利用电子差异展示方法克隆人类睾丸特异性新基因

目的 克隆一个新的人睾丸特异性基因.方法 运用电子差异展示方法筛选人类睾丸特异表达新基因,获得有差异显示的代表新基因的克隆重叠群,挑选其中一个克隆重叠群Hs.180197进行多组织RT-PCR验证该重叠群在人睾丸中的表达.然后从包含该重叠群的IMAGE克隆出发,采用生物信息学方法克隆一个人类新基因的全长eDNA序列.结果 新基因全长1197 bp,开放阅读框为504～806 bp,定位于6p21.1-p21.2.编码由100个氨基酸组成,相对分子质量为10 000,等电点为6.81的一个蛋白,该蛋白与已知蛋白无同源性.克隆实验验证该基因阅读框完全正确,推测其可能与精子生成相关,暂命名为TDRGI(restis development related gene 1),GenBank登录号为DQ168992.结论 电子差异展示方法与实验验证相结合用于发现人类功能新基因足行之有效的.     

Expression profile of a novel germ cell-specific gene,TSCPA, in mice and human

In order to identify novel genes involved in spermatogenesis, testis cDNA samples from Balb/C mice of different postnatal days were hybridized with the whole mouse genome Affymetrix chip to screen the testis-specific genes. The characteristics of the selected genes were analyzed by RT-PCR as well as other bioinformatic tools. A novel differentially expressed testis-specific gene （GenBank Accession No： NM_029042） in the developmental stages of testes was identified, and named TSCPA. Cellular mapping prediction of TSCPA indicated that its protein was probably expressed in nuclei, and one putative domain （aa 332 377） was anchoring domain of cAMP-dependent type Ⅱ PK. The result of subcellular localization of GFP-TSCPA fusion protein in Cos-7 cells showed that TSCPA protein was expressed in nuclei. RT-PCR analysis revealed that TSCPA was expressed specifically in mouse and human testis. TSCPA gene was expressed weakly in 21-day-old mouse testis and the expression was increased gradually from 38th day to 6th month of mouse testes. No expression of hTSCPA was found in cryptorchidism and Sertoli-cell-only syndrome patients. It was concluded that the expression profile of TSCPA in human and mice indicated that TSCPA might play an important role in spermatogenesis.     

半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族2相关新基因Rcet3的克隆

目的 利用NCBI中的DDD(数字差异显示)数据库及RT-PCR技术克隆睾丸等组织中特异表达的新基因.方法 利用NCBI中的DDD数据库首先电子克隆了Rcet3基因,并从成年小鼠睾丸组织中利用RT-PCR克隆出Rcet3全长基因,然后测序及序列分析.结果 序列分析显示,Rcet3基因全长cDNA为610bp,含4个外显子,编码一个140个氨基酸残基的蛋白,该蛋白含一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域,但缺少半胱氨酸蛋白酶抑制剂关键的作用位点,而这些位点对半胱氨酸蛋白水解酶的抑制作用足重要的.Rcet3在成年老鼠睾丸、附睾和大脑等生殖域中特异表达,睾丸中的表达高于附睾和大脑,Rcet3与半胱氨酸蛋白酶抑制家族2的Cres亚家族具有相似的特征.结论 Rcet3可能是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族2,Cres亚家族中的一个新成员.     

成年大鼠小脑差异表达基因的克隆

目的 分析成年大鼠小脑基因与新生大鼠小脑基因的差异表达并获取新的表达序列标签。方法 成年大鼠小脑来源的cDNA为受检者（tester）,新生大鼠小脑的cDNA为驱动者（driver）,进行差减杂交,经克隆、获得成年大鼠小脑差减杂交为。结果 共挑选出54个阳性克隆质粒,测序得到56个不同基因片段序列,其中有16个是大鼠中首次测得的表达序列标签,并被GenBank收录（BG946773～BG946788）。结论 用差减杂交法建立差异表达基因文库可快速筛选未知表达序列标签。     

