NYGGF4基因过表达对成熟脂肪细胞线粒体形态及动力学的影响

目的 探讨NYGGF4基因过表达对成熟3T3-L1脂肪细胞线粒体形态及动力学的影响.方法 以3T3-L1前体脂肪细胞为载体,建立NYGGF4基因稳定过表达细胞株,以空载质粒转染的细胞为对照,将前体脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞.采用透射电镜观察成熟脂肪细胞的线粒体形态,采用荧光定量PCR技术检测成熟脂肪细胞中线粒体融合基因(Mfn)1 mRNA、Mfn2 mRNA、线粒体动态相关基因(Drp)1 mRNA的表达水平.采用Western blot方法检测Mfn1蛋白、Mfn2蛋白、Drp1蛋白的表达水平.结果 1.电镜观察发现NYGGF4基因过表达的成熟脂肪细胞线粒体体积变小、数量明显减少,线粒体嵴断裂、减少、消失,部分线粒体肿胀,甚至呈空泡状;对照组成熟脂肪细胞的线粒体形态基本正常,线粒体嵴清晰可见,线粒体无明显肿胀、皱缩.2.NYGGF4基因过表达成熟脂肪细胞Mfn1 mRNA及Mfn1蛋白表达水平均显著高于对照组.3.NYGGF4基因过表达成熟脂肪细胞的Mfn2 mRNA、Drp1 mRNA及相应蛋白表达水平与对照组比较差异均无统计学意义.结论 在3T3-L1成熟脂肪细胞中,NYGGF4基因过表达可导致线粒体形态发生变化、数量减少,同时上调Mfn1 mRNA和Mfn1蛋白表达水平,提示NYGGF4基因在成熟脂肪细胞中过表达能影响细胞线粒体形态及动力学.     

NYGGF4基因过表达对脂肪细胞胰岛素敏感性及分泌功能的影响

目的：观察肥胖相关新基因NYGGF4过表达对脂肪细胞的胰岛素敏感性及分泌功能的影响。方法：体外培养稳定转染NYGGF4基因（NYGGF4-pcDNA3.1）的3T3-L1前体脂肪细胞,以转染空载体（pcDNA 3.1）的3T3-L1细胞为对照,胰岛素加地塞米松加1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(MDI)方案诱导细胞分化成熟,液闪仪测定3H标记的葡萄糖摄取率,Western blot检测葡萄糖转运体4（GLUT4）的表达及转位;采用ELISA双抗体夹心法检测培养上清中TNF-α、IL-6、脂联素、抵抗素4种细胞因子的水平。结果：NYGGF4过表达显著降低胰岛素刺激的葡萄糖摄取率（P<0.05）。NYGGF4过表达对总的GLUT4的表达量没有影响,但明显降低胰岛素刺激的GLUT4由细胞浆向细胞膜的转位（P<0.05）。过表达NYGGF4的脂肪细胞其培养上清中TNF-α、IL-6、脂联素及抵抗素的分泌水平与对照组相比差异无显著性（P>0.05）。结论：NYGGF4基因过表达通过下调胰岛素刺激的GLUT4的转位而减少脂肪细胞的葡萄糖摄取率,提示脂肪细胞对胰岛素的敏感性降低,而对脂肪细胞的分泌功能无明显影响。［中国当代儿科杂志,2009,11（10）：846-849］     

