人外周血中树突状细胞的诱导、培养及其表面标记的初步研究

目的：在人外周血中有效地诱导，培养树突状细胞（dendritic cells,DC)并鉴定其表面分子的表达，方法：采用密度梯度离心的方法分离人外周血中的单个核细胞，在6孔板上贴壁2h，然后吸去悬浮细胞，用粒细胞－巨噬细胞集落群体刺激因子（GM－CSF）、白细胞介素－4（IL－4）、肿瘤坏死因子－α（TNF-α）细胞因子组合，刺激树突状细胞（DC）增殖，分化。用标有荧光素的单抗标记培养细胞，在激光共聚共焦显微镜下拍摄标记有荧光素的细胞，在流式细胞仪上分析所培养的细胞。结果：该细胞直径在10－20μm，培养14天后，CD1a^ 48%,CD83^ 97%,CD40^ 33%，人体主要组织相容性复合物（MHC）Ⅱ^ 95%,CD80^ 98%,CD86^ 93%,CD83是DC的成熟标记。结论：该方法是一种可靠的诱导和培养DC的方法，对于乳腺癌患者还可通过动员等措施进一步提高DC的分离率。     

人外周血树突状细胞的诱导、培养及其表面标记的鉴定

0引言 树突状细胞（dendritie cells,DC）的特点及功能是目前肿瘤免疫研究的热点,本研究将在DC的培养及其表面标记等方面做进一步的探讨,为DC的进一步研究奠定基础。     

人外周血中树突状细胞的诱导及鉴定

目的：从健康人外周血诱导高纯度树突状细胞（dendritic cell,DC)方法：用贴壁法从健康人外周血获取单核细胞，对传统的诱导方法加以改进，经GM－CSF（100ng/ml)和IL－4（500U/ml)持续诱导7天，在此期间不再补充新的细胞因子，新鲜培养基和促成熟因子，以获取高纯度DC，结果：经上述方法处理后，从健康人外周血中诱导出了大量高纯度DC，其能高表达HLA－I，Ⅱ类分子，共刺激分子和粘附分子，显示出成熟DC的特征，这些DC能强烈诱导同种体淋巴细胞的增殖，其内吞能力在第3天达最高，之后明显下降，结论：本研究所建立的从外周血获取大量成熟DC的方法经济，简便，为DC的深入研究和临床应用奠定了基础。     

人外周血中树突状细胞的诱导及鉴定

目的　从健康人外周血中诱导高纯度树突状细胞 (dendritic cell,DC)。方法　用贴壁法从健康人外周血获取单核细胞 ,对传统的诱导方法加以改进 ,经 GM- CSF(10 0 ng/ ml)和 IL- 4(5 0 0 U/ m l)持续诱导 7天 ,在此期间不再补充新的细胞因子、新鲜培养基和促成熟因子 ,以获取高纯度 DC。结果　经上述方法处理后 ,从健康人外周血中诱导出了大量高纯度 DC,其能高表达 HL A- 、 类分子、共刺激分子和粘附分子 ,显示出成熟 DC的特征。这些 DC能强烈诱导同种异体淋巴细胞的增埴 ,其内吞能力在第 3天达最高 ,之后明显下降。结论　本研究所建立的从外周血获取大量成熟 DC的方法经济、简便 ,为 DC的深入研究和临床应用奠定了基础     

健康人外周血树突状细胞诱导培养及鉴定

[目的]从健康人外周血中分离出单个核细胞(PBMC),经体外诱导培养获取树突状细胞(DC)并鉴定其表型.[方法]应用GM-CSF、IL-4、TNF-α等细胞因子自外周血单个核细胞诱导扩增,培养出DC,动态观察细胞形态,流式细胞仪检测其表面标志,采用混合淋巴细胞培养法检测其刺激同种异体淋巴细胞增殖能力.[结果]经诱导培养出具有典型特征的DC,高表达CD86、CD80,DC特征性标志CD1a平均为49.28%,在体外能诱导强烈的同种异体混合淋巴细胞增殖反应.[结论]该方法能可靠地诱导培养出DC,为DC的进一步研究提供实验依据.     

