帕金森病大鼠模型激发自体脑内神经干细胞增殖的实验研究

目的　研究帕金森病 (Parkinson’sdisease ,PD)大鼠激发自体脑内神经干细胞的增殖情况。方法　选用SD大鼠 ,将 6 羟多巴胺 (6 OHDA)注入纹状体内制作PD大鼠模型 ,假手术对照组注入等量生理盐水 ,于不同时间点处死大鼠。处死前均注射 5 溴脱氧尿苷 (Brdu)。免疫组织化学方法动态检测Brdu和巢蛋白 (Nestin)的表达 ,以确定脑内增殖细胞和神经前体细胞数量 ,Brdu/Nestin免疫双标确定脑内神经干细胞的增殖情况。结果　同正常组、假手术对照组比较 ,PD大鼠损伤侧海马区、侧脑室室管膜下区和黑质区的Brdu 细胞、Nestin 细胞和Brdu /Nestin 细胞数在模型成功后的第 3、5、7天明显增加 ,14d后逐渐减少 ,2 8d后恢复到正常水平。结论　 6 OHDA纹状体内注射制作PD的模型大鼠能够激活自体神经干细胞增殖。     

帕金森模型大鼠海马区Pitx3和Nurr1基因表达情况的实验研究

目的制作帕金森（PD）大鼠模型，研究其海马区Pitx3和Nurr1基因表达情况。方法纹状体内注射6-羟多巴胺制作大鼠帕金森模型，于不同时间点处死，免疫荧光方法检测Pitx3、Nurr1基因在帕金森大鼠海马区的表达。结果同正常组、假手术对照组相比较，PD大鼠海马区的Pitx3＋细胞，Nurr1^＋细胞和Pitx^＋／Nurr1^＋细胞数在模型成功后的第3、7天明显增加，第14天后逐渐减少，第28天后恢复正常水平。结论Pitx3、Nurr1基因在帕金森模型大鼠的海马区大量表达，可能与帕金森大鼠新生的神经干细胞的增殖有关。     

MK-801内源性激活脑缺血后成年大鼠海马神经干细胞

目的:研究兴奋性氨基酸(NMDA)受体拮抗剂MK801对脑缺血后海马区神经干细胞(NSCs)激活的作用。方法:将40只SD大鼠分成对照组和实验组,两组大鼠均采用传统线栓法作成大脑中动脉缺血再灌注模型,实验组大鼠腹腔注射MK801,对照组腹腔注射生理盐水,通过免疫组织化学技术标记鼠脑海马齿状回颗粒细胞层(SGZ)、室管膜下层(SVZ)注射后第3,7,11,18d的Brdu、Nestin阳性细胞数。结果:对照组大鼠Brdu、Nestin阳性细胞7d在SGZ出现一小高峰,然后迅速下降,11d阳性细胞甚少;而实验组Brdu、Nestin阳性细胞3d在SVZ明显表达,7～11d在SGZ区达高峰,并可持续至18d,两组比较,有统计学意义(P<0.01)。结论:NMDA受体拮抗剂MK801在脑缺血后,能促进大鼠海马区NSCs的增殖、分化。     

神经干细胞移植对帕金森大鼠的疗效观察

目的观察神经干细胞移植对帕金森大鼠脑内多巴胺含量的影响。方法采用6-羟基多巴胺定点注射毁损黑质纹状体的方法构建帕金森大鼠模型;向造模成功的大鼠纹状体内分别移植1×106（共计20μl）的第3代胚鼠神经干细胞或等量生理盐水。结果与结论神经干细胞移植后3周,免疫组化检测发现帕金森大鼠脑黑质部位酪氨酸羟化酶阳性细胞数明显增多,纹状体内可见酪氨酸羟化酶阳性细胞。干细胞移植后8周,高效液相色谱检测显示大鼠纹状体内多巴胺含量明显增高（P〈0.01）。说明神经干细胞脑内移植能够减轻由6-羟基多巴胺引起的大鼠中脑黑质多巴胺能神经元的损伤,改善大鼠的帕金森症状。     