LYRM1基因沉默对成熟脂肪细胞线粒体形态及其相关基因的影响

目的 探讨LYRM1基因沉默对成熟脂肪细胞线粒体形态及相关基因的影响.方法 以3T3-L1前体脂肪细胞为工具细胞,建立LYRM1基因沉默细胞株,以转染空载质粒的3T3-L1脂肪细胞作为阴性对照,将前体脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞,采用油红O染色观察脂肪细胞分化状态,采用透射电镜观察成熟脂肪细胞的线粒体形态,采用荧光定量PCR技术检测成熟脂肪细胞中线粒体融合基因(Mfn) 1/2 mRNA、线粒体动态相关基因(Drp)1 mRNA、线粒体分裂基因(Fis)l mRNA的表达水平.结果 1.油红O染色诱导分化第8天的脂肪细胞,发现85％以上脂肪细胞已分化为成熟脂肪细胞,细胞形态大而圆,胞质含大量被油红O染成亮红色的脂滴,比较发现2组细胞无论脂滴的大小、数量均无显著差异.2.透射电镜观察发现2组细胞的线粒体形态基本正常,线粒体无明显肿胀、皱缩,线粒体嵴清晰可见,2组细胞间线粒体数目无明显差异.3.LYRM1基因沉默成熟脂肪细胞的Mfn2 mRNA表达水平显著高于对照组成熟脂肪细胞.4.LYRM1基因沉默成熟脂肪细胞的Mfnl mRNA、Drpl mRNA和Fisl mRNA表达水平与对照组成熟脂肪细胞的表达水平无明显差异.结论 LYRM1基因沉默能够引起成熟脂肪细胞Mfn2 mRNA表达水平升高,对线粒体形态结构并无显著影响,提示LYRM1基因沉默可部分影响成熟脂肪细胞线粒体形态相关基因.     

鞘氨醇激酶基因在3T3-L1脂肪细胞诱导分化中的表达水平

目的 探讨鞘氨醇激酶基因(SPHK）在3T3-L1脂肪细胞诱导分化中表达水平的变化。方法采用细胞培养和RT-PCR技术检测细胞分化不同阶段脂肪细胞中SPHK基因表达水平。结果1．SPHK基因在3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化初期表达呈明显上调趋势；2．随着脂肪前体细胞分化成熟，该基因表达水平明显低于诱导分化初期的基因表达水平。结论 SPHK基因可能参与脂肪细胞分化的调控过程，与肥胖发生有一定联系。     

解偶联蛋白4基因在3T3-L1脂肪细胞诱导分化中的表达水平

目的　观察 3T3 L1脂肪前体细胞诱导分化过程中解偶联蛋白 4 (UCP4 )基因表达水平变化 ,探讨UCP4基因与肥胖发生之间的关系。方法　体外培养 3T3 L1细胞 ,诱导细胞分化 ,采用RT PCR技术在细胞分化成熟的不同时段检测脂肪细胞中UCP4基因mRNA表达水平。结果　UCP4基因高表达于 3T3 L1脂肪前体细胞中 ,随细胞分化成熟该基因表达水平渐下调。UCP4基因表达水平在诱导分化前 (d - 1)至d0、d0～ 3、d4～6、d7～ 8、d9～ 10内无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ,余各时段表达水平均有显著差异 (P均 <0 .0 1)。结论　UCP4基因与肥胖发生相关 ,其在 3T3 L1细胞分化过程中表达逐渐下调可能有利于脂肪细胞的脂质积聚     

肥胖相关新基因NYGGF4对3T3-L1脂肪前体细胞的增殖调节作用

目的 观察NYGGF4基因过表达对3T3-L1脂肪前体细胞增殖的影响,探讨该基因在肥胖发生发展中的作用.方法 采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增NYGGF4开放阅读框(ORF)的全长,通过双酶切连接法构建NYGGF4-pcDNA3.1真核表达载体.采用脂体法转染3T3-L1前体脂肪细胞,以pcDNA3.1空载和未转染细胞为对照.遗传霉素(G418)压力筛选稳定转染细胞株,PCR鉴定转染细胞的NYGGF4的mRNA水平.采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测稳定转染细胞株连续7 d的生长状态,以转染空载和未转染正常3T3-L1为对照,绘制生长曲线.采用SPSS 10.0软件进行统计学分析.结果 1.稳定转染细胞株有NYGGF4基因的表达,而pcDNA3.1空载未见人源性NYGGF4的表达;2.转染NYGGF4基因的3T3-L1细胞增殖速度明显较未转染和转染空载的3T3-L1细胞加快.结论 新基因NYGGF4可明显促进3T3-L1脂肪前体细胞的增殖,可能影响肥胖的发生发展.     

