人喉鳞癌组织中c-myc蛋白的表达及c-myc siRNA下调喉癌Hep-2细胞中c-myc的表达对细胞增殖的影响

目的:检测喉鳞状细胞癌组织中c-myc的表达及利用RNA干扰(RNAi)技术特异性地抑制喉癌Hew2细胞中c-myc的表达对细胞增殖及抗凋亡的影响,探讨在喉癌治疗中将c-myc作为基因治疗靶点的价值.方法:免疫组织化学法检测80例喉鳞状细胞癌和30例声带息肉组织中的c-myc和Rb蛋白的表达;利用RNAi技术将c-myc siRNA转染到喉癌Hep-2细胞中,Western Blotting法检测c-myc蛋白的表达,RT-PCR法检测c-myc mRNA的表达;MTT法检测转染c-myc siRNA 24、48、72 h后,或转染不同浓度的c-myc siRNA(25、50、75 nmol/L)培养72 h,或在转染后加入不同浓度的5-Fu培养48 h,细胞增殖情况;流式细胞仪检测c-myc siRNA与5-Fu联合应用对喉癌细胞凋亡的影响.结果:免疫组织化学结果显示c-myc蛋白在喉鳞状细胞癌组织中表达增强,Rb蛋白表达下降,二者存在负相关;Hep-2细胞转染c-myc siRNA后,c-myc蛋白和tuRNA的表达水平逐渐下调;MTT结果显示随着转染c-myc siRNA浓度的增加,Hep-2细胞的存活率受到明显的抑制,具有浓度依赖性;当转染c-myc siRNA(50 nmol/L)后Hep-2细胞的抑制效率随时间的延长而增加,具有时间依赖性;当联合使用5-Fu时,在同一浓度5-Fu作用下,转染c-myc siRNA组细胞的增殖活性明显受到抑制;凋亡检测结果显示,当c-myc siRNA与5-Fu联合使用时,可明显提高Hep-2细胞对5-Fu的敏感性,在较低剂量时凋亡细胞显著增加,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).结论:喉鳞状细胞癌组织中存在c-myc的高表达,c-myc siRNA可以特异性地下调Hew-2细胞中c-myc的表达,抑制喉癌细胞的增殖,增加细胞对5-Fu的敏感性,表明c-myc或许可以成为喉癌基因治疗中一个重要的分子靶点.     

选择性环氧化酶-2抑制剂对Hep-2细胞裸鼠移植瘤血管生成的影响

目的研究选择性环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制剂尼美舒利对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞(简称Hep-2细胞)裸鼠移植瘤血管生成的影响,并探讨其相关作用机制。方法建立Hep-2细胞裸鼠皮下移植瘤模型,实验组予以尼美舒利腹腔注射治疗,对照组腹腔等量注射生理盐水,4周后处死裸鼠并取肿瘤组织,利用免疫组化染色法检测移植瘤组织中CD31表达,并计算微血管密度(microvessel density,MVD),利用RT-PCR和免疫组化染色法分别检测移植瘤组织中COX-2、血管生成素-2(angiopoietin-2,Ang-2)、碱性成纤维生长因子(basicfibroblast growth factor,bFGF)mRNA和蛋白的表达,比较分析实验组与对照组MVD及COX-2、Ang-2、bFGF表达差异。结果实验组MVD值为12.83±3.06,明显低于对照组25.50±4.85,实验组移植瘤组织中COX-2、Ang-2、bFGF的mRNA和蛋白水平与对照组相比明显降低,且MVD与COX-2、Ang-2、bFGF蛋白表达水平关系密切。结论尼美舒利能有效抑制Hep-2细胞裸鼠移植瘤血管生成,其机制可能与抑制Ang-2、bFGF直接产生抗血管生成作用以及减少COX-2表达有关。     

蛋白激酶CK2α特异性siRNA对人喉癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的：研究蛋白激酶CK2α特异性siRNA对人喉癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤生长和蛋白激酶CK2α表达的影响。方法：裸鼠皮下种植人喉癌Hep-2细胞,肿瘤长到一定大小时,在肿瘤局部注射蛋白激酶cK2a特异性siRNA表达质粒,观察肿瘤生长情况,应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测蛋白激酶CK2α mRNA在肿瘤中的表达,应用免疫组织化学方法检测蛋白激酶CK2α蛋白在肿瘤中的表达。结果：转染蛋白激酶CK2α特异性siRNA表达质粒后,裸鼠移植瘤生长缓慢（P〈0．01）,裸鼠移植瘤中蛋白激酶CK2α mRNA和蛋白表达均较非特异干扰组和空白组明显下降（P〈0．05）。结论：蛋白激酶CK2α特异性siRNA表达载体可以下调裸鼠移植瘤中蛋白激酶CK2α表达,抑制肿瘤生长。RNA干扰技术可能成为治疗喉癌的一种新途径。     