人外周血来源树突状细胞诱导培养及鉴定的实验研究

目的探讨树突状细胞(DC)体外培养的方法。方法用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素4、重组人肿瘤坏死因子α等细胞因子自外周血单个核细胞诱导分离DC,流式细胞仪检测其表面标志,四氮唑蓝法测定其刺激同种异体淋巴细胞增殖能力。结果体外培养第10天,大量细胞出现典型的树突状形态;流式细胞仪检测高表达CD80、CD86、CD83、CD40、CD1a、人白细胞DR抗原;在体外能强烈刺激同种异体混合淋巴细胞增殖反应。结论该方法可获得较高纯度典型的DC,为DC的临床免疫治疗提供实验依据。     

rhGM-CSF联合rhIL-4诱导慢性粒细胞白血病细胞来源的树突状细胞

目的 用rhGM-CSF联合rhIL－4将慢性粒细胞白血病（CML）原代细胞诱导成树突状细胞（DC），探索白血病免疫治疗的新途径。方法 分离初诊CML患者外周血单个核细胞（PBMNC），用rhGM-CSF联合rhIL－4共同培养7d；流式细胞仪（FACS）检测细胞因子诱导前后细胞表面HLA－DR、CD1a、CD80和D86的表达，电镜观察细胞形态。结果 经7d的诱导，HLA－DR、CD1a、CD80和CD86的表达明显上调；电镜观察到典型的DC 形态特征。结论 rhGM-CSF联合rhIL－4可成功将CML原代细胞诱导成CML－DC，可望用于CML的免疫治疗。     

宫颈癌患者外周血来源的树突状细胞的生物学特性观察

【目的】探讨宫颈癌患者外周血来源的树突状细胞(DC)的生物学特性。【方法】14例Ib期及以上的宫颈癌患者为研究组,24例健康女性为对照组。外周血经密度梯度离心得到单个核细胞,其中附壁成分在含GM-CSF/IL-4的完全淋巴细胞培养液培养。光镜和电镜观察培养细胞的形态变化。培养7d后,计算树突状细胞的产量,流式细胞术分析HLA-ABC、HLA-DR、CD40、CD80、CD1a和CD14的表达,同种异体淋巴细胞的混合淋巴反应(MLR)检测树突状细胞刺激淋巴细胞增殖能力。【结果】经过7d培养,两组均诱导出典型形态和表型的DC。宫颈癌患者单位体积外周血的未成熟DC(ImDC)的产量为67.3×106±33.8×106,较对照组低(P<0.05)。研究组的CD40、CD80和CD1a的平均荧光强度(MFI)分别为18±9,15±6和71±11,均较对照组低(P<0.05);而两组ImDC的HLA-ABC、HLA-DR表达强度相似(P>0.05)。相同PBL/DC比值,研究组ImDC刺激同种异体淋巴细胞增殖能力下降(P<0.05)。【结论】宫颈癌患者的外周血单个核细胞培养的树突状细胞(ImDC)和健康对照组的ImDC具有免疫学差异,提示在应用树突状细胞进行免疫治疗时应考虑这种差异。     

人源重组ICOSIg对鼠不成熟树突状细胞的生物学作用

目的分析人源可诱导共刺激分子(ICOS)可溶性融合蛋白(ICOSIg)与鼠源不成熟树突状细胞(DCs)是否发生特异性结合及其一般生物学特性。方法通过流式细胞术结合特异性抗体检测了解ICOSIg与不成熟DCs的结合作用;以AnnexinⅤ/PI双染色、活细胞染料CSFE和CCK-8研究ICOSIg对DCs的细胞毒性作用;以[3 H]掺入法研究ICOSIg对于混合淋巴细胞反应的阻断作用。结果 ICOSIg可结合小鼠DCs表面的ICOSL,ICOSIg不引起DCs早期和晚期凋亡,不影响DCs细胞的增殖,可以抑制不同基因小鼠脾细胞的混合淋巴细胞反应。结论本实验室构建的体外表达的ICOSIg具有较强的生物学活性,对鼠DCs无明显的生物学毒性作用,首次从实验角度证实人源ICOSIg可以特异性结合小鼠不成熟DCs表面配体ICOSL,可以用于进一步探讨ICOSL/ICOS共刺激通路的免疫作用。     

