HIV-1侵染机体多种组织细胞的分子生物学研究

①目的探讨ＨＩＶ－１是否能够侵染及整合在多种组织细胞的ＤＮＡ中。②方法采用套式ＰＣＲ对来自艾滋病病人的肺、脑、肾、肌肉及口腔脱落细胞标本进行ＨＩＶ－１前病毒ｐｏｌ基因的检测，并根据外侧引物ＰＣＲ和套式引物ＰＣＲ敏感性对原始模板数量进行半定量检测。③结果采用套式引物ＰＣＲ可以在艾滋病病人的肺、脑、肾、肌肉及口腔脱落细胞ＤＮＡ标本中检出ＨＩＶ－１前病毒ｐｏｌ基因，而采用外侧引物ＰＣＲ仅在肺、脑细胞ＤＮＡ标本中检出了该基因。④结论ＨＩＶ－１可以侵染机体的多种组织器官并发生整合     

随机扩增多态DNA技术在地高辛标记HCMV DNA探针中的应用研究

应用ＲＥＡＰＤ－ＰＣＲ技术结合地高辛非放射生标记制备了人巨细胞病毒ＤＮＡ探针，并与常规随机引物法进行对照。ＲＡＰＤ－ＰＣＲ制备的ＨＣＭＶ ＤＮＡ探针长度呈多态性，扩增过程中不需合成特异引物，探针特异性强，产量高，用５０ｍｇ ＨＣＭＶ ＤＮＡ模板即可制备８．０μｇ探针；标记体系中ＲＡＰＤ－ＰＣＲ方法Ｄｉｇ－ｄＵＴＰ浓度为５．２％。     

单纯疱疹病毒I型胸苷激酶基因的扩增,克隆和测序

目的：对单纯疱疹Ｉ型胸苷激酶基因扩增，克隆和测序。方法：从单纯疱疹病毒Ｉ型（ＨＳＶ－１）１７ｓｙｎ株感染的ＢＨＫ２１细胞上清液中提取ＨＳＶ－１基因组ＤＮＡ，以此为模板，用ＰＣＲ方法扩增胸苷激酶（ＴＫ），将扩增的片段克隆入载体ｐＵＣ１８中，并进行测序。结果：除终止码外，ＨＳＶ－１ＴＫ基因全部编码区１１８２ｂｐ，编码３７６个氨基酸，其中含１２个蛋氨酸，４个半胱氨酸，ＴＫ的第３７６个氨基酸，其中含１２个     

随机扩增多态DNA技术在地高辛标记HCMV DNA探针中的应用研究

应用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ技术结合地高辛非放射性标记系统制备了人巨细胞病毒ＤＮＡ探针，并与常规随机引物法进行对照。ＲＡＰＤ－ＰＣＲ制备的ＨＣＭＶＤＮＡ探针长度呈多态性，扩增过程中不需合成特异引物，探针特异性强，产量高，用５０ｎｇＨＣＭＶＤＮＡ模板即可制备８．０μｇ探针；标记体系中ＲＡＰＤ－ＰＣＲ方法Ｄｉｇ－ｄＵＴＰ浓度为５．２％。表明ＲＡＰＤ－ΡＣＲ技术可用于少量ＤＮＡ模板制备大量ＤＮＡ探针，适用于原位杂交等需高浓度探针的核酸杂交及临床大量标本的测试，是一种经济方便的探针制备技术     

宫颈鳞状上皮癌蜡块中 HPV16 感染检测方法的比较研究

分别用原位杂交（ＩＳＨ）、多聚酶链反应（ＰＣＲ）和原位多聚酶链反应（ＩＳ－ＰＣＲ）方法，检测３９例宫颈鳞状上皮癌石蜡切片中ＨＰＶ的感染。ＩＳＨ的检出率为４６．２％（１７／３９），明显低于ＩＳ－ＰＣＲ的６６．７％（２６／３９，Ｐ＜０．０１）和ＰＣＲ的８４．６％（３３／３９，Ｐ＜０．０１）。用常规ＩＳＨ和地高辛标记探针能检出宫颈鳞状上皮癌ＨＰＶ１６感染的表皮细胞，而用ＩＳ－ＰＣＲ方法在同样标本中可显示出更多的ＨＰＶ１６阳性表皮细胞，并且着色更深。ＰＣＲ方法敏感性最高，但它不能用于组织细胞内的ＨＰＶ１６ＤＮＡ精确定位。     

