固态发酵贵州绿僵菌产壳聚糖酶的亲和层析纯化及其性质研究

目的 寻找壳聚糖酶新酶源并简化壳聚糖酶纯化工艺.方法 将贵州绿僵菌固态发酵物粗提液经交联壳聚糖树脂层析,以5‰Cu2 洗脱,洗脱液透析浓缩后经Superdex75层析.结果 该菌株在发酵120 h时,每克干培养基酶活力可达(83.09±2.9) U.经亲和层析和分子筛分离可获得电泳纯的壳聚糖酶,酶活力回收率为43.52%.每克干培养基可获壳聚糖酶328 μg,比活达106.39 U/mg.酶蛋白相对分子质量为50.3×103.结论 固态发酵贵州绿僵菌生产壳聚糖酶可作为壳聚糖酶的新酶源.用交联壳聚糖树脂亲和层析、Cu2 洗脱和分子筛分离的方法可以纯化壳聚糖酶.     

重组L-门冬酰胺酶的提取纯化工艺

采用渗透振扰破壁法、硫酸铵分级沉淀、乙醇分级沉淀、DEAE-纤维素层析等步骤提取和纯化重组L-门冬酰胺酶,并优化了提纯过程的条件,提取总回收率高于50%,产品纯度经高效毛细管电泳检测为单一峰,具有工业生产前景重组L-门冬酰胺酶的提取纯化工艺@吴敬@赖龙生@刘景晶     

青霉素酰化酶研究——Ⅰ.抑制作用,纯化和性质

丙酮、乙醇和苯丙氨酸是大肠杆菌青霉素酰化酶的竞争性抑制剂,分别抑制模拟底物3-苯乙酰胺基6-硝基苯甲酸水解的活力。青霉素酰化酶粗酶液经硫酸铵盐析,pH5沉淀,SE-Sephadex C50层析,苯丙氨酸-Sepharose 4B疏水层析和DEAE-Sephadex A25层析可得纯酶,聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳呈现一条带,比活为27.5u/mg蛋白。纯化总活力回收率为28.1%。青霉素酰化酶分子量约为90000,有两个亚基,分子量分别为70000和20000,其最适温度为40℃,最适pH为8.0,催化青霉素G水解的米氏常数为2.94mmol/L。     

一种膜荚黄芪凝集素的分离纯化研究

目的 从膜荚黄芪根中分离纯化一种凝集素。 方法 通过硫酸铵分级沉淀和ConASepharose 4B亲和色谱从膜荚黄芪根浸提液中分离纯化一种凝集素。 结果 经过上述两步纯化得到电泳纯的凝集素, SDSPAGE和Superdex 75凝胶过滤色谱测定该凝集素的相对分子质量分别为315×104和335×104,糖蛋白染色显示其为糖蛋白,总糖的量为10.7%。结论 从膜荚黄芪根中分离纯化得到一种凝集素,该蛋白为单亚基糖蛋白,具有对兔血红细胞的凝集活性,凝集活性的比活力为391.9 U/mg。     

中压液相层析法纯化人血清载脂蛋白AⅠ和AⅡ的研究

目的 建立中压液相层析分离法纯化人HDL主要载脂蛋白AⅠ、AⅡ等的方法。方法 以人血清高密度脂蛋白制品为原料，经一次性密度梯度超离心法纯化HDL，去脂HDL经中压Sephacryl S-200柱层析获apoE、AⅠ、AⅡ及Cs粗品。用Sephadex G-75柱层析分离apoAⅠ及AⅡ。结果 纯化的载脂蛋白apoAI及AⅡ经免疫和SDS-PAGE鉴定为免疫纯及电泳纯。结论 建立了一种可大量、快速、高分辨分离纯化载脂蛋白apoAⅠ及AⅡ的方法，为今后载脂蛋白和脂蛋白的基础和临床研究提供必要的实验材料。     

母婴ABO血型不合母体高效价IgG的低温分离与纯化

目的 分离和纯化母婴血型不合母体的特异性高效价的IgG抗体。方法 采用半饱和硫酸铵低温沉淀法分离IgG抗体，SephedexA50层析柱纯化，然后用B型红细胞(RBC)吸收放散IgG，用聚乙二醇(PEG)沉淀，真空泵脱水回收IgO。结果 200ml血浆经半饱和硫酸铵低温沉淀后得IgG粗制品2．26g，Sephedex A50层析柱纯化后得纯制品1．84g，经B型RBC吸收放散后得特异性IgG 0．55g，回收率达29．89％(0．55／1．84)。结论 采用半饱和硫酸铵低温沉淀法分离高效价IgG抗体，可以获得高纯度的IgG。     

