CSE诱导支气管上皮细胞分泌外泌体miR-186促进肺成纤维细胞增殖

目的:研究香烟提取物(cigarette smoke extract,CSE)对支气管上皮细胞16HBE外泌体miR-186表达量的影响,以及16HBE来源的外泌体miR-186对肺成纤维细胞增殖的影响.方法:收集CSE处理的16HBE细胞上清中外泌体miR-186,用于MRC-5细胞培养;使用qPCR检测外泌体miR...     

极低体重儿氧暴露后血清外泌体miR-30a、miR-34a变化与支气管肺发育不良的相关性

目的:探讨极低体重早产儿氧暴露后血清外泌体miR-30 a、miR-34 a变化趋势以及其与支气管肺发育不良(BPD)的关系.方法:选取2018年1月至2020年1月在衡水市妇幼保健院新生儿重症监护室住院>28 d的极低体重早产儿,包括56例BPD患儿(BPD组)和50例非BPD早产儿(非BPD组).采集产后1、7、1...     

高糖环境下肾小管上皮细胞来源外泌体诱导巨噬细胞向肌成纤维细胞转化

目的 探讨高糖环境下肾小管上皮细胞来源外泌体诱导巨噬细胞向肌成纤维细胞转化的作用与机制。方法 正常糖(5.5 mmol/L)及高糖(30.0 mmol/L)分别处理人肾小管上皮细胞(HK2)48 h,收集上清液提取并鉴定外泌体;观察人急性单核细胞白血病细胞株(THP-1)巨噬细胞是否吞噬PKH67标记的外泌体;通过检测诱导性氮氧化物合酶(iNOS)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、甘露醇受体(CD206)的表达,以确定分化为M1和M2型巨噬细胞的最佳浓度及时间点;激光共聚焦检测CD206与α-SMA、IV型胶原(Col-IV)、纤维连接蛋白(FN)的荧光共表达。qRT-PCR与ELISA法测定转化生长因子受体-β1(TGF-β1)、白细胞介素(IL)-10、IL-6水平。Western blot测定TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白表达。结果 上清液离心获取标本后检测到白细胞分化抗原群63(CD63)和肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)阳性、内质网分子伴侣蛋白(Calnexin)阴性,确认为外泌体并且纯度较高;THP-1巨噬细胞能够吞噬各组外泌体;各组外泌体刺激的最佳浓...     

肿瘤成纤维细胞通过外泌体miR-21促进膀胱癌细胞侵袭转移

目的:探讨外泌体miR-21参与肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast,CAF)促进膀胱癌细胞侵袭转移的作用及机制.方法:利用组织块贴壁法分别从膀胱癌和癌旁组织分离CAF和正常成纤维细胞(normal fibroblast,NF),利用荧光实时定量PCR检测膀胱癌组织,CAF、NF...     

胃癌外泌体MiR-221靶向PTEN促进肿瘤相关成纤维细胞的形成

目的:探究胃癌外泌体miR-221对肿瘤相关成纤维细胞的影响及机制.方法:提取并鉴定人胃黏膜细胞GES-1、人胃癌MGC-803、MKN45细胞分泌的外泌体(GES-1 exo、MGC-803 exo、MKN45 exo),qRT-PCR检测miR-221在GES-1、MGC-803、MKN45及其外泌体中的表达,将1...     

成纤维细胞来源外泌体在疾病相关细胞外基质重构中的作用

成纤维细胞是介导组织细胞外基质(ECM)重构的重要细胞类型,外泌体是一种新型胞间通讯方式.近年有证据表明,成纤维细胞来源外泌体参与ECM组成和代谢,并存在自分泌作用,与多种疾病发生发展密切相关.深入研究成纤维细胞来源外泌体对ECM重构的调控作用,有望揭示疾病病因机制及精准治疗靶点.     