反转录病毒介导基因转移治疗脑肿瘤的安全性研究：Ⅰ.具有？…

目的：检测反转录病毒介导的脑肿瘤基因治疗中具有复制能力野生型反转录病毒（ＲＣＲ）。方法．；ＲＣＲ检测主要方法有：ＤＮＡ聚合酶链式反应（ＰＣＲ），反转录ＰＣＲ（ＲＴ／ＰＣＲ）。Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交以及ｎｅｏ基因和ｌａｃＺ基因的补救分析。结果：建立了ＰＣＲ的检测系统，从ＤＮＡ水平、ＲＮＡ水平和病毒活体水平对产ＨＳＶ＿ＴＫ病毒我装细胞（ＴＫ／ＶＰＣ），Ｃ６转ＴＫ基因细胞和实验动物血液可能存在的ＲＣＲ野生型     

原位逆转录PCR间接法检测人大肠癌组织和细胞株中CD44V6m …

探讨用原位逆转录ＰＣＲ间接法检测人类大肠癌组织及大肠癌细胞株内ＣＤ４４Ｖ６ｍＲＮ的表达。方法在大肠癌组织冰冻切片及ＨＴ２９和ＬｏＶｏ大肠癌细胞爬片上，先作蛋白酶Ｋ及ＤＮａｓｅ消化处理，再行逆转录、原位ＰＣＲＦＹ ＦＵ Ｔ ＲＹ ＦＵ ＲＧＤＲ ＷＵＧ ＶＳ ＵＱ ＳＷ     

HIV—1侵染要体多种组织细胞的分子生物学研究

探讨ＨＩＶ－１是否能够侵染及整合在多种组织细胞的ＤＮＡ中。２．方法 采用套式ＰＣＲ对来自艾滋病病人的肺，脑，肾，肌肉及口腔脱落细胞标本进行ＨＩＶ－１前病毒ｐｏｌ基因的检测，并根据外侧引物ＰＣＲ和套式引物ＰＣＲ敏感性对原始模板数量进行半定量检测。３．结果 采用套式引物ＰＣＲ可以在艾滋病病人的肺，脑，肾，肌肉及口腔脱落细胞ＤＮＡ标本中检出ＨＩＶ－１前病毒ｐｏｌ基因，而采用外侧引物ＰＣＲ仅在肺，脑细胞Ｄ     

α肿瘤坏死因子（TNFα）基因的分离鉴定及在人肝癌细胞中…

应用不连续密度梯度法分离获得人肝癌浸润性单个核细胞（ＴＩＭ），ＲＮＡ斑点杂交提示ＴＩＭ中有明显的ＴＮＦαｍＲＮＡ转录。经ＲＴ－ＰＣＲ扩增反应分离得到一特异的７００ｂｐ左右的ＤＮＡ片段，ＤＮＡ序列分析证实这一ＤＮＡ片段中包含编码人ＴＮＦα成熟肽所需的全部ｃＤＮＡ序列。将这一人ＴＮＦαｃＤＮＡ克隆到真核细胞表达质粒ｐＳＶＫ３，获得真核细胞表达重组质粒ｐＳＶＫ３－ｔｎｆ，用磷酸钙沉淀法将ｐＳＶＫ３－ｔｎ     

应用PCR技术诊断单疱病毒性角膜炎

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术对临床诊断活动期ＨＳＫ３３眼,匐形性角膜溃疡５眼,原因不明角膜炎５眼进行ＨＳＶ－１ＤＮＡ检测。活动期ＨＳＫ具上皮病变者３０眼中２４眼检出ＨＳＶ－１ＤＮＡ,５眼匐形性角膜溃疡全部未检出ＨＳＶ－１ＤＮＡ;５眼原因不明角膜炎中１眼检出ＨＳＶ－１ＤＮＡ,表明ＰＣＲ是一种快速、灵敏、特异性强的方法,对角膜炎的早期诊断及鉴别诊断具有重要意义。     