丝氨酸/精氨酸蛋白特异激酶SRPK2在小鼠睾丸组织中的表达及意义

【摘要】 目的 通过研究丝氨酸/精氨酸蛋白特异激酶2（serine/arginine-rich protein specific kinase 2，SRPK2） 基因mRNA及其编码蛋白产物在小鼠睾丸组织中的表达特征，探讨该基因在精子发生过程中的作用及意义。 方法 分别采用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹杂交（Western blotting）分析该基因mRNA及蛋白产物在小鼠多种组织中的表达；利用实时定量PCR（real-time quantitative PCR）分析SRPK2 mRNA在不同发育阶段小鼠睾丸组织中的差异表达；应用免疫组织化学染色和间接免疫荧光技术观察SRPK2蛋白在小鼠曲精小管中的细胞定位和生精细胞内的亚细胞定位。 结果 半定量RT-PCR和Western blotting分析显示SRPK2 mRNA和蛋白在小鼠睾丸组织中均大量表达；实时定量PCR分析发现SRPK2 mRNA在5周及8周龄雄性小鼠睾丸组织中显著表达，具有明显的阶段特异性表达特征。免疫组织化学染色结果表明SRPK2蛋白阳性着色主要位于曲精小管中的长形精子细胞核；间接免疫荧光分析显示SRPK2蛋白定位于长形精子细胞核表面。 结论 SRPK2基因在小鼠睾丸组织中大量表达，并且具有显著的阶段特异性表达特征和明确的细胞核定位，极有可能在小鼠精子发生的变态成形期参与mRNA前体分子的剪接过程，其作用机制值得进一步深入研究。     

一条全长胰腺癌相关新基因的初步研究

目的 对应用cDNA芯片技术筛选出的一条全长胰腺癌相关新基因进行鉴定.方法 对应用cDNA芯片技术筛选出的一条全长胰腺癌相关新基因进行测序和生物信息学分析,应用RT-PCR和Northern blot检测该基因在12例胰腺癌和癌旁正常胰腺组织以及4种胰腺癌细胞株中的表达情况.结果 生物信息学分析显示新基因定为于染色体4p15,有一包含501 bp的ORF,拟编码由166个氨基酸组成的蛋白质,其理论分子量为18 293.23,等电点为8.57.BLASTp分析发现,该蛋白与一种人类假想蛋白FLJ90013同源性大于90%,可能为该假想蛋白家族新成员.RT-PCR显示新基因在12例胰腺癌组织和4种胰腺癌细胞株中均表达,而在正常胰腺组织中未见表达.Northern blot分析得到相同的结果.结论 新基因与胰腺癌的发生、发展密切相关,可作为胰腺癌诊断和基因治疗的分子靶标.     

一种新的睾丸特异核孔蛋白基因特性的研究

目的通过筛选人睾丸特异基因及对其结构和功能的研究,为阐明精子发生与成熟提供新的线索。方法采用筛选人睾丸表达文库、快速扩增ｃＤＮＡ５′末端、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析、荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）以及基因重组等技术。结果（１）获得一新的长度为２２０９ｂｐ的ｃＤＮＡ,编码７００个氨基酸,将该基因命名为ＢＳ－６３。Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ注册号为Ｕ６４６７５。（２）ＢＳ－６３Ｎ端具有核孔蛋白的特征性结构元件“ＸＦＸＦＧ”或“ＦＧ”以及与Ｒａｓ相关核蛋白（Ｒａｎ）结合的典型特征。（３）Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析显示,ＢＳ－６３基因有６．０和８．５ｋｂ两种转录形式,其中６．０ｋｂ为睾丸组织特异性转录本。（４）ＦＩＳＨ显示,ＢＳ－６３基因定位于２ｑ１１．２～１２。（５）ＢＳ－６３ｃＤＮＡ在大肠杆菌中获得高效表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示,表达蛋白的相对分子质量约为８００００。（６）体外功能实验表明,该表达蛋白可被蛋白激酶Ｃ及细胞周期依赖性蛋白激酶Ⅱ磷酸化。结论ＢＳ－６３可能是一种新的睾丸特异核孔蛋白。     