鼻咽癌外泌体miR-20a通过靶向BCL2L11基因抑制肿瘤相关巨噬细胞凋亡

目的 探索鼻咽癌外泌体microRNA是否通过靶向凋亡基因而抑制肿瘤相关巨噬细胞(TAM)凋亡.方法 通过生物信息学方法确定目标microRNA及其靶基因,检测鼻咽癌患者血清及鼻咽癌细胞培养基中的外泌体内miR-20a的表达量.应用miR-20a的拟似物及抑制物转染巨噬细胞;并检测干预后的凋亡指数及凋亡通路相关蛋白.结果 miR-20a在鼻咽癌外泌体中表达显著上调.miR-20a的靶基因为BCL2 L11,过表达miR-20a可以抑制巨噬细胞凋亡,且凋亡通路相关蛋白Bim、caspase-9和caspase-3均显著减少(P＜0.05).结论 miR-20a通过抑制Bim-caspase-9-caspase-3凋亡途径的活化从而抑制鼻咽癌中TAM凋亡.     

血清外泌体miR-451a在弥漫大B细胞淋巴瘤治疗监测中的意义

目的 探索血清外泌体miR-451a在弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma, DLBCL）中的水平及其在治疗监测中的价值。方法 本研究共纳入56例DLBCL患者,56例健康对照者。收集新发DLBCL患者治疗前、化疗2~4疗程及化疗结束后血清样本,并同时收集健康人血液标本, 提取血清中的外泌体RNA,并进行实时荧光定量PCR（quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR）,用受试者工作特征（receive operator characteristic, ROC）曲线判定miR-451a的诊断效能,用各时点收集的血清样本动态分析血清外泌体miR-451a水平与化疗效果之间的关系。结果 56例DLBCL患者与56例健康对照者相比,DLBCL患者血清外泌体miR-451a水平下降（P<0.000 1）,在两组受试者间用miR-451a诊断DLBCL的曲线下面积(AUC)为0.737（95%CI0.645~0.816）。在随访到的43例DLBCL患者中,化疗后获得完全缓解或者部分缓解的患者其血清外泌体miR-451a水平较化疗前有所上升（P<0.05）,与配对的健康人水平差异无统计学意义（P>0.05）;化疗后未获得缓解的患者,其血清外泌体miR-451a水平较化疗前无明显变化（P>0.05）,且仍然低于配对的健康人水平（P<0.05）;化疗完成后在未缓解者与缓解者之间进行鉴别,血清miR-451a的AUC为0.867（95%CI0.728~0.951）。结论 血清外泌体miR-451a水平动态监测有助于DLBCL化疗过程中的疗效（是否缓解）判断。     

槟榔碱通过促进巨噬细胞分泌含miR-155-5p外泌体诱导人口腔成纤维细胞的活化

目的 探讨槟榔碱（ARE）通过调控巨噬细胞外泌体内miR-155-5p水平诱导人口腔黏膜成纤维细胞向成纤维表型转化的作用机制。方法 以人单核细胞系（THP-1）与人口腔黏膜成纤维细胞系（HOMF）为研究对象。实验设为空白对照组、阴性对照组、ARE刺激组、ARE刺激后THP-1培养上清刺激组（CS）、ARE刺激后THP-1外泌体刺激组（EXO）、ARE刺激后THP-1无外泌体上清刺激组（NES）、miR-155-5p过表达组（miR-155-5p mimics）、ARE刺激后EXO处理对照组（NC+EXO-ARE）和miR-155-5p抑制联合ARE刺激后EXO处理（miR-155-5p inhibitor EXO-ARE）组。以流式细胞术检测THP-1细胞极化情况。Transwell细胞迁移实验检测HOMF细胞迁移能力。DCFH-DA检测细胞氧化应激水平。qRT-PCR检测细胞α-SMA、I型胶原和SOCS1的mRNA转录水平。免疫印迹实验检测细胞α-SMA、I型胶原与SOCS1蛋白表达。结果 流式检测显示,相较于对照组,ARE组THP-1细胞由M0趋向M1极化。ARE对THP-1和H...     