酪氨酸羟化酶基因修饰的神经干细胞脑内移植PD模型动物旋转行为及神经生化研究

目的 探讨TH基因修饰的神经干细胞脑内移植对PD模型动物旋转行为和神经生化的影响。方法 构建pN2ATH逆转录病毒载体质粒，用PA317细胞包装，G418筛选阳性克隆，病毒上清感染神经干细胞，将神经干细胞和表达TH的神经干细胞植入PD大鼠纹状体内，测定移植后不同时间PD大鼠旋转行为改善以及DA和DOPAC含量变化。结果 TH基因修饰的神经干细胞移植8周后能显著降低PD大鼠旋转行为，增加纹状体DA和DOPAC含量，疗效好于单纯神经干细胞移植组和对照组。结论 TH基因修饰的神经干细胞脑内移植能增加纹状体DA和DOPAC含量，降低PD大鼠旋转行为，从而对PD大鼠有明显的治疗作用，也为PD的治疗开辟了新途径。     

成年大鼠海马神经干细胞移植治疗脑出血的研究

目的:探讨成年大鼠海马神经干细胞(NSCs)对脑出血的移植治疗作用.方法:从成年SD大鼠的海马中分离、培养、鉴定NSCs,制作大鼠脑出血模型,将BrdU标记的NSCs注入到血肿同侧的尾状核内.不同时间处死大鼠,通过免疫组织化学分析NSCs在体内的分化情况.结果:经Nestin染色证实能从成年大鼠的海马中分离出NSCs,通过免疫组织化学证实移植的NSCs能在出血区分化为神经原和神经胶质细胞.结论:移植的NSCs在大鼠脑内血肿周围能够成活.     

不同脑区来源的成体大鼠神经干细胞体外增殖特性

目的：探讨成年大鼠神经干细胞的脑内分布及体外培养条件，增殖特性，为自体神经干细胞移植修复神经损伤提供理论依据。方法：分离成年大鼠纹状体，室区（VZ）和室下区（SVZ）的细胞，利用无血清培养技术培养并观察神经干细胞的生长规律，采用SABC法进行神经上皮干细胞蛋白（Nestin)，增殖细胞核抗原（PCNA）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）及胶质纤维酸蛋白（GFAP）检测，并作姬母萨染色，对细胞进行鉴定，结果：由成年大鼠纹状体，VZ和SVZ区获得的细胞群，均可在体外分裂增殖形成神经球，Nestin阳性，进一步分化后分别呈现NSE和GFAP阳性。结论：成年大鼠脑内特定区域具有存在神经干细胞。     

氦氖激光穴位照射对缺血缺氧后新生大鼠海马神经元增殖的影响

目的：探讨氦氖激光穴位照射疗法对缺血缺氧新生大鼠脑损伤后海马神经元增殖的影响。方法：7d龄健康Wistar大鼠72只随机分成4组：假手术组、缺血缺氧组、缺血缺氧激光穴位照射组、缺血缺氧激光非穴位照射组。制备新生大鼠缺血缺氧脑损伤模型,激光穴位照射组选择“百会”和“大椎”穴位给予氦氖激光照射．激光非穴位照射组选择腹部非穴位部位进行激光照射,常规饲养22d后处死,处死前经腹腔注射5-溴-2-脱氧脲嘧啶(BrdU)标记增殖细胞。取左侧脑做组织切片,HE、Nissl染色以及采用抗BrdU抗体和神经上皮蛋白(Nestin)抗体进行免疫组织化学染色。结果：激光穴位照射组与其他组比较海马神经元胞体内尼氏体丢失较少,神经元坏死减轻,海马齿状回BrdU标记的免疫阳性细胞数增加,海马CA1区Nestin免疫阳性细胞数增高。结论：激光穴位照射对海马神经元有保护作用,促进了海马神经元的增殖。     

大鼠骨髓间充质干细胞植入大鼠脑内后的迁移

目的：研究大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）植入脑内后的存活和迁移性。方法：分离大鼠MSCs体外培养、纯化。Hoechst33342标记后立体定向植入大鼠海马CA4区,1、2、4周后处死大鼠取脑,制作冷冻切片;用荧光显微镜观察Hoechst33342阳性细胞。结果：原代、传代细胞贴壁生长,有较强的增殖能力;植入大鼠海马后沿针道及注射区可见多数存活细胞,散在分布,自植入区及针道向周围逐渐减少。结论：大鼠MSCs植入大鼠脑内后能够存活并具有向周围组织迁移的能力。     

