反义人端粒酶RNA组分基因对胃癌细胞端粒酶活性的影响

目的 克隆人胃癌细胞端粒酶RNA组分（hTR）基因片段并构建其正交和反义真核表达载体，研究反义端粒酶RNA对人胃癌细胞株MKN－45端粒酶活性的影响。方法 采用RT－PCR方法从人胃癌细胞株MKN－45中扩增出人hTR部分cDNA序列，将该片段分别正向的反向插入PEF6V5－His-TOPO载体后构建人端粒酶RNA组分（hTR）基因正，反义真核表达载体，随后采用脂质体转染法将该正，反义载体转染入人胃癌细胞株MKN－45，用TRAP法观察后端粒酶活性的改变。结果 所克隆的基因片段其碱基序列与献报导完全一致，且插入载体的方向完全正确。与正常对照，转染正义载体，空载体比较，转染反义载体端粒酶活性显下降。结论 本实验已成功克隆和人端粒酶RNA组分（hTR）基因的部分序列并成功构建hTR正反义真核表达载体，而且反义端粒酶RNA能有效降低人胃癌细胞株MKN－45端粒酶活性。     

反义人端粒酶RNA组分基因对胃癌细胞端粒酶活性的影响

目的 克隆人胃癌细胞端粒酶RNA组分（hTR）基因片段并构建其正义和反义真核表达载体,研究反义端粒酶RNA对人胃癌细胞株MKN-45端粒酶活性的影响。方法 采用RT-PCH方法从人胃癌细胞株MKN-45中扩增出人hTR部分cDNA序列,将该片段分别正向和反向插入PEF6/V5-His-TOPO载体后构建人端粒酶RNA组分（hTR）基因正、反义真核表达载体,随后采用脂质体转染法将该正、反义载体转染入人胃癌细胞株MKN-45,用TRAP法观察后者端粒酶活性的改变。结果 所克隆的基因片段其碱基序列与文献报导完全一致,且插入载体的方向完全正确。与正常对照、转染正义载体、空载体者比较,转染反义载体者端粒酶活性显著下降。结论 本实验已成功克隆了人端粒酶RNA组分（hTR）基因的部分序列并成功构建hTR正反义真核表达载体,而且反义端粒酶RNA能有效降低人胃癌细胞株MKN-45端粒酶活性。     

反义人类端粒酶 RNA逆转录病毒载体构建及其对结直肠癌细胞的抑制作用

目的 研究反义人类端粒酶RNA逆转录病毒载体对结直肠癌HT29细胞端粒酶活性及细胞生长的抑制作用。探讨以端粒酶为酸点的结直肠癌基因治疗的可能性。方法 将端粒酶hTR的cDNA反向插入逆转录病毒载体pLXRN中，转染包装细胞PT67后获得反义重组病毒，感染结直肠癌HT29细胞，采用RT-PCR检测hTR表达。端粒酶重复扩增法（telomerase repeat amplification protocol,TRAP)检测端粒酶活性，绘制生长曲线了解细胞生长状态，倒置显微镜观察和DNA片段电泳检测细胞凋亡。结果 反义hTR作用后的结直肠癌细胞hTR表达下降，端粒酶活性和细胞生长受到明显抑制，细胞出现凋亡。结论 反义hTR对结直肠癌HT29细胞的生长和端粒酶活性具有明显的抑制人舰艇可能以hTR为靶点对结直肠癌进行基因治疗。     