M2型巨噬细胞外泌体包裹miR-374a促进前列腺癌恶性进展的机制研究

目的：探究M2型巨噬细胞外泌体包裹miR-374a对前列腺癌(prostate cancer, PCa)恶性进展的影响并探讨其分子机制。方法：在成功建立M2型巨噬细胞的基础上,抽提并鉴定其外泌体,检测外泌体中差异表达的miRNA,同时在不同PCa细胞中验证,选取miR-374a进行研究;M2细胞中转染cy3荧光标记的miR-374a与PC3细胞共培养,荧光显微镜观察PC3细胞中cy3荧光表达情况;DU145和PC3细胞中转染miR-374a inhibitor进行增殖、迁移等细胞功能学实验及裸鼠皮下成瘤实验;通过数据库筛选叉头盒转录因子(FOXO1)作为靶基因,通过Western blotting、荧光素酶报告基因实验及免疫荧光实验进行验证;干扰FOXO1后进行细胞功能学实验,观察是否能逆转miR-374a inhibitor对DU145及PC3细胞功能学的影响。结果：成功建立M2细胞并抽提其外泌体,其中miR-374a在M2细胞外泌体中高表达;荧光定量PCR实验结果证明miR-374a在PC3及DU145中表达量显著高于LNCaP,在M2细胞中表达量高于THP-1细胞,PC3细胞与M...     

血清外泌体miR-27a在胃癌中的表达及其临床意义

目的 外泌体近年来成为肿瘤研究中关注的热点，外泌体中的miRNA已经证实在多种肿瘤中发挥重要作用。本研究旨在探讨胃癌患者血清外泌体microRNA-27a的表达变化及其临床意义。 方法 收集40例在2015年1月—2017年12月间就诊于安徽医科大学第二附属医院普外科且前期没有接受过任何治疗的胃癌患者术前术后血清标本，收集同期20例体检健康者血清标本，分离血清外泌体，同时进行RNA提取。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测血清外泌体miR-27a水平的相对定量含量，比较胃癌组与正常组之间的差异，并比较胃癌组术前、术后外泌体miR-27a表达的差异。对40例胃癌患者血清外泌体miR-27a水平以及临床病理表现(性别、年龄以及肿瘤分级)进行分析，在参照随访资料的基础上，分析患者外泌体miR-27a表达与预后间的联系。 结果 胃癌患者术前血清外泌体miR-27a水平为0.153±0.092，健康体检者为0.823±0.125，两者比较差异有统计学意义(P＜0.001)；胃癌患者术后血清外泌体miR-27a水平为0.505±0.143，与术前比较明显升高(P<0.05)。肿瘤患者血清外泌体miR-27a表达量与肿瘤分级成负相关，Ⅰ/Ⅱ期患者术前相对表达量为0.179±0.102，Ⅲ/Ⅳ期为0.102±0.076(P<0.05)。 结论 胃癌患者血清外泌体中miR-27表达量明显降低，其表达量与肿瘤分级负相关，对于早期筛查胃癌和胃癌的治疗有一定的临床价值。      

miR-34a靶向调控SOX7表达抑制垂体腺瘤细胞增殖

探讨miR-34a通过靶向调控SOX7表达对垂体腺瘤细胞增殖的影响。结果显示,miR-34a mimics转染组和siRNA-SOX7组细胞活力、S期、G2期分别低于NC-miR-34a转染组和NC-SOX7转染组,细胞凋亡率和G1期分别高于NC-miR-34a转染组和NC-SOX7转染组。miR-34a mimics转染组SOX7 mRNA、SOX7蛋白的相对表达量低于NC-miR-34a转染组。结果表明,miR-34a可以通过靶向抑制SOX7表达抑制垂体腺瘤细胞增殖。     