外周血造血干细胞体外定向诱导树突状细胞及功能鉴定

目的：以实体瘤患外周造血干细胞（PBSC）为来源，建立体外诱导扩增树突状细胞（DC）的方法，工进行表型鉴定及功能检测。方法：以血细胞分离机分离经动员的外周造血干细胞，加入rhGM-CSF,rhIL-4和nrhTfNF-α培养7－9d成为树突状细胞，进行细胞形态学、表型及刺激T细胞增殖能力分析。结果：PBSC经诱导培养后，倒置显微镜和电镜显示典型的树突状细胞形态和超微结构；流式细胞术分析显示细胞表面抗原高表达，其中CD1a 38.28%,CD11c 66.77%,共刺激分子CD80和CD86分别为51．05％，67．58％，MHCⅡ类分子HLA－DR为72．09％，为典型的DC表型特征，同种混合淋巴细胞反应结果显示DC具有高效的刺激T淋巴细胞活化增殖的能力。结论：实体瘤患PBSC可成功诱导为具有典型形态特征及功能的树突状细胞。     

钙离子载体联合GM．CSF体外诱导外周血单核细胞生成树突状细胞

目的：利用新型诱导剂钙离子载体A23187联合重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）体外诱导人外周血单核细胞（PBMC）生成树突状细胞（DCs）。方法：采用密度梯度离心法及黏附法分离出PBMC,按不同培养方法分成：传统方法组,rhGM-CSF＋重组人白介素-4（rhIL-4）＋重组人肿瘤坏死因子-α（rhTNF-α）;新型诱导剂组,加入rhGM—CSF4＋A23187。光镜观察细胞形态的变化,流式细胞仪检测DC细胞的表面标志,MTT比色法检测各组DCs刺激同种异体外周血T细胞增殖的能力。结果：与传统方法相比,A23187联合rhGM—CSF诱导培养的DCs更具有典型的树突形态;DC表面分子CD83D1a、CD86、CIM0表达（45．2％、31．5％、40．1％、36．4％）较传统方法组（16．9％、20．4％、26．5％、22．3％）明显上调（P〈0．05）,而CD14表达（5．7％vs19．0％）明显下降（P〈0．05）,刺激同种异体T细胞增殖的能力更强。结论：新型诱导剂钙离子载体A23187联合GM-CSF能更有效地诱导PBMC生成强效成熟的DCs。     

人外周血富集白细胞层来源的树突状细胞的培养与鉴定

目的 探讨从人外周血富集白细胞层(白膜)分离、培养树突状细胞(dendritic cell,DC)的方法.方法 用PBS液与白膜1∶1稀释,采用Ficoll淋巴细胞分离液对稀释后的白膜进行淋巴细胞分离,2h后弃悬浮细胞,加入重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素-4(rhIL-4)和DMEM完全培养液培养,体外培养第6天,加入肿瘤坏死因子(TNF-α)促进其分化成熟.用流式细胞仪(flow cytometer,FCM)检测细胞表型.在倒置显微镜下观察细胞形态.结果 显微镜下观察,细胞呈不规则形状,膜表面向外伸出许多树枝样细长突起;成熟DC细胞表面CD83、CD86、CD1a、HLA-DR分子表达明显增高;平均每份白膜(200mL全血)可以获得(3.87±0.31)×107个成熟DC.结论 作者建立了一种从白膜中分离、培养树突状细胞的方法,可获得数量较多、纯度较高的DC,为DC瘤苗的来源开创了一条新途径,并为血液的合理利用找到了一个新方式.     