端粒酶反义寡核苷酸对乳腺癌端粒酶活性及细胞生长的影响

目的　探讨端粒酶反义寡核苷酸对人乳腺癌细胞端粒酶活性的影响及抑制端粒酶活性以控制乳腺癌细胞生长的可能性。方法　采用 10 μmol/L与端粒酶催化亚基 (hTRT )mRNA互补的反义寡核苷酸处理乳腺癌细胞 ;于处理后 2 4、72h用端粒重复序列扩增及酶联免疫吸附方法检测细胞端粒酶活性 ;于处理后 72h以流式细胞术测定细胞周期 ;于处理后 12 0h采用原位末端标记法检测细胞凋亡。结果　经hTRT反义寡核苷酸作用后 ,细胞端粒酶活性明显受到抑制 ,至作用后 72h ,端粒酶活性较对照组降低 65 .6% (P <0 .0 5 ) ;细胞生长明显受到抑制 ;细胞周期发生显著变化 :G0 /G1期细胞数增多 ,S期及G2 /M期细胞数则减少 ;细胞增殖指数由 0 .46降低至 0 .2 5 ;并可观察到凋亡细胞的出现 ,凋亡发生率为 12 .5 % ;而无义组及空白对照组以上各指标均无明显变化 (P >0 .0 5 )。结论　端粒酶反义寡核苷酸可明显抑制乳腺癌细胞端粒酶活性 ,抑制细胞生长和增殖 ,诱导细胞凋亡 ;表明应用反义技术抑制端粒酶活性治疗乳腺癌具有广阔的前景。     

hTR反义寡核苷酸对人胰腺癌细胞Panc-1生物特性及端粒酶活性的影响

端粒酶持续激活导致恶性肿瘤细胞获得无限增殖能力 ,人端粒酶RNA组分(hTR )对端粒酶活性维持具有重要作用 ,破坏端粒酶RNA组分的模板功能 ,即可抑制端粒酶活性[1] 。我们针对hTR模板区设计合成反义寡核苷酸 (A SODN) ,观察其对Panc 1端粒酶活性及细胞生长的影响 ,为胰腺癌基因治疗提供新的实验依据。一、材料与方法1.核苷酸设计与合成 :根据hTR模板区序列设计一条互补于起始密码区的反义片段 ,并随机设计合成一段正义寡核苷酸 (SODN)序列作为对照 ,均由上海生工公司进行合成。2 .细胞培养与转染 :Panc 1细胞株购自中国协和医科大…     

端粒酶反义RNA影响人肝癌细胞系HepG2生长的初步报告

目的探讨抗端粒酶在肝细胞癌治疗中的意义。方法将反义hTR真核表达载体经脂质体介导转染人肝癌细胞系HepG2,体外培养及接种裸鼠观察其基因转染细胞的细胞周期、超微结构变化及致瘤性。结果形态学观察,转染后HepG2细胞出现典型的凋亡现象。FCM检测发现G1期前出现凋亡峰,凋亡率为4·2%。在裸鼠皮下的致瘤性明显降低。HepG2/pBBS212细胞的瘤体抑制率为2·4%,与HepG2/pBBS212-hTR细胞的25·6%相比,差异有显著性(P<0·05)。结论转染端粒酶反义RNA能抑制肝癌HepG2细胞的恶性表型,促进其凋亡。     

RNA干扰对肾癌细胞端粒酶基因表达和活性的抑制作用及其增殖、凋亡的影响

目的探讨小干扰RNA(siRNA)对人肾癌细胞端粒酶基因表达、活性的抑制作用及对肾癌细胞增殖、凋亡的影响。方法将针对人端粒酶RNA(hTR)模板区的siRNA(100nmol/L)转染肾癌7860细胞,采用RTPCR检测7860细胞端粒酶mRNA表达,端粒重复序列扩增酶联免疫吸附法检测端粒酶活性,MTT法检测细胞增殖,免疫细胞化学TUNEL法检测细胞凋亡。结果hTRsiRNA处理组7860细胞端粒酶mRNA表达(40.7±1.5)%降低,端粒酶活性(32.7±2.3)%降低,细胞增殖抑制率(63.6±1.6)%增加,凋亡细胞阳性率(39.4±0.6)%增加。分别与阴性siRNA对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论siRNA能抑制人肾癌细胞端粒酶mRNA表达及活性,进而抑制其增殖、促进其凋亡,有望成为肾癌基因治疗的有效工具。     