3T3-L1脂肪细胞分化中促酰化蛋白对脂肪因子肾上腺髓质素mRNA表达的影响

目的 研究3T3-L1脂肪细胞分化过程中脂肪因子肾上腺髓质索(AM)mRNA表达变化及促酰化蛋白(ASP)对细胞分化过程中AM mRNA表达的影响,探讨ASP在脂肪代谢中的作用.方法 1.应用反转录(RT) -PCR法检测诱导分化4个时点(0d、1d、2d、3d)的3T3-L1脂肪细胞中AM mRNA的表达水平;2.对诱导分化过程中不同时间点(0h、12 h、24h、48 h)的3T3-L1脂肪细胞给予适合浓度的ASP处理,并设立相应空白对照,应用RT-PCR法检测细胞中AM mRNA的表达.结果 (1)脂肪细胞诱导分化各时间点(0d、1d、2d、3 d)AM mRNA均明显表达,且表达水平呈时间依赖性递减;(2)0 h、12 h和24h3个时点ASP组细胞中AMmRNA表达水平较空白对照组均显著下降(P＜0.05,0.01),而48 h时间点ASP组细胞中AM mRNA表达水平与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 ASP促成脂作用可能与其调节脂肪细胞分化过程中脂肪因子AM mRNA表达密切相关.     

3T3-L1前脂肪细胞中烟碱样乙酰胆碱受体α7对脂肪因子肾上腺髓质素mRNA表达的影响

目的研究3T3-L1前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中是否有胆碱能系统物质mRNA的表达,及烟碱样乙酰胆碱受体(nAChR)α7功能状态对脂肪因子肾上腺髓质素(AM)mRNA表达的影响,初步阐明脂肪细胞中非神经胆碱能系统与肥胖、胰岛素抵抗及其他脂代谢性疾病的关系。方法以3T3-L1前脂肪细胞和诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞为研究对象,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中是否有乙酰胆碱酯酶(AChE)、胆碱乙酰转移酶(ChAT)和nAChR α7三种胆碱能系统主要组分的mRNA表达;对前脂肪细胞及成熟脂肪细胞分别予不同水平的广谱nAChR激动剂尼古丁、特异性nAChR α7激动剂氯化胆碱及特异性nAChRα7拮抗剂甲基牛扁亭碱处理12、24、36h,并设立相应处理时间的空白对照组,应用RT-PCR方法检测前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中AM mRNA的表达。结果1.RT-PCR方法证实在3T3-L1前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中均有AChE、ChAT、AChR α7的mRNA表达。2.给予不同剂量的尼古丁和氯化胆碱,干预作用不同时间,3T3-L1前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中AM mRNA表达水平与相应的空白对照组比较均呈剂量依赖性升高(P<0.05或P<0.01),但随干预作用时间延长,这种剂量依赖性上调效应减弱。二种激动剂以氯化胆碱的剂量依赖性上调效应更明显。而相同剂量下不同作用时间的处理组间无统计学差异(Pa>0.05)。3.拮抗剂甲基牛扁亭碱对3T3-L1前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中AM mRNA表达则呈明显的剂量依赖性抑制作用(P<0.05或P<0.01)。结论3T3-L1前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中存在非神经元型胆碱能系统,其中nAChR α7调节脂肪因子AM mRNA的表达,脂肪组织中非神经元型胆碱能系统的重要组分nAChR α7可能在肥胖、胰岛素抵抗及其他脂代谢相关疾病的病理生理过程中发挥重要作用。     