一种改进的提取人外周血和组织线粒体DNA的方法

目的：建立一种简便、快捷地从人外周血和组织中制备高质量线粒体DNA的方法。方法：以差速离心法分离线粒体,用碱性SDS法裂解线粒体膜,释放线粒体DNA后用酚／氯仿抽提,TE或ddH2O溶解。然后将所得线粒体DNA进行纯度鉴定并和其他现有方法制备的线粒体DNA用PCR进行长片段扩增,比较扩增效果。结果：用改进的方法制备的线粒体DNA中没有检测到核DNA,并能有效扩增8kb长的目的片段。结论：改进后的方法简便、快捷,制备的线粒体DNA纯度高,也有利于长片段PCR扩增。     

改良菌落PCR快速鉴定TRIM28基因阳性重组子的方法研究

目的:建立简便、可靠基因克隆菌落阳性重组子的筛选方法。方法:应用普通菌落PCR和改良的菌落PCR方法对TRIM28基因的阳性重组体进行阳性重组子的分析比较,同时探讨了PCR反应体系中模板浓度和DMSO对于扩增效率的影响。并对鉴定结果为阳性的克隆进行了进一步酶切和蛋白诱导表达分析。结果:运用改良的菌落PCR法简单快捷,结果可靠,反应体系中DMSO的浓度为4%左右可以很好地促进GC富集DNA模板的PCR扩增。其方法的可靠性得到了酶切验证和重组蛋白表达证实。结论:应用改良方法可以用于快速有效地筛选阳性重组菌落。     

Detection of mitochondrial DNA deletion by a modified PCR method

Objective: To develop a simple and efficient method for detecting small populations of mitochondrial DNA deletion. Methods: Peripheral blood cell DNA was obtained from a victim who was aecidently exposed to a ^60Co radiation source 11 years ago. Using the DNA as template, PCR was performed to generate multiple products including true deletions and artifacts. The full length product was recovered and used as template of secondary PCR. The suspicious deletion product of mtDNA could be confirmed if it was only yielded by first PCR. Using either original primers or their nested primem, the suspicious deletion product was amplified and authenticated as true deletion product. The template was recovered and determined to be a deletion by sequencing directly. Results: A new mtDNA deletion, spanning 889 bp from nt11688 to nt12576, was detected in the peripheral blood cells of the victim. Conclusion: The new PCR-based method is more efficient in detecting small populations of mtDNA deletion than other routine methods. MtDNA deletion is found in the victim, suggesting there is relationship between the deletion and phenotypes of the disease.     

聚合酶链反应技术检测禽网状内皮组织增殖病病毒

目的建立聚合酶链反应(PCR)技术检测禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的方法。方法提取感染REV-T和脾坏死病毒(SNV)的SPF鸡胚成纤维细胞DNA为模板,利用前病毒长末端重复序列(LTR)区引物进行扩增。采集肿瘤病鸡,以及人工感染REV 28 d后鸡肝脏、脾脏、肾脏、心脏、胸腺、法氏囊等器官,进行扩增。同时将采集的脏器组织,进行HE染色和免疫组化试验(IHC)。结果REV-T感染的组织未检测出电泳条带,而SNV感染的细胞中检测到了一条300bp特异而清晰的电泳条带,而且SNV感染的鸡组织中,PCR方法检测到了特异的条带。通过HE染色和免疫组化技术观察到了肿瘤组织,肿瘤细胞的形态、分布。结论PCR检测REV更快捷,特异更好。     

检测HBVDNAPCR技术关键因素的探索

本文通过实验比较，选用优化方案，建立了适合基层临床实验室简便稳定的检测ＨＢＶＤＮＡＰＣＲ方法。在ＤＮＡ模板的制备中采用合适的螯合剂除去样品中干扰扩增的物质、保护模板免受高温降解，从而提高模板扩增量；采用含有Ｔａｑ酶的ｍａｓｔｅｒｍｉｘ使该法操作简化，具有良好的重复性和稳定性，确立最适反应条件解决ＰＣＲ实验中一些常见问题。并将自制试剂盒作了临床初步应用。     