新生与成年大鼠心脏成纤维细胞来源外泌体蛋白质组学差异分析

目的 幼体心脏具有再生修复功能,通过分析新生大鼠与成年大鼠心脏成纤维细胞来源外泌体的差异蛋白,从分子水平上探讨心肌受损后可能的治疗靶点。方法 分别从新生和成年大鼠心脏成纤维细胞中分离出外泌体,并提取蛋白质进行高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）和液相色谱串联质谱法（liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）分析,鉴定差异表达的蛋白质。使用DAVID数据库对差异表达蛋白基因进行基因本体论（Gene Ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路分析。并进一步使用STRING数据库和Cytoscape软件进行蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction,PPI）分析,以筛选出关键基因。结果 在新生大鼠中共发现241个差异表达蛋白,其中上调表达的蛋白有117个,下调表达的蛋白有124个。GO分析显示上调表达...     

MEBO对高糖培养的成纤维细胞外泌体分泌的影响

目的 分析美宝湿润烧伤膏(moist exposed burn ointment, MEBO)对高糖培养的成纤维细胞外泌体分泌的影响,探究MEBO促进糖尿病慢性创面愈合的机制。方法 首先将Wistar大鼠表皮于无菌环境中分离。培养分离后的成纤维细胞,等到第四代,根据课题组前期研究将细胞分成四组,分别为对照组(高糖培养基)、MEBO低浓度组(20 g/L)、MEBO中浓度组(40 g/L)、MEBO高浓度组(80 g/L)。药物干预3天后,收集细胞上清用超滤管浓缩后,用SBI试剂盒提取外泌体,采用Western blotting检测外泌体标记蛋白CD81、TSG101。结果 外泌体标记蛋白CD81、TSG101在MEBO组和对照组中均有表达。MEBO各浓度组外泌体分泌量均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),MEBO中浓度组(40 g/L)分泌外泌体最多,与MEBO低浓度组(20 g/L)、MEBO高浓度组(80 g/L)相比差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 MEBO可以促进高糖培养的成纤维细胞分泌外泌体。     

miR-34a在低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

【目的】观察miR-34a在低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用并探讨其可能的机制。【方法】原代分离和培养大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMC）,并给予3%低氧处理后,用Real-time PCR法检测miR-34a和Notch1mRNA在大鼠PASMC中的表达;低氧条件下用细胞转染法过表达和抑制miR-34a、沉默Notch1基因的表达后用EDU法观察细胞增殖情况,并用Real-time PCR和Western blot法检测细胞核增殖抗原PCNA的表达。【结果】分离和培养大鼠PASMC并给予3%低氧处理后,大鼠PASMC中miR-34a表达明显降低,且低氧48h降低较明显,组间差异有统计学意义（P<0.05）。而Notch1的表达明显增高,且48h增高较明显,组间差异有统计学意义（P<0.05）。此外,过表达miR-34a和沉默Notch1后会显著抑制低氧引起的细胞增殖,抑制miR-34a的表达后则会促进细胞增殖,且组间差异有统计学意义（P<0.05）。【结论】在低氧诱导的PASMC细胞增殖过程中miR-34a参与了PASMC的增殖过程,且可能是通过上调Notch1引起了细胞增殖。     