虎血清免疫球蛋白(IgG)的纯化及纯度、活性鉴定

目的建立高纯度、高活性的虎血清IgG纯化方法。方法用饱和硫酸铵沉淀虎血清得到IgG粗品;结合Hitrap Protein A亲和层析预装柱及阴离子交换层析法对粗品IgG进一步分离纯化,采用PAGE电泳和Western-Blot免疫印迹法鉴定IgG纯度和免疫活性。结果80 mL虎血清亲和纯化得到84 mg IgG,阴离子交换层析纯化得到30 mg虎的IgG纯品。结论建立了简便快速、纯度高、活性好的虎血清IgG的分离纯化方法,为虎血清IgG二级抗体的制备提供了高纯度、活性好的一级抗体免疫原。     

阴沟肠杆菌Ampc酶的分离纯化

目的：分离纯化Ampc酶并对酶的理化特性进行相关研究。方法：运用离子层析等技术对酶分离纯化；运用电泳等技术研究理化特性。结果：获得纯品酶并证实为Ampc酶。结论：本实验所采用的分离纯化技术可获得纯品Ampc酶。     

海螵蛸多糖的提取分离及活性组分CPS-1的纯化

目的:从海洋中草药海螵蛸(乌贼骨)中提取分离得到多糖活性物质.对粗多糖中主要的活性组分CPS-1进行纯化,得到成分相对均一的天然活性多糖.方法:用热水抽提法提取海螵蛸多糖粗品,并对提取工艺进行正交设计,优化提取方法.对粗品组分进行总糖量测定.用DEAE-Sepharose F.F柱及Sepharose CL-6B柱对海螵蛸多糖粗品进行分离.通过活性检测实验确定活性部分.最后使用Sephacryl S-300柱进一步纯化.用HPLC来检测精品多糖的纯度.标准曲线法测定相对分子质量.结果:成功得到海螵蛸粗多糖.经过离子交换柱DEAE-Sepharose Fast Flow和Sepharose CL-6B柱及分子筛Sephacryl S-300柱的进一步分离纯化和活性跟踪,最后得到相对均一的活性精品多糖CPS-1,其含糖量达93.6%,相对分子质量为1×106.结论:不同的提取条件影响海螵蛸多糖的得率.不同性质的分离材料能够将相对分子质量及电荷有差异的多糖分离,达到分离的目的.精品多糖CPS-1是从海洋中草药海螵蛸中得到的均一多糖组分.     

鼠肾和人肝癌组织中GGT的分离纯化和鉴定

鼠肾（或人肝癌）组织经匀浆，超速离心．ＴｒｉｔｏｎＸ－１００取。硫酸按沉淀，脱氧胆酸钠处理。硫酸铵沉淀，木瓜酶处理后再经硫酸铵沉淀。经ＤＥＡＥ－Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ５２离子交换柱层析，ＳｅＰ。ｈａｄｅｘＧ２００凝胶柱层析，最后获得ＧＧＴ的纯制备物，比活性分别为４１７ｕ／ｍｇ（鼠肯）和１５．１ｕ／ｍｇ（人肝癌组织）。经鉴定达到了电泳纯的均质化程度。该纯化程序较其它方法简便、价廉，一般实验室均能开展，可用于哺乳动物组织中ＧＧＴ的分离纯化，特别是分离提纯原发性肝癌组织中的ＧＧＴ。     

D-氨基酸氧化酶在毕赤酵母中的表达及快速纯化

目的建立简便、快速纯化D-氨基酸氧化酶（DAAO）的新方法，以利用高纯度的DAAO转化头孢菌素C制备戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸（GL-7ACA）。方法通过基因工程手段，构建N端和C端各镶嵌6个组氨酸的DAAO重组质粒，电转化Pichia pastoris GS115电感受态细胞，利用PCR方法筛选阳性转化子，再经甲醇诱导筛选出高表达菌。结果高表达重组菌（PHD12）摇瓶发酵单位达到2000IU／L，发酵罐内达到22500IU／L。并利用Ni螯合型树脂对表达的DAAO经一步分离纯化，以60％的总收率获得纯化产物。纯化产物保持良好的转化CPC-Na活性。结论利用基因工程表达组氨酸标记蛋白，可简化基因工程的下游工序。     

不同构建策略对D-氨基酸氧化酶表达的影响及发酵调节

目的 构建不含编码β-内酰胺酶编码基因的D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAAO)工程菌,对不同构建策略构建的重组菌进行发酵调节研究.方法 采用分子生物学手段,利用不同的策略、不同的毕赤酵母宿主菌,构建DAAO工程菌;利用微生物发酵和调节手段,对工程菌的发酵条件进行优化.结果 获得了表型不同的3株重组菌(Muts的PDK13和PDGA10,Mut 的PDG27),它们的最佳生长条件基本相似,诱导表达条件却不相同,在Basal salts培养基内,当生长时间为36 h,诱导培养基起始pH为6.0、甲醇浓度为0.5%时,最有利于DAAO表达.在菌体密度相同的条件下,Mut 表型(PDG27)甲醇代谢快,诱导24 h,DAAO活力达到最高;Muts型(PDK13和PDGA10)甲醇代谢慢,诱导36 h,DAAO活力达最高;通气量一定时,菌体密度增加,DAAO表达量增加,菌体增加到一定程度表达量反而下降,表明通气量应随菌体密度的增大而增加.结论 Muts型重组菌对通气量要求低且更有利于高密度发酵.     

