小鼠胚胎干细胞移植后两种示踪方法的比较

目的 观察小鼠胚胎干细胞(ES)移植入大鼠脑内后绿色荧光蛋白(GFP)质粒和Thy-1抗体在指示细胞及细胞分化方面的特点.方法 标记方法一:将p-EGFP-N1质粒转入ES细胞,连续10代抗生素筛选表达GFP的GFP-ES,并将GFP-ES移植入活体大鼠脑内.取材后冰冻切片,在荧光显微镜下观察切片上的绿色荧光.标记方法二:直接移植胚胎干细胞后取材,用特异性抗小鼠Thy-1抗体作移植细胞的免疫组织化学染色,荧光显微镜下观察.另外,两种标记方法均做神经元和胶质细胞的特异抗体神经细胞核抗体(NeuN)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫组织化学染色,观察是否与GFP或Thy-1抗体双标记,以此判定细胞分化情况.结果 GFP质粒转化后的ES细胞团和单细胞均表达亮绿色的GFP,转化效率为30%;移植21d后,大鼠脑内存活的移植细胞仍表达GFP,但不能和NeuN、GFAP的染色双标记.大量Thy-1阳性的植入细胞和NeuN、GFAP双标记.结论 GFP质粒标记胚胎干细胞后移植可以较好地显示移植细胞,但不能观察细胞分化;而Thy-1抗体不仅在显示移植细胞上有较好的效果,还可以准确地标记分化细胞.     

免疫荧光试验诊断阿米巴病

免疫荧光试验(Immunofluores—cent test)又叫免疫荧光抗体试验(I—mmunofluorescent antibody test,IFA),是一种把免疫学的特异性和敏感性与显微镜形态学的精确性结合起来的血清学诊断技术。就是将荧光色素与特异性抗体(或抗原但少用)以化学方法相结合,制成荧光标记抗体,而抗体的免疫特异性不受影响。然后将此荧光标记抗体,在一定条件下染色标本,用荧光显微镜观察。如标本中的抗原能与荧光标记抗体发     

活体免疫染色评估眼底新生血管实验研究

目的 探寻更好地对视网膜新生血管(RNV)和脉络膜新生血管(CNV)及其渗漏作定性和定量分析的方法 .方法 13只小鼠随机分为RNV评估组(n=7)和CNV评估组(n=6).①RNV评估:取3只小鼠作为正常对照组,其余4只制作成未成熟视网膜病变(ROP)模型,分别于出生后第16天双眼内注射FITC标记的抗体或未经FITC标记的抗体以及空白组,12 h后直接视网膜铺片或用带荧光的二抗孵育后再铺片镜检.②CNV渗漏评估:激光诱导6只小鼠(12眼)制作CNV模型,随机平分为两组,分别于光凝后第7和14天眼内注射非荧光标记的抗体,12 h后腹腔内注射荧光素钠,并定量分析CNV面积及其渗漏面积.结果 FITC标记抗体组的视网膜表现出高荧光、高清晰度的视网膜结构血管和RNV,而非FITC标记抗体组的视网膜只选择性染色RNV,几乎无干扰荧光背景,可观察到细微变化,利于应用图像软件对RNV图片进行定性和定量分析.应用SPOT图像软件把CNV染色的图片与CNV渗漏荧光的图片进行叠加,能够明确区分CNV及其渗漏面积;第14天与第7天CNV面积及其渗漏面积比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 使用活体免疫染色技术可以方便地观察视网膜血管细微结构,并精准地定性和定量分析RNV和CNV渗漏.     