丝裂原活化蛋白激酶8基因在3T3-L1细胞诱导分化中表达水平的变化及肿瘤坏死因子-α对其调节的作用

目的观察丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)基因在3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化过程中表达水平的变化,探讨TNF-α,对成熟脂肪细胞中MAPK8基因表达水平的调节作用,分析MAPK8基因与脂肪细胞分化、脂质形成及肥胖间的关系。方法体外培养3T3-L1脂肪前体细胞,在诱导其分化成熟的基础上,采用RT-PCR技术检测诱导分化不同时段(0~10 d)脂肪细胞中MAPK8基因的表达水平;应用重组TNF-α(0.1,1.0,10.0μg/L)干预分化成熟的脂肪细胞,采用RT-PCR技术检测TNF-α干预后不同时间(0.5,2,6,12,24 h)脂肪细胞中MAPK8基因的表达水平。结果1.3T3-L1前体脂肪细胞中,MAPK8基因表达水平较高。应用地塞米松(DEX)、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(MIX)、胰岛素后脂肪细胞逐渐分化成熟,MAPK8基因mRNA表达水平逐渐减低。MAPK8基因表达水平除在诱导分化前至d4、d2~5、d6~10时段内无显著性差异外(P均>0.05),余各时段间表达水平均有显著差异(P均<0.01);2.不同浓度重组TNF-α干预成熟脂肪细胞,均能显著上调MAPK8基因的表达,并呈现随TNF-α浓度增加、刺激时间延长,表达调控作用逐渐增强的总体趋势。TNF-α浓度为0.1μg/L时,MAPK8基因的表达水平于干预12 h时间点开始出现明显上调;浓度增加至1.0μg/L时,MAPK8基因表达水平开始显著上调的时间点提前至干预2 h时,但24 h时间点的表达水平未见继续上调;TNF-α浓度为10.0μg/L时,除2 h时间点MAPK8基因表达开始显著上调外,12~24 h时段的表达也呈上调趋势。结论1.MAPK8基因在3T3-L1细胞分化过程中表达逐渐下调,其机制可能有利于脂肪细胞的分化成熟和脂质积聚,与肥胖发生有关;2.TNF-α能够上调成熟脂肪细胞中MAPK8基因的表达,其效应总体趋势上呈现剂量及时间反应性特征。     

多不饱和脂肪酸对3T3-L1细胞分化过程中脂肪聚积的影响

目的 体外探讨n-6和n-3二类多不饱和脂肪酸(PUFAs)对脂肪细胞分化过程中脂肪聚集的影响及其机制.方法 对313-L1细胞进行体外诱导分化实验,使用n-6 PUFAs和n-3 PUFAs对细胞进行干预.在细胞被诱导分化的第5天,在培养基中分别加入油酸(OA)、花生四烯酸(AA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)(0.125 mmol/L)培养12 h,以牛血清清蛋白作为对照;然后应用油红O染色观察细胞形态学变化.采用甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法(GPO-PAP)对细胞内和培养基中三酰甘油(TG)水平进行测定;过氧化物酶增长因子活化受体γ(PPARγ)表达的测定应用EIJSA方法.结果 显微镜下观察显示,与对照组比较,在培养基中分别加入AA、EPA和DHA后细胞内脂滴颗粒减少,细胞和培养基中TG水平均有所降低(F=3.96,4.34 Pa＜0.05),但3组间未见显著性差异;而在培养基中加入OA后,细胞内脂滴数量和TG水平无显著性变化.同时,脂肪酸干预后细胞培养基中PPARγ水平在OA、AA、EPA和DHA组均显著高于对照组(F=9.56 P＜0.01);进一步分析显示DHA组PPARγ表达量显著低于OA、AA和EPA组(F=6.87 P＜0.01).结论 n-6与n-3 PUFAs具有同样的抑制3T3-L1细胞脂肪聚积的作用,但DHA对PPARγ表达的影响作用明显小于其他脂肪酸.     

肥胖相关新基因NYGGF4的系列研究

本研究小组前期以抑制性差减杂交技术筛选肥胖与健康人腹膜后脂肪组织中的差异表达基因,结果发现一条新基因在肥胖患儿脂肪组织中表达量明显升高,将其命名为NYGGF4。2006年以来本研究小组致力于该基因的功能研究,系统、全面地研究了该基因的生物学特性及功能,基因表达、调控的特点,现将这些系列研究进展作一综述。     

NYGGF4小鼠同源基因mRNA在遗传性ob／ob肥胖小鼠体内的表达

目的观察NYGGF4小鼠同源基因在遗传性ob/ob肥胖小鼠(以下简称ob/ob小鼠)与正常C57/BL6J小鼠脂肪组织中的差异表达,分析NYGGF4小鼠同源基因在ob/ob小鼠体内的多组织表达特征,探讨NYGGF4小鼠同源基因与肥胖之间的关系。方法雄性10周龄ob/ob小鼠、正常小鼠(对照组)各12只,以乌拉坦(0.4g/kg)深度麻醉后取腹膜后脂肪、肝、脑、骨骼肌、心肌、结肠、肾、小肠、肺、胸腺、脾等组织,采用RT-PCR技术检测NYGGF4小鼠同源基因的mRNA表达水平,比较NYGGF4小鼠同源基因在ob/ob小鼠与正常对照小鼠腹膜后脂肪组织中的差异表达及在ob/ob小鼠各组织中的表达。结果1.ob/ob小鼠体质量[(38.94±1.97)g]显著高于对照组小鼠[(18.47±0.66)g](P<0.001);2.NYGGF4小鼠同源基因在ob/ob小鼠腹膜后脂肪组织中的表达水平[(89.18±8.31)%]显著高于对照组小鼠[(56.84±9.54)%](P<0.001);3.NYGGF4小鼠同源基因在肝脏、脑、腹膜后脂肪、骨骼肌、心肌、结肠、肾脏等组织中均有表达,从高至低依次为肝脏>脑>腹膜后脂肪>骨骼肌>心肌>结肠>肾脏,虽在小肠、肺、胸腺、脾等组织中未检测到阳性信号,但总体上呈现多组织表达特征。结论NYGGF4小鼠同源基因可能参与肥胖发生的病理生理机制,并在肝脏、脑、腹膜后脂肪、骨骼肌等胰岛素作用的靶组织中表达水平相对较高。     