低氧对Hep-2细胞肿瘤干细胞特性和化疗抵抗的影响及其作用机制

目的 探讨低氧对Hep-2细胞肿瘤干细胞特性和化疗抵抗的影响,并分析其相关机制.方法 构建针对低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor 1 alpha,HIF-1α)的短发夹RNA重组质粒,转染Hep-2细胞,经筛选建立HIF-1 α基因敲除的Hep-2细胞并检测HIF-1α表达的变化;观察低氧条件培养的Hep-2细胞增殖、克隆形成、细胞周期、凋亡及CD133表型等细胞生理学特性变化;流式细胞仪分选CD133+细胞,观察CD133+细胞克隆形成及顺铂杀伤情况,并检测相关基因Oct-4、p53及survivin表达变化.用方差分析及两样本均数比较的t检验进行统计分析.结果 成功建立HIF-1α基因敲除Hep-2细胞,HIF-1 α在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调;低氧培养Hep-2细胞具有较高的增殖活性及克隆形成能力,凋亡率降低,细胞周期GO/G1期阻滞、CD133表达升高,而HIF-1α基因敲除后上述变化减弱;成功分选出Hep-2细胞中的CD133+细胞,CD133+细胞克隆形成能力高、顺铂杀伤抗性强,而HIF-1α基因敲除后上述能力降低,并出现Oct-4表达下调,p53表达上调,survivin表达下调.结论 低氧能够诱导和强化Hep-2细胞的肿瘤干细胞特性,增强CD133+细胞的增殖分化和化疗抵抗能力,其作用机制可能与HIF-1α及其诱导的相关基因表达变化相关.     

紫杉醇对人喉癌细胞系Hep-2的抑制作用研究

目的：通过体外实验评价紫杉醇对人喉癌细胞系Hep-2的抑制作用。方法：应用人喉癌细胞系Hep-2，将细胞暴露于不同浓度紫杉醇下，分别于6、12、24、48、72h收集标本，进行细胞形态观察；流式细胞仪细胞周期分析；MTT法检测细胞生长情况，绘制细胞生长曲线；应用琼脂糖凝胶电泳进行检测和观察。结果：人喉癌细胞系Hep-2在紫杉醇的作用下，细胞分裂阻滞在分裂期的中期，并诱导细胞发生凋亡；凋亡细胞表现为细胞固缩，核染色质凝聚或者断裂；细胞DNA裂解片段呈现典型的“阶梯状”排列的条带；紫杉醇对Hep-2的细胞毒性与剂量和时间有依赖关系。结论：紫杉醇诱发人喉癌细胞凋亡与细胞分裂期阻滞密切相关，随浓度和时间延长，G2／M期细胞的比率也增高。     

阻断氯通道对人喉癌裸鼠移植瘤ERK1/2和AKT1的影响

目的研究氯通道阻断剂5-硝基-2-(3-苯丙氨基)苯甲酸[5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)benzoicacid,NPPB],对人喉癌细胞系Hep-2细胞裸鼠移植瘤细胞外调节激酶(extracellulat regulated kinase,ERK)ERK1/2和AKT1蛋白磷酸化的影响,探讨阻断氯通道对喉癌移植瘤抑制作用的可能机制。方法以人喉癌Hep-2细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型,应用不同浓度的NPPB分组进行治疗实验,研究移植瘤生长变化,Westernblot法检测移植瘤ERK1/2和AKT1蛋白磷酸化水平的变化。结果与对照组比较,各治疗组移植瘤ERK1/2和AKT1总蛋白水平无显著性差异,50、100、150μmol NPPB组ERK1/2和AKT1蛋白磷酸化水平明显降低,差异均有显著性,NPPB浓度依赖性地抑制ERK1/2和AKT1蛋白磷酸化。结论体内阻断氯通道可以抑制人喉癌裸鼠移植瘤的生长,其机制可能与抑制移植瘤细胞ERK1/2和AKT1蛋白磷酸化有关。     

CXCR4小干扰RNA对人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的 探讨CXC族趋化因子受体4(CXCchemokine receptor 4,CXCR4)小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA)对人喉癌细胞株Hep-2细胞裸鼠体形成的移植瘤淋巴结微转移的影响.方法 将与CXCR4mRNA互补的siRNA通过阳离子脂质体转染Hep-2细胞,用RT-...     