活体免疫染色评估眼底新生血管实验研究

目的 探寻更好地对视网膜新生血管(RNV)和脉络膜新生血管(CNV)及其渗漏作定性和定量分析的方法 .方法 13只小鼠随机分为RNV评估组(n=7)和CNV评估组(n=6).①RNV评估:取3只小鼠作为正常对照组,其余4只制作成未成熟视网膜病变(ROP)模型,分别于出生后第16天双眼内注射FITC标记的抗体或未经FITC标记的抗体以及空白组,12 h后直接视网膜铺片或用带荧光的二抗孵育后再铺片镜检.②CNV渗漏评估:激光诱导6只小鼠(12眼)制作CNV模型,随机平分为两组,分别于光凝后第7和14天眼内注射非荧光标记的抗体,12 h后腹腔内注射荧光素钠,并定量分析CNV面积及其渗漏面积.结果 FITC标记抗体组的视网膜表现出高荧光、高清晰度的视网膜结构血管和RNV,而非FITC标记抗体组的视网膜只选择性染色RNV,几乎无干扰荧光背景,可观察到细微变化,利于应用图像软件对RNV图片进行定性和定量分析.应用SPOT图像软件把CNV染色的图片与CNV渗漏荧光的图片进行叠加,能够明确区分CNV及其渗漏面积;第14天与第7天CNV面积及其渗漏面积比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 使用活体免疫染色技术可以方便地观察视网膜血管细微结构,并精准地定性和定量分析RNV和CNV渗漏.     

大鼠肝、肾组织及小鼠HepA腹水肝癌中丙酮酸激酶同工酶的免疫荧光定位

分别用兔抗大鼠L型或K型丙酮酸激酶(PyK)的抗体为第一抗体,并以异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG为第二抗体,用双抗体法对正常大鼠肝、肾切片及小鼠HepA腹水肝癌(简称HepA)细胞涂片作免疫荧光染色,借以探讨L型及K型PyK在这些组织中的定位。结果发现:(1)L型PyK主要存在于肝实质细胞,而K型PyK可能主要存在于柯否细胞。(2)HepA细胞的胞浆,被K型PyK抗体染色后呈强烈的荧光。(3)L型PyK仅存在于大鼠肾脏皮质中,而K型PyK在大鼠肾皮质和髓质中均较丰富。以上两型PyK在肾脏中的分布与皮质和髓质的糖代谢特性不同是相一致的。因肾髓质较皮质含有较多的K型PyK,故其氧化率低于皮质,而酵解率和Crabtree效应高于皮质。     

免疫荧光直接法在肾穿中的应用体会

免疫荧光技术又称荧光抗体法,是利用荧光色素标记抗体与组织切片或细胞涂片中相应抗原反应,形成抗原与抗体的复合物,借助紫外光激发荧光色素,在荧光显微镜下观察发出荧光的抗原抗体复合物,检测出抗原.免疫荧光直接法对肾小球疾病的病理诊断和研究是不可缺少的方法之一.     

抗F(ab)_2荧光抗体与外周血淋巴细胞的结合率

本文报导用荧光标记抗人F(ab＇)_2抗体测定正常人外周血B淋巴细胞的百分数。该试验将人Ig用胃蛋白酶处理,使其断裂为F(ab＇)_2和Fc两段,通过层析柱,获得F(ab＇)_2组分免疫家兔,将兔抗人抗体,通过离子交换层析,得到纯化的抗人F(ab＇)_2抗体,将该抗体用异硫氰酸荧光黄(FITC)标记为     

Tunel检测凋亡细胞后直接行HE染色法探讨

目的近一步确认TUNEL法检测石蜡组织切片中凋亡细胞在组织中具体分布位置及毗邻组织结构。方法取2例试剂盒中阳性对照石蜡切片和10例肝硬化石蜡组织切片进行法检测凋亡细胞,并以荧光显微镜激发荧光,观察组织细胞凋亡情况;荧光显微镜观察后直接省去脱蜡与复水程序,行HE染色。结果以生物素标记的地高辛抗体行SABC-FITC进行荧光显色后,所有石蜡组织切片均可以直接行HE染色。从而实现在同一张切片下实现两种检测方法,达到"一片两用"的效果。结论 TUNEL法检测凋亡细胞后可以直接行HE染色,有助于进一步确认何种细胞凋亡及其周围组织结构,而且缩短了HE染色的时间,在同一张切片上可以先后进行TUNEL法检测凋亡细胞和HE染色。     