新基因NYGGF4在肥胖患儿脂肪组织中的表达验证及生物信息学分析

目的 验证新基因NYGGF4在肥胖患儿脂肪组织中的表达,初步探讨NYGGF4的生物信息学特征.方法 采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术验证肥胖与健康儿童脂肪组织中NYGGF4基因的表达差异,应用DNA Star、Blast、ProtParam、SOPMA、TargetP、TMHMM、ProtScale、SOSUI、InterproScan和SMART等软件或数据库分析NYGGF4的核苷酸基本特征、蛋白质理化性质、二级结构、信号肽、跨膜结构域、疏水性/亲水性、可溶性、结构域及亚细胞定位等.采用SPSS 11.0软件进行统计学分析.结果 NYGGF4基因是一个未知的新基因,差异高表达于肥胖患儿脂肪组织中,生物信息学分析该基因cDNA全长1 527 bp,开放阅读框(ORF)长753 bp,编码250个氨基酸,预测相对分子质量28 271,定位在胞质,蛋白序列分析显示无跨膜螺旋结构,为一非分泌、可溶的亲水性蛋白,蛋白结构域分析提示NYGGF4的N端有一较短的亲脂性靶向序列、C端有一PTB结构域.结论 NYGGF4基因是一差异高表达于肥胖患儿脂肪组织中的新基因,可能是胞质内一个信号转导分子,在肥胖的发生发展过程中发挥重要功能,有进一步研究的价值.     

PRNP基因在3T3-L1脂肪前体细胞分化过程中的表达及肿瘤坏死因子-α对其调节作用

目的 探讨3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化过程中PRNP基因表达水平的变化及TNF-α对其调节作用.方法 体外培养3T3-L1前体脂肪细胞,胰岛素加地塞米松加1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(MDI)方案诱导3T3-L1细胞分化成熟,并收集分化前、分化0～10 d各时段细胞,采用RT-PCR技术检测诱导分化不同时段3T3-L1细胞PRNP基因表达水平;同时在成功诱导3T3-L1细胞分化成熟的基础上,应用不同水平TNF-α(0.1、1.0、10.0 μg/L)干预分化后的成熟脂肪细胞(第10天),收集TNF-α刺激前(0 h)及刺激后0.5、2.0、6.0、12.0、24.0 h的脂肪细胞,通过RT-PCR测定TNF-α干预前后不同时间点脂肪细胞中PRNP基因表达水平.采用Excel软件进行统计学分析.结果 1.PRNP基因低表达于3T3-L1脂肪前体细胞中,随细胞分化成熟该基因表达水平逐渐上调,至分化第10天其表达水平最高.PRNP基因表达水平除在诱导分化前(第-1天)至第4天、第2～5天、第6～10天时段内无显著性差异外(Pa＞0.05),其余各时段间表达水平均有显著性差异(Pa＜0.05);2.在分化前的3T3-L1脂肪细胞和成熟脂肪细胞中,不同水平TNF-α(0.1、1.0、10.0 μg/L)均能在短时间内明显抑制PRNP基因mRNA的表达,且呈时间依赖性.结论 PRNP基因可能参与3T3-L1脂肪细胞分化及脂质积聚过程;不同水平重组TNF-α对成熟脂肪细胞的PRNP基因表达具有抑制作用,其抑制效应总体趋势上呈时间依赖性.