口腔癌患者外周血树突状细胞的体外培养及表型分析

目的：研究口腔癌患者外周血单核细胞来源的树突状细胞（dendritic cell，DC）形态、表型，与正常人进行比较并分析其临床意义。方法：15例口腔癌患者（实验组）及正常人（对照组）外周血单核细胞经GMCSF，IL4及TNF-α诱导培养，获取成熟树突状细胞，光镜和电镜观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞表型CD1a、CD83、CD80、CD86和HLA-DR的表达变化。结果：培养7d后，2组均诱导出典型形态和表型的树突状细胞，实验组CD83、CD1a的表达率较对照组低，差异有统计学意义（均P〈0．001），但CD86、CD80、HLADR表达率2组差异无统计学意义（均P〉0．05）。结论：口腔鳞癌患者外周血单核细胞来源的DC经细胞因子诱导培养，能扩增出较大量高纯度并保持功能活性的成熟DC，为进一步开展以DC为基础的生物治疗和研究打下了基础。     

舌鳞癌患者外周血树突状细胞的体外培养和鉴定

目的：探讨应用GM—CSF、IL-4、TNF—α及肿瘤细胞裂解液体外诱导舌鳞状细胞癌患者外周血来源树突状细胞（DC）的方法。方法：选取10例舌鳞状细胞癌患者和6例健康人，抽取外周血，分离单核细胞，经贴壁获得树突状细胞前体细胞，在体外先后加入GM—CSF、IL-4和肿瘤细胞裂解液、TNF—α诱导培养，获得成熟DC，进行形态学观察，以流式细胞术检测DC标志物表达率。实验中设置舌癌组和健康对照组，肿瘤裂解液诱导组和空白对照组，采用t检验进行统计学分析。结果：经9d诱导培养，细胞数量增加，体积增大，相差显微镜、HE染色和扫描显微镜下均见细胞表面树突状突起，呈典型DC形态。舌癌组DC平均获得率9．9％，与健康组无显著差异（P=0．1287）。舌癌组成熟DC标志物CD83表达率为37．19％，共刺激因子CD40、CD80和MHC分子HLA—DR的表达率分别为51．79％、48．43％和65．82％。与健康组无显著差异（P〉0．05）。肿瘤细胞裂解液诱导组较对照组可获得更高的DC获得率和成熟率，分别为P=0．0186和P=0．0473。结论：舌癌患者外周血来源DC前体细胞经体外诱导培养，可以转变为形态和功能成熟的DC；肿瘤细胞裂解液刺激，有助于提高DC获得率和成熟率。     

口腔鳞癌中树突状细胞的免疫组化分析

目的　通过分析口腔鳞癌中浸润性树突状细胞的特征性表型,以探讨其在肿瘤微环境中的功能状态。方法　选择未经任何非手术治疗的初发口腔鳞癌患者标本34例作为实验组,30例口腔正常粘膜组织作为对照组。通过免疫组化技术标记组织中树突状细胞(DC)的CD1a,HLA-DR和CD83抗原,观察两种组织中的DC表达3种抗原的状况,结果进行统计学分析。结果　所有病例均未见明显CD83+DC,但均有CD1a+DC,其在口腔鳞癌组织中的浸润程度低于正常口腔粘膜组织,差异有显著性(P<0·05)。在口腔鳞癌组中有27例癌实质内的DC表达HLA- DR抗原,其HLA-DR的阳性表达率为79·41%。结论　口腔鳞癌组织中的DC,其浸润程度下降并存在功能成熟障碍。     

Avastin联合抗原致敏的DC-CTL细胞体外抑制口腔鳞癌细胞生长的实验研究

目的:研究贝伐单抗(Bevacizumab,Avastin)与口腔鳞癌抗原致敏的树突状细胞(Dendritic Cell,DC)诱导的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic t Lymphocyte,CTL)联合应用,体外研究其对口腔鳞癌细胞生长的抑制作用。方法:CAL27、SCC4肿瘤细胞系的培养,检测VEGF分泌水平;培养人外周血单核细胞来源的树突状细胞(DC);冻融法制备SCC4口腔鳞癌细胞可溶性抗原并致敏DC,检测DC表面标志物变化,刺激同种异体T细胞增殖的能力及IL-12分泌水平;将同源人T淋巴细胞与之共同培养诱导出抗原特异性的CTL细胞,Avastin联合CTL对SCC4细胞进行体外杀伤实验。结果:SCC4较CAL27分泌更高水平的VEGF;经肿瘤抗原致敏后的DC,其表面标志CD83、CD80、CD86、CD40及功能相关分子IL-12表达上调,CD1a的表达下调,可显著刺激异体T淋巴细胞增殖,具有统计学差异;Avastin联合CTL对SCC4的杀伤率达56.1%,显著高于对照组(P<0.05)。结论:Avastin联合DC致敏的CTL能显著抑制口腔癌细胞的生长。     