人受精促进肽受体(TCPllc)基因的克隆、表达及选择性剪接

目的 分离、克隆人受精促进肽受体TCPll基因1个新的转录本TCPllc的全长cDNA,研究其表达的阶段性、组织特异性及TCPll基因3种转录本的剪接方式。方法 运用BLAST方法获得与TCPlla同源的ESTs,以逆转录的人睾丸cDNA为模板进行PCR扩增,将PCR扩增片段克隆入pGEM-T easy载体并测序;采用BLAST、ClustalW及RT-PCR方法分析各转录本的基因组结构及剪接方式;RT-PCR方法分析其组织表达的特异性和阶段性。结果 获得1个新的全长cDNA,它编码440个氨基酸的蛋白质,与TCPlla、b相比,在基因组的5′-端存在复杂的外显子剪接现象。RT-PCR结果显示该转录本在正常睾丸中表达,而其他组织、无精症患者及胎儿睾丸组织中未见该基因表达。结论 从人睾丸组织中分离到人受精促进肽受体TCPll基因1个新的转录本TCPllc, 结合mTcp-11的功能提示,TCPll基因a、b、c这3种转录本对精子发生和人受精过程可能起重要作用。     

人受精促进肽受体(TCP11c)基因的克隆、表达及选择性剪接

目的 分离、克隆人受精促进肽受体TCP11基因1个新的转录本TCP11c的全长cDNA,研究其表达的阶段性、组织特异性及TCP11c基因3种转录本的剪接方式。方法 运用BLAST方法获得与TCP11a同源的ESTs,以逆转录的人睾丸cDNA为模板进行PCR扩增,将PCR扩增片段克隆入p哪M—TeMy载体并516序;采用BLAST、ClustalW及RT—PCR方法分析各转录本的基因组结构及剪接方式;RT—PCR方法分析其组织表达的特异性和阶段性。结果 获得1个新的全长cDNA,它编码440个氨基酸的蛋白质,与TCP11a、b相比,在基因组的5′—端存在复杂的外显子剪接现象。RT—PCR结果显示该转录本在正常睾丸中表达,而其他组织、无精症患者及胎儿睾丸组织中未见该基因表达。结论 从人睾丸组织中分离到人受精促进肤受体TCP11基因1个新的转录本TCP1c,结合mTcp-11的功能提示,TCP11基因a、b、c这3种转录本对精于发生和人受精过程可能起重要作用。     

RSD-7的克隆及其在睾丸组织中的定位

目的 分离、克隆精子发生相关基因,深入了解精子发生的分子机制。方法 采用本组克隆的大鼠睾丸EST筛选cDNA文库、Northern blot、原核表达和纯化、抗体制备和免疫组化等技术。结果 (1)获得1个新的全长cDNA序列,命名为RSD-7。全长l238bp,编码232个氨基酸,GenBank接收号为AF315467。序列分析显示,RSD-7基因编码蛋白质含有1个Ubiquitin-like结构域。(2)Northern blot结果显示,在8种成鼠组织中,RSD-7基因仅在睾丸组织中有明显表达。不同发育天龄的大鼠睾丸组织Northern blot结果显示,出生后30d的大鼠RSD-7基因开始表达,一直到120d仍有表达。(3)RSD-7 cDNA在大肠杆菌中获得高效表达,并纯化了GST-RSD-7融合蛋白,以此为抗原制备了高效价的抗RSD-7蛋白的多克隆抗体。(4)通过免疫组织化学方法,RSD-7蛋白定位于Sertoli细胞胞浆和质膜上。结论 初步分析了RSD-7基因的表达特征并制备了抗RSD-7多克隆抗体,为进一步研究RSD-7蛋白在精子发生过程中的功能提供了条件。     

Cloning and expression in Escherichia coli of a new gene of Schistosoma japonicum encoding casein kinase Ⅱ beta subunit