端粒酶反义RNA基因转染抑制裸鼠人膀胱癌移植瘤生长的研究

目的　观察端粒酶反义RNA基因转染对裸鼠膀胱癌移植瘤细胞生长的影响。方法将脂质体介导的端粒酶反义RNA真核表达载体 (pBBS hTR)、空载体 ( pBBS 2 12 )及生理盐水注入移植瘤体内 (每天 3 0 0 μl,共 7d) ,应用端粒酶活性聚合酶链反应 酶联免疫吸附试验 (PCR ELISA)、苏木素 伊红 (HE)染色、透射电镜等连续观察 6周移植瘤组织细胞端粒酶活性和生长变化。结果　注射转染pBBS hTR组和空载体组瘤体积抑制率分别为 48.7%和 2 .8% (P <0 .0 5 )。转染pBBS hTR组端粒酶活性降低 ,细胞生长受抑制。电镜观察见典型凋亡特征。 结论　端粒酶反义RNA基因瘤体内注射转染有效地抑制裸鼠人膀胱癌细胞生长 ,具有潜在临床应用价值。     

人ODCmRNA反义抑制敏感位点的筛选

目的：为建立有效的肿瘤治疗方法，筛查ODCmRNA最佳反义抑制位点。方法：采用RT—PCR的方法从肝癌细胞中扩增出鸟氨酸脱羧酶（ODC），外显子2、外显子3、外显子6—10、外显子11—12 4段基因片段。通过TA克隆反向连接到pcDNA3．1上，酶切测序并鉴定插入方向。脂质体法转染重组载体及空载体到肝癌MMC7721细胞中，采用Western—blot法检测各载体对ODC蛋白表达的抑制作用，采用四唑磕比色试验验证并比较各载体对MMC7721细胞增殖活性的影响。结果：外显子2、外显子3、外显子6—103个位点的ODC反义RNA表达载体转染细胞后，细胞内ODC蛋白表达量明显降低，细胞增殖活性受到明显抑制，抑制率分别为59％、62％、64％。结论：ODC外显子2、外显子3、外显子6—10是较好的反义抑制敏感位点。     

端粒酶hTERT基因反义核酸对前列腺癌细胞PC3端粒酶活性的抑制作用

目的探讨hTERT基因的两端部分硫代修饰反义寡核苷酸（ASPS—ODN）对前列腺癌细胞PC3端粒酶活性的抑制作用。方法采用端粒重复序列扩增法及TRAP-PCR-ELISA法检测前列腺癌细胞的端粒酶活性；采用RT-PCR方法检测hTERT基因mRNA的表达水平；以免疫组化通过流式细胞仪检测hTERT基因蛋白水平的变化。结果hTERT基因的两端部分硫代修饰ASPS—ODN作用于PC3细胞48h，其端粒酶活性下降，作用72h，其端粒酶活性受到抑制。结论通过hTERT基因的两端部分硫代修饰ASPS—ODN特异性抑制hTERT基因mRNA的表达，可降低前列腺癌细胞PC3端粒酶活性。     

反义人端粒酶逆转录酶基因转染对人胃癌细胞系的影响

目的探讨反义人端粒酶(hTERT)基因治疗的可行性。方法构建hTERT基因的反义表达载体,经脂质体介导转染人未分化胃癌细胞系HGC-27,通过Southernblot检测外源反义基因的整合;RT-PCR及DNA测序法检测反义基因的转录;RT-PCR半定量方法检测被封闭目的基因mRNA的转录水平;TRAP及PCRELISA方法检测细胞的端粒酶活性;流式细胞仪检测细胞周期变化。结果外源反义hTERT基因已整合入细胞并获稳定转录,且能显著封闭目的基因转录的mRNA,并显著抑制HGC-27细胞的端粒酶活性,抑制HGC-27细胞的增殖并促进其凋亡。结论端粒酶反义hTERT基因可有效地应用于胃癌的基因治疗。     

反义寡核苷酸对胆囊癌细胞端粒酶活性作用的实验研究

目的：探讨反义寡核苷酸对胆囊癌细咆端粒酶活性的影响及对胆囊癌细咆生长增殖的作用。方法：设计针对端粒酶RNA亚基模板序列并经硫代磷酸修饰的反义、正义和随机序列寡核苷酸，并以正常人成纤维细胞作对照，观察其对人胆囊癌细胞（GBC—SD）端粒酶活性和细胞生长增殖的影响作用以及对正常人成纤维细胞的作用。结果：反义寡核苷酸可有效地抑制胆囊癌细胞的端粒酶活性，呈剂量依赖性，并明显的抑制胆囊癌细胞的生长，对正常人成纤维细胞生长无明显作用。结论：硫代反义寡核苷酸（PS-ODN）对胆囊癌端粒酶活性有明显的抑制用并促进细胞凋亡。     