槲皮素对人喉鳞状细胞癌细胞系Hep-2的作用

目的:探讨槲皮素对体外培养的人喉鳞状细胞癌细胞系Hep-2生长的影响及作用机制,研究槲皮素治疗喉癌的可行性.方法:采用MTT法、倒置相差显微镜及流式细胞仪观察槲皮素对人喉鳞状细胞癌细胞系Hep-2的作用情况.结果:槲皮素呈时间和浓度依赖性抑制Hep-2细胞的增殖,使Hep-2细胞贴壁能力减弱,形态变小变圆,悬浮细胞和颗粒增加,引起Hep-2凋亡,细胞周期阻滞于S期.结论:槲皮索能够抑制喉鳞状细胞癌细胞系Hep-2的生长和增殖,其抑制作用与细胞凋亡有关.     

紫杉醇对Hep-2细胞株的细胞毒性

紫杉醇作为一种抗微管新药,在头颈部肿瘤的临床治疗中已取得初步疗效。本实验观察紫杉醇对人喉癌Hep-2细胞株的细胞毒性作用,对其诱导的细胞周期阻滞和细胞凋亡进行探讨,旨在为该药的临床开发提供理论依据。     

人喉鳞癌裸鼠移植瘤株的建立及平阳霉素治疗的研究

用人喉鳞癌组织直接接种于裸鼠，建立了一株裸鼠移植瘤株，命名为ＨＬＣ＿（１４）（取自Ｈｕ－ｍａｎＬａｒｙｎｇｅａｌＣａｎｃｅｒ）。鼠间传代２５代，历时２年多，生长稳定，潜伏期短，鼠间移植成功率达１００％。光镜和电镜下形态与原发瘤相似，染色体分析显示人类肿瘤染色体特点，免疫组化检测细胞内角蛋白反应阳性，显示为上皮来源的肿瘤。平阳霉素治疗的实验研究表明：平阳霉素对ＨＬＣ＿（１４）有明显的作用，抑制率为９０．７％。     

RNA干扰抑制c-Met表达对喉癌Hep-2细胞体内外生长的影响

目的 采用RNA干扰(RNAi)技术抑制人喉癌Hep-2细胞c-Met基因表达,观察对其体外生物学活性和体内生长的影响.方法 构建能够表达针对c-Met的小干扰RNA的RNAi质粒和表达不针对任何已知mRNA的siRNA的阴性对照RNAi质粒,采用阳离子脂质体Lipofectamine2000作为转染试剂将其转染人喉癌细胞株Hep-2,通过RT-PCR及Western Blot方法检测转染效率,筛选出抑制效果最好的c-Met-siRNA序列;通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、运动实验及侵袭实验比较转染前后细胞的生长、运动及侵袭能力.在裸鼠喉癌皮下荷瘤模型模拟c-Met-siRNA基因治疗实验中,采用Western Blot法检测重组质粒对c-Met基因及MMP-9、VEGF基因表达的影响.结果 pSilencer2.0/c-Met-shRNA转染人喉癌细胞株Hep-2后,c-Met的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P值分别为0.003和0.02),细胞的生长、运动及侵袭均受到明显抑制(P值分别为0.001,0.004和0.004).肿瘤接种到裸鼠后第35天,重组质粒组肿瘤体积为(138±27)mm~3,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01);重组质粒组瘤体内c-Met、MMP-9、VEGF基因表达率比对照组明显降低(P<0.05).结论 c-Met-siRNA能成功下调靶基因的表达,并能显著抑制喉癌Hep-2细胞的生长、运动、侵袭及移植裸鼠成瘤后的生长,siRNA表达质粒介导的基因治疗有希望成为喉癌靶向性c-Met治疗的新策略.     

内皮抑素治疗人喉癌裸鼠模型的实验研究

目的 研究内皮抑素对裸鼠喉鳞状细胞癌皮下移植模型的抑瘤作用,探讨其抑瘤机制及人喉癌生物治疗新方法。方法 建立人喉癌Hep-Ⅱ细胞株裸鼠皮下接种模型。应用内皮抑素治疗,观察肿瘤生长情况,对用药后肿瘤组织进行病理学检查,通用型二步法免疫组化检查及电镜观察。计数微血管密度(microvessel density,MVD),计算增殖细胞核抗原(proliferationg cell nuclear antigen,PCNA)和血管内皮生长因子(vascuoar endothelial growth factor,VEGF)阳性率。结果 在实验组与对照组之间,鼠净重、瘤重、瘤体积及瘤重/鼠净重,经t检验P值<0.05或<0.01,差异均有显著性意义,抑瘤率为45.9％。病理学检查及电镜观察表明,实验组应用内皮抑素治疗肿瘤生长受到抑制,细胞分裂少见,可见肿瘤细胞的坏死凋亡,新生血管明显减少。MVD、PCNA及VEGF表达在实验组明显低于对照组,经t检验P值分别为<0.01、<0.05、<0.05,差异均有显著性意义。结论 内皮抑素可显著抑制人喉癌裸鼠模型肿瘤的生长和发展,其可能机制为抑制肿瘤血管生成。     