Background Nowadays it is now a focus topic in schistosomiasis research to find ideal vaccinecandidates and new drug targets for developing anti-schistosomiasis vaccine. We cloned a new gene, casein kinase Ⅱ beta subunit, of Schistosoma japonicum (S. japonicum) and express it in Escherichia coli (E. coli). Methods The ESTs obtained in our laboratory were analyzed by homologous searching, and a new gene was recognized. The full-length cDNA of the new gene was obtained by joining the 3‘ RACE PCR fragment and the EST clone. To express the new gene, the cDNA was cloned into pGEX-4T-1 vector and then transformed into E. coli JM109. The recombinant protein was analyzed by SDS-PAGE and Western-blot. Results A 908 bp cDNA was isolated from S. japonicum and identified to be casein kinase Ⅱ beta subunit gene by sequence analysis. The open reading frame of the gene encodes a protein of 217 amino acids exhibiting 75.8%, 75.8%, 73.9%, 68.2%, 51.6% identity to the amino acids sequence of the corresponding genes of Homo sapiens (H. sapiens), Xenopus laevi (X. laevi) , Drosophila melanogaster (D.melanogaster), Caenorhabditis elegan (C. elegan), and Schizosaccharomyces pombe (S. promber) respectively. The predicted molecular weight of the protein was 24. 921 kDa. The new cDNA sequence had been submitted to GenBank, and its accession number is AY241391. This cDNA was subcloned into the pGEX-4T-1 vector and expressed in E coil JM109. The recombinant protein could be recognized by the S. japonicum infected rabbit serum. Conclusion The full-length cDNA sequences encoding S. japonicum casein kinase Ⅱ beta subunitwere firstly sequenced, cloned, and expressed in E coil.     

高甘油三酯血症大鼠高血凝相关基因的筛选

目的：筛选实验性高甘油三酯血症诱发大鼠高血凝的相关基因。方法：采用抑制性消减杂交技术构建大鼠高血凝cDNA消减文库，并用半定量RT-PCR初步鉴定差异表达基因。结果：成功构建了大鼠高血凝cDNA消减文库，20个阳性克隆的序列测定和同源比较表明这些克隆代表了19个基因，其中8个为已知基因但首次发现与高血凝相关，11个为新的ESTs，已被GenBank收录。半定量RT-PCR证明3个ESTs(HC002、HC057和HC067)为表达上调基因。结论：所构建的消减文库消减效率高，为进一步筛选、克隆大鼠高血凝相关的新基因奠定了基础，HC002、HC057和HC067可能与高甘油三酯血症诱发的高血凝相关。     

A novel full-length gene of human ribosomal protein L14.22 related to human glioma

Background This study was undertaken to obtain differentially expressed genes related to human glioma by cDNA microarray and the characterization of a novel full-length gene. Methods Total RNA was extracted from human glioma and normal brain tissues, and mRNA was used as a probe. The results of hybridization procedure were scanned with the computer system. The gene named 507E08 clone was subsequently analyzed by northern blot, bioinformatic approach, and protein expression. Results Fifteen differentially expressed genes were obtained from human glioma by hybridization and scanning for four times. Northern blot analysis confirmed that the 507E08 clone was low expressed in human brain tissue and over expressed in human glioma tissues. The analysis of BLASTn and BLASTx showed that the 507E08 clone was a novel full-length gene, which codes 203 amino acid of protein and is called human ribosomal protein 14.22 gene. The nucleotide sequence had been submitted to the GenBank?with the accession number of AF329277. After expression in E.coli., protein yielded a major band of apparent molecular mass 22 kDa on an SDS-PAGE gel. Conclusions cDNA microarray technology can be successfully used to identify differentially expressed genes. The novel full-length gene of human ribosomal protein 14.22 may be correlated with the development of human glioma.     

日本血吸虫核苷二磷酸激酶基因的获得和序列分析

目的 从日本血吸虫(Schistosorna japonicum,Sj)成虫cDNA文库中筛选日本血吸虫新基因，为日本血吸虫病的防治提供药物靶标或候选疫苗。方法 筛选日本血吸虫成虫cDNA文库，随机挑取重组阳性克隆进行DNA测序，再对新基因序列进行步移法测序获取全长cDNA，并利用生物信息学技术对其进行分析。结果 获得了1个编码日本血吸虫核苷二磷酸激酶新基因的cDNA序列(AY226980)，全长594bp，编码157个氨基酸，编码蛋白与人类或鸽、鸡、鼠及果蝇的核苷二磷酸激酶高度同源。结论 利用表达序列标签法、步移法测序和生物信息学技术三者相结合，成功获得了编码日本血吸虫核苷二磷酸激酶基因的cDNA序列。     