舌癌Tca-83细胞培养上清对树突状细胞表型及生成的影响

目的:探讨Tca-83肿瘤细胞培养上清对树突状细胞(dendritic cell,DC)表型及生成的影响。方法:培养健康志愿者外周血单个核细胞源DC,加入细胞因子和Tca-83细胞培养上清作为实验组,培养7d,以正常培养体系为对照组。倒置显微镜及扫描电镜观察细胞的形态,流式细胞仪分析细胞的表型。结果:Tca-83细胞培养上清作为条件培养的DC,细胞形态不典型,数量明显减少。低表达CD80,CD83,HLA-DR等表面分子,与正常培养组相比显著降低(P<0.001)。结论:Tca-83肿瘤细胞培养上清中的某些因子抑制DC表面的分子表达,对DC的分化和成熟有明显的抑制作用。     

口腔鳞癌及其临床病理特征对外周血树突状细胞的影响

目的:探讨口腔鳞癌临床病理特征对患者外周血树突状细胞的影响.方法:采用流式细胞术对81例口腔鳞癌患者外周血DC水平进行检测,分析口腔鳞癌及其临床病理特征对外周血树突状细胞的影响.结果:与口腔颌面部良性病变者相比,OSCC患者外周血DC水平显著降低(P<0.05).肿瘤的大小、淋巴结转移情况、临床分期以及肿瘤分化程度对肿瘤患者外周血DC水平均有显著的影响(P<0.05).结论:OSCC可能阻抑DC的分化发育,导致外周血DC水平降低.这种DC的下降与OSCC的临床病理特征有关,而且可能影响DC启动的机体抗肿瘤免疫作用.     

树状细胞疫苗抑制肿瘤的实验观察

目的观察经肿瘤抗原致敏的树状细胞（DC）疫苗对荷瘤裸鼠的抑瘤作用。方法重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重组人白细胞介素4（rhIL-4）、重组人肿瘤坏死因子α（rhTNF-α）协同诱导人外周血单核细胞成为DC。Tea8113舌癌细胞可溶性抗原体外致敏DC，将同源人T淋巴细胞与之共同培养诱导出抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs），共同接种至荷瘤裸鼠体内行免疫治疗。结果人外周血单核细胞在细胞因子协同诱导下可获得功能正常的DC，用致敏DC＋CTLs免疫治疗的荷瘤裸鼠与其他实验组相比，明显抑制肿瘤生长，肿瘤倍增时间显著提高（P〈0．05）。结论从人外周血来源的单核细胞在多种细胞因子作用下可诱导为功能正常的DC、冻融抗原体外致敏的DC，经其激活的肿瘤特异性CTLs对荷舌鳞癌裸鼠有明显的免疫治疗作用，可望成为口腔颌面部舌癌免疫治疗的新途径。     

DC在口腔鳞癌中的活化率分析

目的:探讨肿瘤浸润树突状细胞(tumor infiltration dendritic cells,TIDC)在口腔鳞癌中的活化率和意义。方法:采用免疫组织化学方法(Envision法)对10例正常口腔黏膜、10例癌前病变及30例不同分化程度口腔鳞癌中CD1a、HLA-DR的表达进行检测,并结合细胞形态特征确定树突状细胞(dendritic cells,DC)在组织中的浸润程度,依据Sprinzl等提出的分级标准分级,对其活化率进行统计分析。结果:①DC活化率:癌前病变组显著高于正常口腔黏膜组和口腔鳞癌组(P<0.01);而口腔鳞癌组略高于正常口腔黏膜组,但差异无显著性(P>0.05)。②CD1a表达阳性的DC活化率均与年龄、性别、发病部位无关(P>0.05)。③CD1a表达阳性的DC浸润程度与活化率间呈正相关(r=0.615,P<0.01)。结论:①口腔鳞癌中TIDC数量减少并存在功能缺陷,且随着恶性程度增加而加重。②TIDC浸润度及活化率反映了组织局部的免疫状况,可作为判断机体抗肿瘤免疫能力的一项指标。③肿瘤组织中TIDC浸润度及活化率降低,可能是肿瘤发生免疫逃逸的原因之一。     