多胺生物合成抑制剂对Hep-2细胞生长及端粒酶活性影响的研究

目的观察多胺生物合成抑制剂二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine,DFMO)对人喉鳞状细胞癌细胞Hep-2生长特性及端粒酶活性的影响,以期为抑制多胺生物合成逆转肿瘤恶性表型的分子机理寻找线索.方法根据细胞形态、细胞生长曲线及流式细胞计(flowcytometer)观察分析Hep-2细胞生长状况;用端粒酶重复序列扩增法(telomeraserepeatamplificationprotocol,TRAP)检测Hep-2细胞端粒酶活性.结果DFMO(2.5mmol/L或5mmol/L,5d)处理Hep-2细胞,其生长受到明显抑制;G1期细胞增多,而S期细胞减少;细胞形态及FCM证明有细胞凋亡诱导;端粒酶活性受到明显抑制.当用腐胺与DFMO同时处理Hep-2细胞时可防止上述变化的发生.结论多胺生物合成抑制剂可引起Hep-2细胞的增殖抑制及凋亡诱导,这些变化与端粒酶活性的抑制有关.提示端粒酶的抑制可能是抑制多胺生物合成导致肿瘤恶性表型逆转的重要因素.     

喉鳞状细胞癌和喉乳头状瘤中Survivin表达的意义

目的：探讨Survivin蛋白在喉鳞状细胞癌和成人喉乳头状瘤中的表达及其意义。方法：应用免疫组化方法对46例喉鳞状细胞癌、24例癌旁组织和20例喉乳头状瘤以及16例正常喉粘膜标本中Survivin的表达进行检测。结果：Survivin蛋白在喉癌组织、癌旁组织和喉乳头状瘤中的阳性表达率分别为71.74%（33/46）、33.33%（8/24）和40.0%（8/20）,在正常黏膜组织中没有表达,喉癌组中的阳性表达率分别显著高于正常组织、癌旁组织及喉乳头状瘤中的表达率（均P〈0.01）。且发生恶变的喉乳头状瘤Survivin蛋白均为阳性表达。但Sur-vivin阳性表达与喉癌的发生部位、分级、分期、淋巴结转移以及病理分级没有关联。结论：Survivin在喉癌组织中过度表达,参与了喉癌的形成,是喉癌形成的一个早期事件,可望成为预测成人喉乳头状瘤恶变的一个诊断方法。     

人乳头瘤病毒16 E6和E7基因对人喉鳞癌细胞系增殖和分化的影响

目的研究人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）16E6和E7基因对Lscc-02人喉鳞癌细胞系增殖和分化的影响，以探讨HPV16与喉鳞癌演进的关系。方法采用阳离子脂质体基因转染技术将携带有HPV16和E7DNA的真核表达质粒导入HPV阴性的Lscc-02喉鳞癌细胞系，以载体质粒转染的细胞以及未转染细胞为对照，观察并比较体外及裸鼠体内细胞的增殖状态和分化程度。结果转染HPV16和E7的喉鳞癌细胞体外增殖加快，增殖A比值为2．96，高于载体质粒转染的细胞1．90以及未转染细胞1．85，软琼脂克隆形成率较载体质粒转染的细胞以及未转染细胞增大，分别为23．6％、12．7％、12．0％，血清依赖降低；增殖核抗原Ki-67表达的阳性百分数为93．8％，明显高于载体质粒转染细胞的80．7％以及未转染细胞的79．2％；角蛋白13表达的阳性百分数为80．9％，明显低于载体质粒转染细胞的91．0％以及未转染细胞的93．7％；裸鼠体内转染HPV16和E7的喉鳞癌细胞移植瘤潜伏期及体内倍增时间较载体质粒转染的细胞以及未转染细胞缩短，潜伏期分别为19d、28d、30d，体内倍增时间分别为2．15d、3．28d,3．47d，瘤组织细胞变小，异形性增大，细胞核分裂象多，有向低分化鳞癌发展趋势。结论HPV16和E7促进Lscc-02喉鳞癌细胞系增殖，抑制其分化，使肿瘤细胞的恶性增强，提示HPV16在喉鳞癌的演进过程中可能起重要作用。     