家族性急性髓系白血病相关新基因FAMLF cDNA全长的克隆及其生物功能分析

目的 克隆家族性急性髓系白血病(AML)相关新基因cDNA全长,在分子水平上探讨急性白血病发生发展的机制.方法 以构建的家族性AML抑制性消减文库中1个有差异表达的新基因EST序列zywb87(GenBank注册号CV973101)为基础,应用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆其全长cDNA,应用生物信息学对其功能进行初步分析,应用一步法半定量RT-PCR检测其在AML患者及正常人中的表达.结果 获得了家族性AML相关新基因FAMLF的cDNA全长,该基因定位于染色体lq31.3,cDNA全长2313 bp,开放读码框(ORF)为249 bp,编码82个氨基酸的蛋白质,含有信号肽,富含亮氨酸重复单位(LRR_SD22),内在固有无序结构域等功能区.Blast检索为功能未知的新基因,已被GenBank收录,并命名为FAMLF,核酸注册号为EF413001,蛋白质注册号为ABN58747.新基因FAMLF在AML患者中的表达明显高于正常人,差异有统计学意义(2.61±0.66 vs 0.97±0.51,P<0.01).结论 成功获得一个家族性AML相关新基因FAMLF cDNA全长,FAMLF基因在AML中高表达,可能是具有一定生物功能的新基因.     

Molecular cloning and characterization of NAG-7: a novel gene downregulated i n human nasopharyngeal carcinoma

目的　分离位于染色体 3p2 4 2 6区域中鼻咽癌新的抑瘤基因。方法　在染色体 3p2 4 2 6鼻咽癌杂合性丢失 (lossofheterogosity ,LOH)高频区 ,用RT PCR及Northern杂交检测了2 0个表达序列标记 (expressedsequencetag ,EST)在鼻咽癌细胞株HNE 1和原代培养的正常鼻咽上皮细胞中的表达水平 ,并对其中一个在鼻咽癌细胞株HNE 1中表达下调的EST在 19例鼻咽癌活检组织中的表达进行了检测。用cDNA文库筛选方法获得其全长cDNA序列 ,对该序列进行了初步分析。结果　获得一个位于染色体 3p2 5 3的新基因 ,命名为NAG 7基因。该基因在 2 6 3% (5 19)的鼻咽癌活检组织中表达下调。它全长 16 6 7bp ,其开放阅读框 (openreadingframe ,ORF)编码一个含 94个氨基酸的碱性蛋白质 ,分子量为 110 2 3 87道尔顿 ,预测为一跨膜蛋白质。它含有一蛋白激酶C磷酸化位点和肉豆蔻基位点。迄今为止 ,NAG 7基因序列在基因库中未见任何同源性基因。结论　NAG 7基因是一个在鼻咽癌中表达下调的新基因 ,它的改变可能参与了鼻咽癌的发生发展     

高凝状态大鼠主动脉表达上调新基因HCR2的克隆及生物信息学分析

目的 获得高凝状态大鼠主动脉上调表达新基因HCR2的全长cDNA,并对该基因进行生物信息学分析。方法 从高凝大鼠主动脉中表达显著上调的序列标签（EST,GenBank登录号为BQ901227）出发,利用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA end,RACE）和巢式PCR技术扩增其全长cDNA,利用NCBI的数据库对其进行生物信息学分析。结果 成功地获得了HCR2的全长cDNA,在GenBank中的登录号为AY234417。用RT-PCR证实HCR2是高凝大鼠表达上调基因。生物信息学分析显示,该基因cDNA序列全长为1275bp,定位于大鼠染色体4q11,编码由78个氨基酸组成、相对分子质量为8841．7、pI为8．59的蛋白质;无信号肽序列和跨膜序列,很可能是一种核蛋白;与已知蛋白无明显同源性。结论 HCR2的成功克隆为进一步研究其生物学功能及其在高血凝的发生、发展中的作用奠定了坚实基础。