程序性死亡分子1及其配体在口腔鳞状细胞癌患者外周血中的表达及临床意义

目的 检测口腔鳞状细胞癌患者外周血中程序性死亡分子1（PD-1）及其配体（PD-L1）的表达水平,探讨其生物学及临床意义。方法 选取82例口腔鳞状细胞癌患者（口腔鳞癌组）和25例健康对照者（对照组）为研究对象,收集研究对象的外周血,采用流式细胞术检测外周血T淋巴细胞表面PD-1、PD-L1的表达及T淋巴细胞亚群计数,采用酶联免疫吸附方法检测血清中可溶性PD-1（sPD-1）和可溶性PD-L1（sPD-L1）的表达水平。采用SPSS 17.0软件对数据进行检验和相关性分析。结果 口腔鳞癌组外周血CD8+ T淋巴细胞百分数明显高于对照组（P<0.05）,而CD3+、CD4+T淋巴细胞百分数及CD4+/CD8+T亚群百分数比值均低于对照组（P<0.05）。口腔鳞癌组外周血CD4+、CD8+ T淋巴细胞表面PD-1、PD-L1的阳性表达率均高于对照组（P<0.01）。口腔鳞癌组血清sPD-L1水平高于对照组（P<0.05）,而sPD-1水平二者差异无统计学意义（P>0.05）。sPD-L1的表达与临床分期、肿瘤分化程度及淋巴结转移状态相关（P<0.05）,与性别、年龄、肿瘤部位及大小无关。结论 口腔鳞状细胞癌患者外周血T淋巴细胞亚群存在不同程度的免疫功能抑制,CD4+和CD8+ T淋巴细胞表面PD-1及PD-L1表达显著升高。异常升高的sPD-L1可能与口腔鳞状细胞癌的发生发展有关。     

树突状细胞体外诱导淋巴细胞抑制舌癌细胞生长的实验研究

目的 :探讨树突状细胞 (dendriticcell,DC)通过淋巴细胞介导的免疫反应对舌癌细胞生长的影响。方法 :外周血单核细胞 ,在GM CSF IL 4的诱导下体外培养。其中一组加入TNF α ,另一组不加TNF α ;以不加任何细胞因子作为对照。用Tca8113细胞冻融抗原冲击后 ,加入自体淋巴细胞一起培养。再按 10 0∶1效靶比与Tca8113共培养 ,设未致敏淋巴细胞 Tca8113组 ,单独Tca8113组作对照。行形态学观察 ,免疫细胞化学检测DC的CD1a、CD83、HLA DR表达状况 ,MTT法检测Tca8113的存活率。结果进行统计学分析。结果 :( 1)加入TNF α组更高表达CD83 ,不加入TNF α组经肿瘤抗原刺激后 ,CD83表达急剧增加。 ( 2 )DC激活的淋巴细胞可显著抑制舌癌细胞的生长。结论 :GM CSF IL 4诱导的单核细胞来源的DC ,能体外摄取肿瘤抗原而进一步成熟 ,通过激活淋巴细胞抑制舌癌细胞生长 ;TNF α能促DC成熟 ,诱发更强的抑制作用。     

口腔鳞癌VEGF诱导树突状细胞致免疫耐受的机制研究

目的 探讨口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)中血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)诱导树突状细胞(dendritic cells, DCs)向免疫耐受型转化的作用及机制。方法 将树突状细胞分为4组：对照组(DC)、VEGF组(DC中加入外源性VEGF)、共培养组(DC与SCC7细胞共培养)及抗VEGF组(DC与SCC7细胞共培养后加入VEGF抗体),采用流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测DC表面标记分子的表达情况;为了检测DC对T细胞增殖的影响,将实验分为5组：空白组(T细胞)、对照组(T细胞+DC)、VEGF组(T细胞+DC+VEGF)、共培养组(T细胞+DC+SCC7细胞上清)及抗VEGF组(T细胞+DC+SCC7上清+VEGF抗体),采用混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction, MLR)检测;分别应用Western blot、real time PCR及FCM检测各组DC中吲哚胺-2,3-双加氧酶(indole...     

