测,寻找miR-383调控的靶基因,挑选与血管生成相关的靶基因作为候选基因,采用荧光素酶报告基因检测系统进行验证。利用实时荧光定量PCR(qPCR)和Western-blot等实验证实miR-383对候选基因表达的靶向调控; 通过体外血管内皮细胞成管实验检测miR-383对血管生成的影响。 结果 生物信息学预测显示,miR-383靶向多个与血管生成相关的基因; 荧光素酶报告基因实验证实,miR-383可通过结合血管内皮生成因子(VEGFA)基因3''-非翻译区(3''-UTR)而抑制其表达; 过表达miR-383并不影响VEGFA的mRNA转录水平,而只是在蛋白水平下调VEGFA表达; 体外血管生成实验表明,miR-383所介导的VEGFA表达下调可明显抑制血管生成。 结论 miR-383可通过靶向结合VEGFA基因的3''-UTR,抑制其翻译效率而下调VEGFA的表达,并抑制内皮细胞血管生成能力。     

miR-211对卵巢癌SKOV-3细胞上皮-间质转化功能的影响及机制

目的 研究microRNA-211(miR-211)对卵巢癌SKOV-3细胞上皮-间质转化(EMT)功能的影响及其相关机制.方法 SKOV-3卵巢癌细胞株分别转染miR-211模拟物(211M组)及其阴性对照模拟物(NCM组),并设立未转染对照组,采用RT-PCR法检测各组细胞miR-211含量;Transwell实验检测3组细胞迁移能力和侵袭能力;Western blot法检测3组细胞Snail、α-连环蛋白(α-Catenin)和与性别决定相关的高迁移率基因群4(SOX4)表达水平;采用Western blot法检测SOX4过表达对miR-211抑制EMT的拮抗作用;双荧光素酶实验检测miR-211与SOX4的关系.结果 211M组miR-211的表达水平明显上调,表达水平为未转染对照组的(706.67±30.95)倍(P<0.05).211M组迁移细胞数量为(12.32±0.77)个/视野,明显低于未转染对照组的(82.25±1.05)个/视野(P<0.05).211M组侵袭细胞数量为(9.22±0.32)个/视野,明显低于未转染对照组的(62.10±1.77)个/视野(P<0.05).211M组细胞Snail蛋白表达量明显降低,α-Catenin蛋白表达量明显升高,SOX4蛋白表达量明显降低.SOX4+211M组卵巢癌细胞中Snail蛋白表达量明显升高, α-Catenin蛋白表达量明显降低.双荧光素酶检验结果显示SOX4为miR-211的下游靶基因.结论 miR-211可能通过降低下游靶基因SOX4水平影响EMT相关蛋白表达,抑制卵巢癌SKOV-3细胞的EMT功能.     

miR-129通过抑制T细胞因子4的表达影响肺癌A549细胞的上皮间质转化

目的: 探讨miR-129对肺腺癌细胞系A549中T细胞因子4（TCF4）的表达及上皮间质转化（EMT）进程的影响及其机制。方法: 将miR-129寡核苷酸片段miR-129 mimic转染A549细胞,实时定量PCR验证转染效率。实时定量PCR和蛋白质印迹实验检测转染后A549细胞TCF4、E-钙黏蛋白和波形蛋白的mRNA和蛋白表达水平。设计合成miR-129 mimic,将其与TCF4 3′-UTR报告基因质粒共转染HEK-293细胞,检测miR-129对TCF4报告基因质粒荧光素酶活性的影响,证实TCF4是miR-129的靶基因。结果： 实时定量PCR及蛋白质印迹结果均表明,上调miR-129表达后,A549细胞TCF4、波形蛋白表达明显下调（P<0.05或P<0.01）,E-钙黏蛋白表达明显上调（P<0.01）。miR-129明显抑制TCF4报告基因质粒荧光素酶活性（P<0.01）。结论： miR-129通过抑制TCF4的表达阻遏A549细胞的EMT进程。     

miR-34c抑制人子宫内膜癌的机制分析

目的 MicroRNAs (miRNAs)是内源性表达长度约为22个核苷酸的小RNA分子,通过结合到靶mRNA上而抑制基因的表达。近年的研究表明某些miRNAs可以调节肿瘤细胞的增殖与迁移,然而miRNA在子宫内膜癌中的作用有待于进一步探索。本研究旨在探讨miR-34c在人子宫内膜癌中的表达规律、功能和分子机制。 方法 通过荧光定量PCR技术检测20例人子宫内膜癌组织标本中miR-34c的表达。通过阳离子脂质体介导的方法将miR-34c转染入人子宫内膜癌细胞RL95-2中,应用MTS法检测子宫内膜癌细胞的增殖,克隆形成实验检测子宫内膜癌细胞的生长,流式细胞术检测细胞周期,Transwell实验检测子宫内膜癌细胞的迁移。生物信息学和荧光素酶报告基因实验确认miR-34c作用的靶基因。RNAi技术下调c-Met的表达。通过蛋白印迹检测miR-34c对c-Met蛋白以及细胞内重要信号通路与细胞周期相关蛋白的影响。 结果 miR-34c在子宫内膜癌中表达明显降低。miR-34c能使子宫内膜癌细胞RL95-2细胞周期滞留在G₁期,显著抑制细胞的增殖。细胞移形实验发现miR-34c能够显著抑制RL95-2细胞迁移。生物信息分析表明c-Met是miR-34c作用的靶基因,进一步通过荧光素酶报告基因实验得以证实。蛋白印迹分析发现miR-34c能下调RL95-2细胞中的c-Met蛋白、p-Akt蛋白以及p-ERK1/2蛋白表达情况,同时还能够下调CDK4、CDK6蛋白以及p-Rb蛋白的表达水平。RNAi技术下调c-Met的表达能够明显抑制子宫内膜癌细胞的增殖与迁移。 结论 本研究结果证明miR-34c通过作用于靶基因c-Met而抑制子宫内膜癌细胞的增殖与迁移,说明miR-34c是子宫内膜癌中的重要抑癌基因。      

miR-205对PEG3在子宫内膜癌细胞系中的靶向降调作用

目的 探讨子宫内膜癌细胞系中miR-205对父性表达基因3(PEG3)蛋白的作用.方法 免疫组化方法确定PEG3蛋白在正常子宫内膜与高、中、低分化子宫内膜癌组织中表达的差异.RT-PCR筛选出miR-205较正常子宫内膜细胞株表达量高的高、中、低分化子宫内膜癌细胞系,CCK-8及流式细胞学实验检测上调miR-205前后细胞增殖及凋亡;Western blot、RT-PCR和双荧光素酶报告基因分析等实验方法验证miR-205对PEG3是否有直接的靶抑制作用.结果 PEG3蛋白在正常子宫内膜组织中表达明显高于高、中、低分化子宫内膜癌组织.miR-205在高、中、低分化子宫内膜癌细胞系中上调后,细胞增殖促进,凋亡抑制;Western blot结果示PEG3蛋白含量降低,PEG3抑制的WNT通路中的两个关键蛋白β-catenin及c-myc也相应的表达量上调,而RT-PCR结果显示PEG3mRNA含量变化差异无统计学意义;双荧光素酶报告基因分析结果显示miR-205作用于PEG3基因的3'UTR端.结论 MiR-205作用于PEG3基因的3'UTR端,在转录后水平抑制PEG3的表达,提示PEG3是miR-205的直接靶基因.