抗角蛋白抗体在活细胞反应部位的观察

目的：观察抗角蛋白抗体在活细胞的反应部位。方法：以鼠抗人角蛋白的IgG单克隆抗体作用于培养中的Tca8113，以抗乙肝病毒表面抗原抗体做阴性对照，同时设置阳性对照和空白对照。细胞固定、包埋后与FITC标记的羊抗鼠IgG结合，用荧光显微镜观察细胞的荧光着色；以胶体金标记的羊抗鼠IgG抗体染色，用透射电镜观察胶体金颗粒的部位。结果：抗角蛋白mAb作用的Tca8133细胞胞质呈亮绿色，着色较均匀，细胞核未见着色。两种对照均未见着色。抗角蛋白抗体作用的Tca8133细胞胞质的中间丝有胶体金颗粒，与阳性对照组类似。阴性对照组及空白对照均未见胶体金颗粒。结论：抗角蛋白抗体可以进入活细胞，并结合于胞质中间丝。     

抗人脑胶质瘤单克隆抗体H_(12)的荧光标记

目的 :探讨H1 2 单克隆抗体的不同浓度对FITC荧光标记结果的影响。方法 :紫外吸收法测定抗体蛋白质浓度 ,透析标记法进行抗体荧光标记 ,并以ELISA法对抗体进行特异性鉴定及效价分析。结果 :标记前后抗体特异性经ELISA鉴定未见明显差异。结论 :①FITC荧光标记前抗体蛋白质浓度应达 (10～ 2 0 )mg mL ,才能得到合适的F P比值。②F P值在 1～ 2之间者较为理想 ,如果过标记的抗体F P >2则可导致非特异性染色的增加 ,增加假阳性率 ;标记不足F P <1则可导致假阴性率增加。③标记后虽可出现特异性下降和蛋白量的丢失 ;但特异性鉴定与标记前未见明显差异。故标记后抗体H1 2 的特异性适用于肿瘤组织与正常脑组织间界限的确定     

两种LsAB染色标记方法及其抗原修复方法的比较

目的 比较两种标记生物素链亲和素法(LsAB),并探讨抗原修复的最佳方法。方法 采用碱性磷酸酶(AP)LsAB法和辣根过氧化物酶(HRP)LsAB法染色肺癌合并慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者肺组织石蜡切片中类胰蛋白酶(tryptase)的抗肥大细胞类胰蛋白酶抗体(AA1,小鼠抗人),并比较染色效果;用高压、胰蛋白酶和微波三种方法进行抗原修复,比较修复效果。结果 AP-LsAB法染色比HRP-LsAB法背景清晰、颜色对比鲜明;高压修复效果优于胰蛋白酶和微波修复。结论 在肺组织免疫组化染色中推荐使用AP-LsAB法,并采用高压修复抗原。     

凋亡诱导配体TRAIL与细胞膜脂筏形成的关系

目的:探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)与细胞膜微结构域脂筏的关系.方法:采用间接免疫荧光流式细胞 术,分析K562细胞表面TRAIL分子的表达.用FITC标记的霍乱毒素B亚单位(CTx)对K562细胞的脂筏进行染色;用抗FITC 单克隆抗体(mAb)交联脂筏后,以兔抗TRAIL分子抗体及Cy3标记的羊抗兔抗体进行间接免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜 分析TRAIL分子与脂筏微结构域的关系.结果:FITC CTx和抗FITCmAb可使脂筏发生交联.脂筏交联的同时TRAIL分子发生 聚集.动态观察表明,抗FITC抗体作用20min后,脂筏发生交联,作用30min时交联最明显;随着脂筏的交联,TRAIL分子发 生聚集.抗FITC抗体作用40min后,脂筏交联程度减弱,且TRAIL分子逐渐被排除于脂筏之外.结论:抗FITC抗体可用于 CTx FITC脂筏染色后脂筏交联的研究.TRAIL分子可能与细胞膜脂筏微结构域有关.     