人外周血细胞线粒体DNA中存在特大片段缺失突变

了解线粒体ＤＮＡ大片段缺失突变及其意义。方法采用６种方法提取人外周血细胞ＤＮＡ,,其中１种方法先分离线粒体,再抽提线粒体ＤＮＡ。以得到的人外周血细胞ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增,其产生经琼脂糖凝胶回收后与ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接、转化、测序。结果６种方法抽提ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增后,产物电泳行为相同,发现人血细胞线粒体ＤＮＡ存在１３１６２ｂｐ特大片段缺失突变。结论此缺失首首发现的,经测序证明为人线粒体ＤＮ     

两种获取牙龈卟啉单胞菌基因组DNA方法比较

目的：筛选方便、快捷、有效地获取细菌基因组DNA的方法。方法：采用UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒法和Chelex-100法获取患者龈下菌斑DNA，比较作为PCR扩增模板检测牙龈卟啉单胞菌感染位点的检出率差异，并对2种方法进行比较。结果：试剂盒法与Chelex-100法对牙龈卟啉单胞菌的感染位点检出率差异无统计学意义，但Chelex-100法提取DNA更简单、快速。结论：Chelex-100法抽提细菌基因组DNA适用于对大样本牙周炎患者作细菌学检测分析。     

石蜡包埋组织快速DNA提取方法在诊断病理PCR分析中的应用研究

目的 改良石蜡组织DNA快速提取方法的流程,评价其提取效率,探讨其应用于病理诊断PCR分析的可行性.方法 选取包括淋巴瘤及反应性病变的52例存档蜡块,以缓冲液煮沸方法快速提取DNA,并以传统酚-氯仿抽提法和试剂盒提取法作为对照,采用PCR反应扩增看家基因β-Globin以确定模板DNA质量,并通过测序确定结果的可靠性;同时根据临床病理诊断选择性的进行免疫球蛋白重链基因(IgH)或T细胞受体γ基因(TCRγ)重排检测.结果 快速法提取DNA的浓度虽低于对照方法,但β-Globin扩增效率与对照方法相比差异没有统计学意义(P＞0.05),对IgH和TCRγ重排的检出率与对照相比差异亦没有统计学意义(P均＞0.05).测序结果显示扩增片段与目的基因序列完全符合.DNA可在-20 ℃保存至少4周.结论 快速DNA提取法可以从存档的石蜡包埋组织中提供足量的PCR反应模板,结果稳定可靠,且省时省力,在病理诊断PCR分析中具有应用价值.     

两种恒河猴肠道腺病毒基因型分型方法的比较分析

目的通过对两种肠道腺病毒基因型分型方法进行比较,以寻找出简便快速的肠道腺病毒基因型分型方法。方法采集57例圈养的恒河猴粪便样本,方法一：将粪便悬液过滤上清感染BSC-1细胞,提取病变细胞的基因组DNA进行PCR扩增,然后克隆、测序,确定病毒基因型;方法二：从粪便悬液过滤上清中直接提取基因组DNA进行巢式PCR扩增,对PCR阳性者进行克隆、测序以及基因型分型。结果 57份样本中,两种方法均有12份样本检出腺病毒,阳性率为21.1%（12/57）。系统进化分析显示,两种方法检出的腺病毒型别一致。提示这些序列主要可分为两大组：类SAdV-6组（2个非重复序列）和类SAdV-7组（9个非重复序列）。此外,有三个克隆,其最相似序列分别为：SAdV-1、SAdV-3和HAdV-52。结论虽然两种方法的敏感性、特异性一样,但方法二是直接提取粪便悬液过滤上清基因组DNA进行巢式PCR扩增,而无需方法一进行3次体外细胞感染实验后从病变细胞中提取基因组DNA进行PCR扩增,节省了实验的时间及成本,特别是避免了体外细胞感染过程中可能出现的污染,因此值得推荐。