哮喘患儿外周血树突状细胞共刺激分子表达研究

目的　探讨小儿哮喘发作时外周血树突状细胞 (DC)表面协同刺激分子CD4 0、CD80、CD86和HLA DR的表达 ,以及其激发同种异体T淋巴细胞和脐带血幼稚T淋巴细胞 (Na veTcells)的作用 ,为进一步研究小儿哮喘的发病机制及治疗提供新的思路。方法　以Thomas法分离、培养并诱导哮喘患儿和健康儿童外周血DC细胞 ,流式细胞仪 (fluorescentactivatedcellsorter,FACS)检测DC表面协同刺激分子CD4 0、CD80、CD86和HLA DR的表达 ,以及其激发同种异体T淋巴细胞和脐带血幼稚T淋巴细胞的作用。结果　哮喘患儿外周血DC表面CD86和HLA DR的表达较对照组明显升高 (t分别 =3 .3 0 4、9.4 81;P分别 <0 .0 1、0 .0 0 1) ,而CD4 0则显著降低 (t=5 .65 9,P <0 .0 0 1) ;其激发同种异体T淋巴细胞和脐带血幼稚T淋巴细胞的能力较对照组明显增强 (P <0 .0 1～ 0 .0 0 1)。结论　哮喘患儿可通过其DC表面差异表达CD4 0、CD86和HLA DR等协同刺激分子 ,从而使其激发T淋巴细胞的作用增强。所以DC在小儿哮喘发作时起重要作用。     

人脾脏树突状细胞的培养及鉴定

目的：探讨从手术切除脾脏分离、培养树突状细胞(dendritic cell,DC)的方法．方法：采用Ficoll淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞,4h后弃悬浮细胞,加入含rhGM—CSF和rhIL-4的RPMI-1640完全培养液,用流式细胞仪(flow cytometer,FCM)检测细胞表型．在光镜和电镜下观察细胞形态．结果：所获脾脏DC与献[1]报道的血液中DC有相同的表型特征．细胞表面CD80,CD83,CD1a,HLA—DR分子表达较高;扫描电镜观察发现,细胞呈不规则形状,膜表面向外伸出许多树枝样细长突起．结论：我们建立了一种从人脾脏中分离、培养树突状细胞的方法,可从脾脏中获得数量较多、纯度较高的DC．为人脾脏DC的研究提供了实用的技术方法,为进一步研究人脾脏DC的功能奠定了基础,同时为DC瘤苗的来源开创了一条新途径．     

人外周血来源的树突状细胞的体外诱导培养

目的：从健康人外周血中诱导高纯度树突状细胞(DC)。方法：将外周血单个核细胞用贴壁法分离出单核细胞,经多细胞因子联合诱导出DC。结果：培养8～9d后即可获得大量高纯度的成熟DC,经流式细胞仪检测,所得细胞中高表达共刺激分子和粘附分子,表现为成熟DC的特征。结论：利用多细胞因子组合可从外周血诱导大量成熟DC,为DC的临床应用提供依据。     

人外周血来源的成熟树突状细胞的体外无血清培养

目的探讨无血清条件下健康人外周血单个核细胞（PBMC）快速诱导生成成熟树突状细胞（dendritic cell,DC）的体外培养方法。方法分离获取健康者外周血PBMC,将细胞分为血清组和无血清组：设血清组A组为对照组,B、C、D组为无血清组。A组加入10%FCS的RPMI1640完全培养液,B组加入单核/巨噬细胞无血清培养液MΦ-SFM,两组均加入rhGM-CSF＋IL-4＋rhTNF-α培养9d;C组加入钙离子载体（CI）A23187,D组加入rhGM-CSF＋A23187,两组细胞均培养于MΦ-SFM中48h。于倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞术分析细胞表型,MTT比色法检测各组细胞刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结果在无血清条件下,单独给予A23187或A23187＋rhGM-CSF联合刺激48h,均可诱导PBMC分化成具有典型形态的DC;与血清组细胞相比,细胞表面标志CD80、CD86和CD83分子具有相似的高表达（P〉0.05）,对同种异体T淋巴细胞的刺激能力无显著性差异（P〉0.05）。结论在无血清培养条件下配合使用钙离子载体A23187,可以更快速、有效地诱导健康人PBMC分化成更成熟、功能更强的DC。     