肾小球系膜细胞的分离和培养

目的分离、培养和鉴定正常人肾小球系膜细胞。方法筛网滤过分离正常人肾小球系膜细胞,同时采用免疫荧光技术,利用异硫氰酸荧光素(FITC)间接标记单克隆抗体:抗Ⅷ因子相关抗原抗体、抗结蛋白抗体、抗角蛋白抗体、抗细胞角蛋白抗体、抗Ⅳ型胶原抗体、抗纤维连接蛋白抗体、抗层粘连蛋白抗体对系膜细胞特有的中间微丝进行鉴定。并采用同期培养的同一来源的肾小球内皮细胞作对照。结果抗Ⅷ因子相关抗原、抗角蛋白和抗细胞角蛋白抗体表达均为阴性,而抗结蛋白抗体、抗Ⅳ型胶原抗体、抗纤维连接蛋白抗体、抗层粘连蛋白抗体为阳性,说明培养的细胞为系膜细胞。结论该种方法分离培养的细胞经过免疫荧光染色鉴定为肾小球系膜细胞。     

大肠杆菌O157∶H7异硫氰酸荧光素标记抗体的制备及评价

目的:制备高效价、高纯度、特异性好、荧光强度高及稳定的抗大肠杆菌O157∶H7 异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体,初步探讨其在大肠杆菌荧光免疫检测试验中的应用。方法：复苏培养E.coli O157∶H7标准菌株,甲醛灭活制备疫苗免疫家兔。4次免疫后,颈动脉采血分离血清,经辛酸-饱和硫酸铵法粗提后应用蛋白亲和层析柱HiTrap Protein G HP进行 gG纯化,借助SDS-PAGE电泳、BCA试剂盒法、间接ELISA法分别对蛋白纯度、蛋白含量及抗体效价进行测定。应用不同FITC与蛋白量比值以及不同标记反应条件对多克隆抗体进行标记。比较荧光抗体F485/535,结合差异性显著分析对FITC与蛋白量比值及反应条件进行合
理选择,应用标记抗体与E.coli O157∶H7和金黄色葡萄球菌混合菌液反应验证标记效果。结果：HiTrap Protein G进行E.coli O157∶H7多克隆抗体纯化的最佳纯化方法为35%、100%二梯度洗脱,制备抗体效价为1∶25　600,与沙门氏菌、阴沟肠杆菌等8种肠杆菌无交叉反应,最佳FITC与蛋白量比值为1∶10,最佳标记反应条件为20℃、2 h。由最佳条件制得的荧光抗体与E.coliO157∶H7反应明显 ,强荧光连续照射15 min后仍显示高亮度荧光反应,且不与金黄色葡
萄球菌反应。结论：本实验首次制备出纯度高、荧光强度高、持续时间长的E.coli O157：H7 FITC标记多克隆抗体,为E.coli O157：H7荧光免疫检测方法的建立完成了关键步骤。
     

肾小球系膜细胞的分离和培养

目的 分离、培养和鉴定正常人肾小球系膜细胞。方法 筛网滤过分离正常人肾小球系膜细胞，同时采用免疫荧光技术，利用异硫氰酸荧光素(FITC)间接标记单克隆抗体；抗Ⅷ因子相关抗原抗体、抗结蛋白抗体、抗角蛋白抗体、抗细胞角蛋白抗体、抗Ⅳ型胶原抗体、抗纤维连接蛋白抗体、抗层粘连蛋白抗体对系膜细胞特有的中间微丝进行鉴定。并采用同期培养的同一来源的肾小球内皮细胞作对照。结果 抗Ⅷ因子相关抗原、抗角蛋白和抗细胞角蛋白抗体表达均为阴性，而抗结蛋白抗体、抗Ⅳ型胶原抗体、抗纤维连接蛋白抗体、抗层粘连蛋白抗体为阳性，说明培养的细胞为系膜细胞。结论 该种方法分离培养的细胞经过免疫荧光染色鉴定为肾小球系膜细胞。     