端粒酶反义基因对紫杉醇诱导原代胃癌细胞凋亡的增敏作用

目的：探讨端粒酶反义寡核苷酸（PS－ASODN）与紫杉醇（TAXOL）联合应用对原代胃癌细胞凋亡作用的影响。方法：常规组织块培养法进行胃癌细胞原代纯化培养．取第3代对数生长期细胞进行实验。各组在培养24h及48h分别加入相同剂量的培养液；终浓度：3μM的PS-ASODN。3μM的N-ASODN，1.0μM的TAXOL。作用24h后再分别在PS-ASODN组及N-ASODN组加入终浓度为1．0μM的TAXOL；分别于培养后24，48，72，96h收集各组细胞。以台盼蓝拒染法计算各组细胞生长抑制率，观察PS-ASODN联合TAXOL对原代胃癌细胞生长的影响；流式细胞学观察细胞凋亡率及细胞周期变化。结果：终浓度为3μM的PS-ASODN作用于原代胃癌细胞24h后加入TAXOU1．0μM．能明显抑制胃癌细胞增殖，同时流式细胞学检测到凋亡峰，细胞受阻于G2／M期．作用48．72，96h的凋亡细胞百分率（34．8％，44．6％及50.6％）明显高于TAXOL组及N-ASODN＋TAXOL组，差异有统计学意义（P〈0．05），其作用呈时间依赖性及序列特异性。结论：以端粒酶RNA模板区为靶点的PS-ASODN可促进TAXOL诱导的胃癌细胞凋亡．对胃癌具有重要治疗价值。     

端粒酶基因hTR在胃癌中的表达及临床意义

目的：探讨胃癌中端粒酶hTR基因表达与临床参数的关系，评价hTR表达在胃癌诊断中的价值。方法：用原位杂交的方法检测端粒酶hTR基因在胃癌，癌旁组织和胃良性病变中的表达和分布情况，并分析与各临床参数的关系。结果：57例胃癌中hTR基因表达阳性率为94．7％（54／57），57例癌旁组织中hTR基因表达阳性率为0（0／57），69例胃良性病变中hTR基因表达阳性率为2．9％（2／69）。胃癌组织中hTR基因的表达与癌旁组织，胃良性病变比较差异有显性（P均＜0．001），并与肿瘤分化程度，淋巴结转移相关（P均＜0．05），与肿瘤分期无相关性（P＞0．05）。结论：端粒酶hTR基因表达检测在胃癌诊断中可能有一定的价值。     

反义硫代寡核苷酸对人膀胱癌细胞端粒酶活性的影响

目的探讨端粒酶抑制剂对膀胱癌BIU-87细胞端粒酶活性的影响.方法用TRAP-ELASA法检测端粒酶抑制剂反义硫代寡核苷酸(asONS)对膀胱癌BIU-87细胞及其细胞裂解物端粒酶活性的影响.结果 asONS能够部分抑制人膀胱癌BIU-87细胞端粒酶的活性,呈现一定的浓度依赖性和时间依赖性;asONS与细胞裂解物直接作用组同作用细胞组相比,端粒酶活性下降的更为明显.结论 asONS如何有效通过细胞膜将是保证疗效的关键.     

膀胱癌组织中端粒酶活性研究

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）为基础的端粒酶活性检测方法（ＴＲＡＰ法），对５例正常膀胱组织、４例膀胱炎症组织、４２例膀胱癌组织和癌旁正常组织进行检测。正常膀胱组织和膀胱炎症组织无端粒酶活性，膀胱癌组织端粒酶表达阳性率７６．２％，癌旁组织阳性率为２６．２％，端粒酶活化与膀胱癌分期分级呈正相关。结果提示：端粒酶活化与膀胱癌浸润发展密切相关，癌旁组织端粒酶活化提示肿瘤微浸润可能。