Nestin在EAE大鼠脑中的表达及意义

目的研究神经干细胞标记蛋白——神经巢蛋白（Nestin）在实验性变态反应性脑脊髓炎（Experimental allergic encephalomyelitis，EAE）大鼠脑中的表达及意义。方法以豚鼠脑脊髓匀浆加完全福氏佐剂作为抗原，给予Wistar大鼠四足皮内注射，建立EAE模型。应用免疫组织化学技术检测EAE大鼠脑中Nestin的表达，与对照组比较，并做成组f检验分析其表达是否具有统计学意义。结果Nestin在EAE大鼠脑室管膜下区和皮质中表达增多，与正常对照组比较有显著性差异（P〈0.01）。结论Nestin表达显著性增强，表明神经干细胞在EAE大鼠脑中有增殖，增殖的神经干细胞可以为神经系统的结构和功能修复提供一定的物质基础。     

大鼠脊髓背根神经节内神经前体细胞的观察

目的:探讨大鼠脊髓背根神经节(DRG)内是否存在神经前体细胞.方法:取成年和胚胎大鼠DRG冰冻切片,进行Brdu,Nestin,P75免疫荧光组织化学检测,分别取成年和胚胎大鼠DRG进行原代细胞培养,观察其增殖与分化情况,并行Nestin免疫组织化学和Brdu,P75,NF,GFAP免疫荧光组织化学鉴定.结果:在成年和胚胎大鼠DRG冰冻切片上均见有Brdu/Nestin和Nestin/P75免疫荧光双标细胞.细胞培养观察到取自DRG的细胞有分裂增殖,呈Nestin免疫组织化学阳性反应和Brdu,P75免疫荧光组织化学阳性反应;培养第三代细胞加入胎牛血清后出现分化,分化细胞呈NF和GFAP免疫荧光组织化学阳性反应.结论:大鼠DRG内存在有分裂增殖的神经前体细胞,这些细胞可以分化为神经元和神经胶质细胞.     

Effects of Electroacupuncture at the Conception Vessel on Proliferation and Differentiation of Nerve Stem Cells in the Inferior Zone of the Lateral Ventricle in Cerebral Ischemia Rats

Objective: To observe the effects of electroacupuncture (EA) at the Conception Vessel on proliferation and differentiation of the nerve stem cells in the inferior zone of the lateral ventricle in cerebral ischemia rats. Methods: The model rats were prepared by occlusion of the middle cerebral artery for 2 hours and then by reperfusion. They were randomly divided into two groups: a control group and an EA group. Changes in differentiation and proliferation of the nerve stem cells were observed 7, 14 and 28 days after successful modeling. Results: As compared with the 7-day control group (C-7d group), there was no significant difference (P>0.05) in the numbers of 5-bromodeoxyuridine (Brdu) positive cells, Brdu/GFAP, Brdu/Nestin and Brdu/Nse double-labeled cells in the inferior zone of the lateral ventricle in the EA group 7 days after modeling. However, in the 14-day EA group (R-14d group) and the 28-day EA group (R-28d group), the numbers of Brdu positive cells and Brdu/GFAP, Brdu/Nestin, Brdu/Nse double-labeled cells significantly increased as compared respectively with the 14-day control (C-14d group) and the 28-day control (C-28d) group (P<0.05 or P<0.01). Conclusions: EA at the Conception Vessel promotes differentiation and proliferation of the nerve stem cells in the inferior zone of the lateral ventricle in the cerebral ischemia rats, and may stimulate differentiation of the proliferous nerve stem cells towards the astrocytes.     