正常人脾脏树突状细胞的分布及形态学观察

目的 认识不同表面分子标记物所标记的脾脏树突状细胞(dendritic cell,DC)分布、成熟程度与超微结构特点.方法 运用光镜、电镜观察与免疫组化标记(CD11c、CD205、CD209、S-100、CD1a、HLA-DR、CDS0及CD86)方法观察35例正常人脾脏组织中的树突状细胞的形态分布及超微结构特点.结果 正常人脾脏树突状细胞主要分布在白髓边缘区和T细胞区,CD11c、CD205和CD209是目前较特异的树突状细胞标志物,标记阳性率分别为4.19%、3.96%和3.02%,其中CD209+DC分布更靠近红髓.树突状细胞表达共刺激分子CD80与CD86的阳性率分别为2.68%和2.02%,主要分布在T细胞区.树突状细胞超微结构特点为细胞体积较大,呈细长状或不规则形,表面可见数个突起向周围细胞间隙延伸;胞核形状不规则,表面有凹陷,可见核仁;胞浆致密或呈低电子密度,细胞器欠发达.结论 正常人脾脏中不同表面分子阳性树突状细胞的比率和分布有所不同,其中大部分为不成熟的树突状细胞,具有活性的成熟树突状细胞数目较少.     

动员人外周造血祖细胞定向诱导树突状细胞

目的 探讨由动员人外周造血祖细胞体外培养扩增获得的树突状细胞（DC）的生物学特性, 为临床应用肿瘤树突状细胞疫苗建立制备方法。方法 用CS-3000血细胞分离机分离预经干细胞动员的患者外周血单个核细胞（PBMC）,去除淋巴细胞和单核细胞,阴性选择得到外周造血祖细胞,加入rhGM-CSF和rhIL-4培养10~14 d成为树突状细胞,然后进行形态学检测、细胞表型和T细胞刺激能力分析。结果 由外周造血祖细胞来源的树突状细胞可以达到(0.5~1.0)×108数量级;高倍镜和电镜照片显示典型的树突状细胞形态和超微结构;流式细胞仪分析显示细胞高表达HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原和共刺激分子CD80、CD86;同种混合淋巴细胞反应显示细胞具有高效的刺激静止T淋巴细胞活化增殖的能力。结论 用血细胞分离机分离动员外周造血祖细胞体外定向诱导制备树突状细胞可以作为制备肿瘤疫苗的新途径。     

胃癌患者外周血树突状细胞的分离与培养

目的探讨从胃癌患者外周血分离与扩增树突状细胞（dendritic cells,DCs）的有效方法。方法从胃癌患者外周血分离出贴壁单个核细胞,实验组将其与细胞因子GM—CSF、IL-4和TNF—α共同培养,对照组不加细胞因子,动态观察细胞生长情况,流式细胞仪检测实验组不同培养时相细胞表面分子CD86、CD80、HLA-DR的表达水平,并和对照组比较。结果与对照组比,实验组诱导出大量具有典型形态的DCs,培养至第7天,胃癌患者外周血DCs细胞表型表达较第3天增高非常显著（P〈0．01）,与对照组相差显著（P〈0．01）;培养第12天,DCs细胞表型表达与第3天比较相差非常显著（P〈0．01）,与培养第7天比较相差不显著（P〉0．05）,与对照组相差显著（P〈0.01）。结论联合应用GM-CSF、IL-4和TNF-α能有效的从胃癌患者外周培养出大量具有活性的DCs。