血管内皮细胞来源外泌体miR-214对H2O2诱导血管内皮细胞损伤的影响

探讨血管内皮细胞来源外泌体miR-214对过氧化氢(H2O2)诱导的血管内皮细胞损伤的影响。方法 体外培养人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）,并转染miR-214抑制物（in-miR-214）及其阴性对照（in-miR-NC）,分离并鉴定外泌体,同时检测miR-214表达。再次培养HUVEC,分为正常对照组（Control组）、氧化损伤组（H2O2组）、空白外泌体+氧化损伤组（exo NC+H2O2组）、in-miR-NC外泌体+氧化损伤组（exo in-miR-NC+H2O2组）和in-miR-214外泌体+氧化损伤组（exo in-miR-214+H2O2组）。qRT-PCR检测细胞中miR-214表达水平;MTT和流式细胞术检测细胞增殖、凋亡;划痕愈合实验检测细胞迁移;Western blot检测细胞增殖、凋亡、迁移相关蛋白水平。结果 成功从HUVEC 细胞中分离出外泌体,且转染in-miR-214可抑制外泌体中miR-214表达（P＜0.05）。H2O2诱导后,HUVEC细胞增殖活力和划痕愈合率降低,凋亡率增高;同时,细胞中miR-214表达水平增高,Cyclin D1、PCNA、Bcl2、MMP2和MMP9蛋白水平降低,Bax蛋白水平增高（P＜0.05）。添加HUVEC外泌体和外泌体来源的in-miR-214可部分削弱H2O2 对HUVEC细胞的损伤,且后者的效果要明显优于前者（P＜0.05）。结论 HUVEC来源外泌体通过低表达miR-214保护HUVEC免受H2O2诱导的细胞损伤     

成纤维细胞与间充质干细胞来源外泌体修复急性皮肤创面的比较

【目的】本研究旨在比较成纤维细胞来源外泌体与间充质干细胞来源外泌体对小鼠急性皮肤创面的修复作用。【方法】体外分离培养原代人真皮成纤维细胞（hDF）并鉴定。用超速离心法提取人真皮成纤维细胞来源外泌体（hDF-EXO）、人骨髓间充质干细胞来源外泌体（hMSC-EXO）并鉴定;两种外泌体与hDF共培养24 h后,CCK8细胞增殖实验和划痕实验检测细胞增殖和迁移活性;采用8周龄雌性C57BL/6小鼠构建急性全层皮肤切除模型,在伤口上分别局部涂敷PBS（对照组）、hDF-EXO、hMSC-EXO进行治疗。术后第0、2、4、7天观察小鼠伤口并计算伤口面积。术后第1天取伤口组织检测对外泌体摄取情况,并利用qPCR检测伤口组织TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10炎症因子水平。术后第7天取伤口组织进行HE染色观察伤口组织结构变化,免疫荧光染色观察伤口组织PDGFR-α、α-SMA、Ki67表达情况。【结果】hDF表面分子及特异性标志物表达符合成纤维细胞特性。hDF-EXO和hMSC-EXO的形状、粒径、标志物均符合外泌体鉴定标准,且两者浓度差异无统计学意义（P>0.05）;体外试验数据显示...     

肿瘤相关成纤维细胞来源外泌体ciRS-7经miR-7/IGF1R轴促进胰腺癌细胞糖酵解

目的：探讨肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）来源外泌体ciRS-7对胰腺癌细胞糖酵解代谢的影响。方法：采用超速离心法提取CAFs外泌体,并通过实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测外泌体中ciRS-7的表达及胰腺癌细胞糖酵解关键酶mRNA的表达;构建含ciRS-7 野生及突变序列的荧光素酶检测报告质粒,在胰腺癌细胞中验证ciRS-7与miR-7的关系;蛋白质印迹（Western blot）法检测IGF1R/AKT蛋白表达。结果：ciRS-7在胰腺癌相关成纤维细胞的外泌体中表达上调（P ＜0.05）;CAFs释放的外泌体促进胰腺癌细胞糖酵解和增殖（P ＜0.05）;敲降胰腺癌相关成纤维细胞ciRS-7的表达,其外泌体可抑制胰腺癌细胞糖酵解相关基因的表达（P ＜0.05）;ciRS-7在胰腺癌细胞中经miR-7/IGF1R/AKT通路促进癌细胞糖酵解（P ＜0.05）。结论：ciRS-7在胰腺癌相关成纤维细胞的外泌体中高表达,下调ciRS-7具有抑制胰腺癌细胞糖酵解的作用。