胚胎大鼠腹侧中脑区域神经干细胞的培养及鉴定

目的:探讨胚胎大鼠腹侧中脑区域神经干细胞(neural stem cell,NSCs)的分离、培养、传代及鉴定的方法。方法:分离E14.5胚胎大鼠腹侧中脑组织,用机械吹打方法形成细胞悬液,接种到含有表皮生长因子(ep i-derm al growth factor,EGF)、碱性成纤维生长因子(fibrob last growth factor-basic,bFGF)、B27(B27 sup lem ent)的DMEM/F12(1∶1)的无血清培养液中培养,待形成原代克隆球后,用有限稀释法进行单细胞克隆和传代扩增,以获得大量来源相同的NSCs克隆球,并且进行B rdu和Nestin检测;然后取培养细胞诱导分化后行GFAP,NeuN,TH检测。结果:E14.5胚胎大鼠腹侧中脑组织细胞培养两周后可以形成较多的悬浮生长的神经球,经单细胞克隆和传代扩增后得到大量的同源细胞克隆球。经过B rdu和Nestin的免疫细胞化学检测90%以上的细胞呈阳性;诱导分化后细胞呈GFAP,NeuN阳性,少量细胞呈TH阳性。结论:从E14.5胚胎大鼠腹侧中脑组织分离得到的细胞具有不断增殖和自我更新的能力,是胚胎大鼠中枢神经系统的NSCs,并可以分化为TH阳性神经元。     

神经干细胞的分离培养及其鉴定

目的：从成年大鼠纹状体区和胎鼠皮层分离并鉴定神经干细胞。方法：利用无血甭培养和单细胞克隆技术在成年大鼠纹状体区和胎鼠皮层分离具有单细胞克隆能力的细胞群,选取单个克隆进行连续传代培养获得大量亚克隆,采用免疫荧光细胞化学技术检测克隆细胞Ｎｅｓｔｉｎ抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达。结果：从纹状体区和皮层分离的细胞群具有连续克隆能力,胚胎早期细胞抗原－Ｎｅｓｔｉｎ抗原阳性,分化后的细胞表达神经元     

大鼠背根神经节源干细胞分离培养和鉴定

目的：探讨大鼠背根节（DRG）内是否存在神经干细胞。方法：取胚胎大鼠DRG进行原代细胞培养,观察其增殖与分化情况,并行P75BrdU/Nestin,GFAP,NF200免疫荧光组织化学鉴定。结果：细胞培养获得大量能够分裂增殖且呈巢状悬浮生长的干细胞团,呈P75BrdU/Nestin免疫荧光组织化学阳性反应;培养第三代细胞加入胎牛血清10d后,相差显微镜下可见部分细胞伸出多个细长突起,且免疫组化呈NF200阳性;部分细胞具有扁平多突起的或双极细胞形态,免疫组化呈GFAP染色阳性。细胞球经NGF培养诱导1d左右有些神经元样的细胞开始迁出,随着时间增长迁出的细胞越来越多,并且细胞和细胞之间发生联系,形成交错的复杂网络,迁出的细胞经免疫组化鉴定几乎都是呈NF200免疫染色阳性。结论：大鼠DRG内存在有神经干细胞,这些细胞可以分化为神经元和神经胶质细胞。     

胚胎大鼠中枢神经系统神经干细胞的分离培养与观察

目的建立神经干细胞分离、培养、分化鉴定技术,观察神经干细胞增殖、分化特点.方法利用无血清培养和细胞克隆培养技术,从胚胎大鼠海马、纹状体、脊髓等区分离神经干细胞,进行体外扩增培养、传代、贴壁分化观察.采用免疫细胞化学、透射电镜检测技术,观察鉴定神经干细胞和分化的神经细胞.结果从胚胎大鼠海马、纹状体、脊髓等区分离的细胞具有增殖能力,可进行传代培养,获得的细胞克隆中有nestin表达阳性细胞,透射电镜观察见典型的干细胞特征和不对称分裂现象.贴壁分化后可以出现MAP2、NSE、GFAP和GC表达阳性的细胞.结论用上述方法分离培养的神经干细胞具有自我更新和增殖能力,并具有向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化的潜能.     

局灶性脑缺血再灌注大鼠Nestin的表达

目的了解局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织中Nestin的表达特点。方法采用改良的线栓法制备大脑中动脉阻塞(MCAO)2h后不同再灌注时间段(6h、12h、24h、72h、7d、14d)的大鼠局灶性脑缺血模型,应用免疫组织化学技术检测Nestin的表达。结果脑缺血再灌注后6h,Nestin 表达即有增加,至3d时Nestin 表达显著增强,Brdu /Nestin 细胞也已明显可见,至7d时Nestin 表达、Brdu /Nestin 细胞数目均达顶峰,至再灌注14dNestin 表达及Brdu /Nestin 细胞数目均已明显回落。结论脑缺血可引发大鼠Nestin的表达上调,并可诱导神经干细胞增殖。