巨噬细胞集落刺激因子对喉鳞状细胞癌喉癌细胞株的作用

目的:了解和探讨巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)及其受体对喉鳞状细胞癌细胞株(Hep2)细胞系的作用。方法:使用氚标记胸腺嘧啶核苷(3HTDR)掺入法和MTT法测试MCSF作用于Hep2后细胞的增殖状况,并测试加入巨噬细胞集落刺激因子受体(MC-SFR)抗体后细胞生长情况。ELISA法测试M-CSF作用Hep2细胞后上清中的MCSF的浓度变化。结果:Hep2细胞培养后较培养前的上清中的MCSF的浓度升高。加入的M-CSF浓度越大,细胞增殖越差,加入MCSFR抗体浓度越大细胞增殖越好。结论:MCSF对喉癌细胞Hep2细胞的增殖具有抑制作用。     

基质金属蛋白酶-2在喉鳞状细胞癌中的表达及临床意义

目的：探讨基质金属蛋白酶（MMP）-2在喉鳞状细胞癌（LSCC）中的表达及临床意义。方法：采用免疫组织化学SP法检测了63例LSCC及其中20例癌旁安全缘正常组织（ASM）和18例声带息肉（VCP）中MMP2的表达。结果：MMP2在LSCC、VCP和ASM中的阳性率分别是66．7％、33．3％、15．0％，3者之间均差异有统计学意义（均P〈0．05）；在I．SCC不同病理分级Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级间表达存在差异（均P〈0．05）；在LSCC淋巴结转移与非转移者间的表达差异无统计学意义（P〉0．05）；在不同临床分期及不同年龄组间的表达差异无统计学意义。结论：MMP-2可能只在LSCC发生及发展中起重要作用，而与LSCC的转移无关。     

1,25二羟维生素D3对人喉鳞状细胞癌细胞系增殖及凋亡的影响

目的：研究1,25二羟维生素D3[1,25（OH）2D3]对Lscc-02人喉鳞状细胞癌细胞系增殖及凋亡的影响。方法：将不同浓度的1,25（OH）2D3与Lscc-02人喉鳞状细胞癌细胞系共同培养,采用MTT法、流式细胞仪及透射电镜观察该细胞系的增殖及凋亡诱导情况。结果：（10^-10～10^-7）mol／L浓度的1,25（OH）2D3均能抑制Lscc-02细胞系的增殖,抑制作用随1,25（0H）2D3浓度的增加而增强,在半抑制浓度时,抑制作用随时间延长而增强。流式细胞仪显示,经1,25（OH）2D3作用的喉鳞状细胞癌细胞位于细胞周期G0／G1期的细胞数量明显增多且细胞凋亡数目明显增加。结论：1,25（OH）2D3体外能抑制Lscc-02细胞系的增殖并诱导细胞凋亡,为临床探索1,25（OH）2D3治疗喉癌提供了重要的实验依据。     

紫杉醇对人喉鳞状细胞癌Hep-2放射增敏作用的实验研究

目的 在体外用细胞生物学实验技术了解紫杉醇联合直线加速器X射线照射对Hep-2细胞株的作用，以及紫杉醇对Hep-2细胞株细胞周期的影响，并探讨其作用机制。方法 ①用MTT法计算Hep-2细胞经直线加速器照射组；先紫杉醇作用12、18、24、30h后再直线加速器照射组；先直线加速器照射再联合紫杉醇作用12、18、24、30h组各组细胞生长抑制率。②应用流式细胞仪检测Hep-2细胞经紫杉醇作用12、18、24、30h后各组细胞周期分布。结果 ①先紫杉醇作用再直线加速器照射组细胞生长抑制率较高（各组均值达到87．51％～89．64％），与先照射再联合紫杉醇组细胞生长抑制率（各组均值为57．84％～64．34％）及单纯照射组细胞生长抑制率（均值为41．90％）相比有统计学意义（P〈0．01）。②用紫杉醇后Hep-2细胞株细胞周期停滞于G2／M期，G2／M期停滞于24-30h达到峰值（24．65％～25．15％），并在用药后30h观察到凋亡峰。结论 紫杉醇有放射增敏作用，其可能机制是使细胞生长停滞于射线敏感期G2／M期，从而加强射线对肿瘤细胞的杀伤效应。