腺样囊性癌细胞凋亡抗原负载的树突状细胞诱导抗肿瘤效应的体外研究

目的 探讨负载腮腺腺样囊性癌细胞凋亡肿瘤抗原的树突状细胞,诱导淋巴细胞介导的免疫反应,观察其体外杀伤腺样囊性癌细胞的细胞毒性效应.方法 外周血单核细胞,在粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor GM-CSF) 白细胞介素-4(Interleukin-4 IL-4)的诱导下体外培养,用凋亡肿瘤细胞抗原冲击后,流式细胞仪检测树突状细胞抗原负载前后CD1a、CD83表达量的变化.采用MTT比色法检测同种混合淋巴细胞反应和诱导细胞毒性T细胞(Cytotoxic T lymphocyte CTL)反应.结果 凋亡肿瘤抗原刺激后,CD83 表达急剧增加(P＜0. 01),而CD1a表达量下调(P＜0.01).负荷凋亡肿瘤抗原树突状细胞体外诱导出明显的细胞毒性反应,并刺激同种T淋巴细胞增殖.结论 GM-CSF IL-4 诱导的单核细胞来源的树突状细胞 ,能在体外摄取凋亡肿瘤抗原而进一步成熟,通过激活淋巴细胞杀伤癌细胞.     

口腔鳞癌引流区淋巴结中树突状细胞特征性表型的免疫组化分析

目的:探讨OSCC的DLN中DC的功能状态。方法:免疫组化标记OSCC的DLN和扁桃体组织中DC的CD1 a,CD83分子。统计CD1 a DC和CD83 DC的浸润程度,以及CD83 DC/CD1 a DC的比值。结果:CD1 a DC在OSCC的DLN中的浸润程度显著高于扁桃体组织(P<0.01),在鳞癌转移的淋巴结中显著低于未转移的淋巴结(P<0.01)。CD83 DC浸润程度在OSCC的DLN中明显低于扁桃体(P<0.01),但鳞癌转移的淋巴结与未转移者无显著差异(P>0.05)。OSCC的DLN中CD83 DC/CD1 a DC的比值显著低于扁桃体组织(P<0.05)。结论:OS-CC的DLN中,DC以不成熟DC为主,难以实现其激活T淋巴细胞反应的能力。     

抗菌治疗对兔颊VX-2鳞癌感染性微环境中树突状细胞的影响

目的:探索抗菌治疗对兔颊VX-2鳞癌感染性微环境中树突状细胞(dendritic cells,DCs)成熟及功能的影响.方法:瘤粒植入形成兔颊VX-2鳞癌后,附加机械创伤及高糖饮食获得该鳞癌的炎症模型,再分为3组(n=6),A组:颊癌炎症模型使用抗生素治疗3d;B组:颊癌炎症模型以生理盐水代替抗生素对照;C组:单纯颊癌不做处理.3d后收集各组肿瘤标本,制成匀浆,取上清液与正常兔外周血单核细胞共培养,流式细胞仪检测DCs表面分子HLA-DR、CD83、CD86的表达,混合淋巴细胞反应检测DCs刺激T细胞增殖的能力.结果:HLA-DR、CD83、CD86阳性率及刺激指数(stimulate index,SI)由高到低均分别为:C组＞A组＞B组(P＜0.05).结论:抗菌治疗有助于感染兔颊VX-2鳞癌微环境中树突状细胞的成熟及功能恢复.     

阿司匹林对兔颊VX-2鳞状细胞癌炎症微环境中树突细胞的影响

目的探索阿司匹林及炎症对兔颊VX-2鳞状细胞癌上清液中树突细胞（DC）成熟及功能的影响。方法通过瘤粒植入术及机械创伤+高糖饮食的方法,建立兔颊VX-2鳞状细胞癌及其炎症模型,将模型兔分为3组。实验组：制造颊癌及炎症后使用阿司匹林灌胃治疗3 d;对照组：制造颊癌及炎症后以生理盐水灌胃作为对照;空白组：不制造炎症的单纯肿瘤兔组。3 d后收集各组肿瘤标本,制成匀浆,取上清液与正常兔外周血单核细胞共培养以使其向DC分化,采用流式细胞仪检测DC表面分子CD83、CD86、人类白细胞DR抗原（HLA-DR）的表达,混合淋巴细胞反应检测DC刺激T细胞增殖的能力。结果实验组和对照组中CD83、CD86、HLA-DR阳性率均低于空白组（P<0.05）,而实验组和对照组间的差异无统计学意义（P>0.05）;同样,实验组和对照组刺激T细胞增殖的能力弱于空白组（P<0.05）,而两组间刺激T细胞增殖的能力无明显差异（P>0.05）。结论炎症可抑制DC表面分子CD83、CD86、HLA-DR的表达和功能发挥,短期、小剂量服用阿司匹林对兔颊VX-2鳞状细胞癌炎症微环境中DC的表型改善和功能发挥无明显作用。     