量子点荧光技术标记口腔鳞癌细胞中bcl-2的研究

【目的】 利用量子点(QD)优良的光学性质对人舌癌Tca8113细胞内bcl-2进行特异性荧光标记,并与异硫氰酸荧光素(FITC)进行光稳定性比较。 【方法】 分别利用QD605nm和FITC,通过间接免疫荧光法,在激光共聚焦显微镜下观测人舌癌Tca8113细胞内bcl-2的表达,并激光连续照射1 h,用激光共聚焦显微镜自带软件Leica Confocal Software测量量子点QD605nm和FITC的荧光信号强度。 【结果】 激光共聚焦显微镜下可见人舌癌Tca8113细胞内bcl-2明显表达,量子点QD605标记的荧光信号比FITC更具特异性,且激光连续照射1 h, QD605nm标记的荧光未见明显衰减,而FITC标记的荧光1 h内已基本淬灭。【结论】 量子点荧光标记技术能对细胞内bcl-2进行标记,比传统的有机荧光具有更显著的优点。     

辣根过氧化物酶标记抗体的制备及细胞内病毒和立克次体抗原的检出

用不同方法提取的抗体lgG与辣根过氧化物酶(HRP)按戊二醛一步法和二步法制备过氧化物酶标记抗体,并用于检出细胞内病毒和立克次体抗原。日本乙型脑炎病毒感染小白鼠脑石蜡切片的酶标抗体染色光镜检查结果表明:病毒抗原分布在脑干和海马回神经元的胞体、轴突和树突样胞浆突起内。自然感染蜱血淋巴涂片中的斑点热立克次体经酶标抗体染色显示清晰的阳性反应。     

肝血管平滑肌脂肪瘤中肌样细胞的免疫组化观察

目的 :探索肝血管平滑肌脂肪瘤 (AML)主要细胞成分的特异免疫标记 ,以提高诊断水平。方法 :对 1例肝AML的多块组织做连续切片 ,以标记上皮、非上皮、神经组织、单核巨噬细胞、黑色素等 1 5种抗体做免疫组化染色 ,并以HMB 45与α SMA和CD 68做双重标记染色。结果 :易致误诊的肌样细胞 (MC)呈HMB 45阳性反应 ,对α SMA呈阴性反应。结论 :AML中的肌样成分并非一般平滑肌细胞 ,这为确诊提供了依据。     

α7-nAChR在海马星形胶质细胞上的表达

目的 探讨α7-nAChR亚基在体内、体外海马星形胶质细胞上的表达.方法 从大鼠脑中分离海马后进行冰冻切片,采用免疫荧光双染技术,首先用抗-GFAP抗体对星形胶质细胞进行鉴定,再观察α7-nAChR在星形胶质细胞上的表达.体外表达的研究在培养星形胶质细胞上进行,先分离获得新生SD大鼠的海马组织,提取并培养海马星形胶质细胞,纯化鉴定后,用配体结合实验和细胞免疫荧光双标分析α7-nAChR在星形胶质细胞上的表达.结果 海马组织中抗-GFAP染色阳性的细胞抗-α7-nAChR染色也呈阳性,但仅部分抗-α7-nAChR染色阳性的细胞抗-GFAP染色也呈阳性.体外纯化后的星形胶质细胞既能与FITC标记的α-BTX结合,荧光染色呈阳性,同时,细胞免疫荧光双标分析显示星形胶质细胞抗-GFAP和抗-α7-nAChR染色均呈阳性.结论 α7-nAChR在体内体外星形胶质细胞上均能正常表达.     

抗核抗体免疫荧光检测385例结果分析

抗核抗体(Antinuclear an tibody简称ANA),是机体免疫功能失调时产生的一种抗核抗原的自身抗体,对诊断自身免疫病具有重要意义。间接免疫荧光抗核抗体技术(indireet immunofluorescence ant-inuclear antibody technic简称IIFANA),是测定抗核抗体的一种常用方法。其原理是:抗核抗体与无种系特异性的细胞核抗原相结合,该复合物又可与标记荧光的抗人球蛋白相结合,借助于荧光光源细胞核即呈现荧光,表明抗核抗体阳性。近年来国内