Deterioration of the Langerhans cell network of the human gingival epithelium with aging

Dendritic cells (DCs) are the professional antigen-presenting cells responsible for initiating of the immune response. Langerhans cells (LCs) are a type of DC that is a permanent resident of the oral epithelium. LCs are organized conforming a network in such a way as to maximize their surface area for efficient apprehension of antigens. To detect age-related changes in the LCs network, fragments of gingival epithelium spontaneously accompanying dental removals were processed by immunohistochemistry. Monoclonal antibody CD1a followed by biotinized immunoglobulin–streptoavidin peroxidase were used to identify the LCs with the light microscope. LC density and LC types were analyzed according to their morphology and intraepithelial distribution. In the older age group (61–74 years) the density was significantly lower than in the younger age groups. Morphologically, LCs showed fewer dendritic-branching processes and had a rounded shape in the older age group.

Present observations indicate that the LC network changes markedly with aging. These results suggest that immunological defense of the oral tissue might be compromised in old age.     

Porphyromonas gingivalis fimbriae induce unique dendritic cell subsets via Toll-like receptor 2

Backgound and Objective:  Dendritic cells (DCs) play a critical role in the activation of T cells as well as in shaping immune responses. We have reported previously that Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharides ( Pg LPS) induced a CD14⁺CD16⁺ DC subset with a weak immuno-stimulatory activity. In contrast, Escherichia coli LPS ( Ec LPS) induced fully matured DCs with strong immunostimulatory activities. Since Pg LPS as well as Pg fimbriae have been indicated to work as Toll-like receptor (TLR) 2 ligands, we speculate that the TLR usage of bacterial antigens may be critical for DC maturation.
Material and Methods:  We investigated the effect of Pg fimbriae on the phenotype and function of human peripheral blood DCs in comparison with a TLR2 ligand, peptidoglycan, and a TLR4 ligand, Ec LPS.
Results:  Flow cytometry revealed that Pg fimbriae and peptidoglycan but not Ec LPS induced CD14 and CD16 expression on peripheral blood DCs (CD14⁻CD16⁻). A monoclonal antibody against TLR2 abrogated this induction, but an antibody against TLR4 had no effect. Dendritic cells stimulated with Pg fimbriae had a weaker capability to induce allogenic T cell proliferation and exhibited a weaker production of interleukin-8 and regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted (RANTES) than DCs stimulated with Ec LPS.
Conclusion:  These results indicate that different TLR usage affects mature DC phenotype and function and is thus crucial to the regulation of immunity to the pathogen.     

Immature,but Not Mature,Dendritic Cells Are More Often Present in Aggressive Periodontitis Than Chronic Periodontitis: An Immunohistochemical Study

Background: Dendritic cells (DCs) form a key link between innate and adaptive immune responses. The aim of this study is to analyze presence and distribution of immature (im) and mature (m) DCs in gingival tissue samples obtained from patients diagnosed with aggressive periodontitis (AgP), chronic periodontitis (CP), and clinically healthy periodontium (control group). Methods: Gingival tissue samples obtained from patients with: 1) AgP (aged <35 years); 2) CP (aged ≥35 years); and 3) control group (aged >18 years) (n = 10 per group) were collected. Two‐way analysis of variance and posterior Fisher least significant difference test were used to observe differences between the means of cells positively marked for imDC (S100, CD1a, and CD207) and mDC (CD208) immunomarkers. Results: imDCs were more numerous in AgP than CP and control groups, being statistically significant only for S100+ cells. Conversely, mDCs were visualized in higher numbers in CP than AgP and control groups (both P <0.05). Considering frequency of immunostained cells, the number of S100+ cells was greater than CD207+ and CD1a+ cells, followed by a lesser number of CD208+ cells, in all groups. Conclusions: Considering that the ability of DCs to regulate immunity is dependent on DC maturation, results suggest that predominance of imDCs appears to be involved in AgP pathogenesis, probably due to lack of ability to induce immune cell activation. Further studies are necessary to elucidate the role of DC maturation in regulating immune responses in periodontal disease.