乙型脑炎病毒E蛋白毕赤酵母表达系统的构建

目的：构建乙型脑炎病毒E基因毕赤酵母表达系统。方泼：应用RT-PCR法扩增乙型脑炎病毒E蛋白表达基因,定向克隆入载体pPICZαA,将重组质粒以PineⅠ线性化并电转化入毕赤酵母GS115感受态细胞,用Zeocin筛选转化子进行鉴定。结果：PCR扩增产物约为1350bp,定向克隆获得pPICZαA-E表达载体,经测序结果与Genbank相应序列比较,核苷酸序列同源性为100％,电转化得到巴氏毕赤酵母重组菌株GS115-E,提取其基因组DNA经PCR鉴定与预期相符。结论：成功构建乙型脑炎病毒E基因毕赤酵母表达系统,为进一步进行E蛋白真核表达研究奠定基础。     

人源极光激酶A在毕赤酵母和MCF-7细胞中的表达及纯化

目的：构建人源极光激酶A（AURKA）真核表达载体,检测其在毕赤酵母X33和MCF-7细胞中的表达及纯化。方法：将双酶切PCR扩增的目的基因与真核表达载体连接,构建重组质粒。电转法转染重组质粒,筛选后采用SDS-PAGE和Western blotting法检测AURKA蛋白的表达,Ni-NTA柱法纯化表达的蛋白;放射自显影法检测AURKA的生物活性;细胞计数法检测转染重组质粒后MCF-7细胞增殖情况。结果：2种重组质粒经PCR均扩增出1212 bp目的基因,表明真核表达载体构建成功。重组AURKA蛋白相对分子质量约为50000,且可磷酸化其底物组蛋白H3,表明重组AURKA具有活性。与转染空质粒和野生型MCF-7细胞比较,转染AURKA 24 和48 h后MCF-7活细胞数量明显增加。结论：AURKA在毕赤酵母和MCF-7细胞中成功表达和纯化,且其过表达可促进细胞增殖。     

重组人可溶性凋亡素-2配体在Pichia系统中的表达

目的：在甲醇营养型酵母（Pichia)表达系统中表达重组人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL,凋亡素－2配体）分子。方法：人可溶性TRAIL编码基因片段插入pIC3.5酵母表达载体,氯化锂转化酵母GS115株,甲醇诱导表达5d,SDS－PAGE和Western-blotting确认表达,L929细胞鉴定活性,结果：发现在酵母细胞中重组表达的TRAIL在SDS－PAGE上占总蛋白的50％以上,用抗人TRAIL多抗可以确认表达了TRAIL重组分子,杀伤肿瘤细胞的比活性较原核表达后复性的TRAIL有明显提高,并能诱导几株肿瘤细胞DNA片段化,说明TRAIL可能已正确折叠并形成活性必需的高级结构。结论：在Pichia系统中正确表达了可溶性TRAIL分子。     

LZ-8基因克隆及其在毕赤酵母中的诱导表达

【目的】从灵芝中克隆LZ-8基因并在毕赤酵母表达系统中诱导表达LZ-8蛋白。【方法】采用聚合酶链反应(PCR)法从赤灵芝的基因组DNA中扩增LZ-8基因序列,采用电激转化法将pPLZ8-X重组质粒转化到毕赤酵母中,PCR Southernblot法检测酵母是否转化LZ-8基因,十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并银染法观察蛋白在酵母中的差异表达。【结果】PCR Southern blot结果显示LZ-8基因已转化到酵母中;SDS-PAGE胶银染结果提示LZ-8蛋白在酵母中被诱导表达。【结论】免疫调节蛋白基因LZ-8在毕赤酵母表达系统获得了诱导表达。     

东海贻贝抗菌肽Myticin A基因的克隆表达及其生物学活性

目的:在毕赤酵母表达系统中表达贻贝抗菌肽Myticin A并检测其生物学活性.方法:提取贻贝总mRNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增得到DNA片段.PCR产物与pMD18-T连接,得到阳性重组载体pMD18-Myticin A.Myticin A基因插入载体pPIC9K中,得到的重组载体pPIC9K-Myticin A转化至宿主菌中.得到高抗性阳性菌株并进行诱导表达.发酵上清进行Tricine-SDS-PAGE分析并用CM-sepharose柱和Sephadex G-25柱纯化,Western印迹法鉴定并检测生物学活性.结果:获得重组载体pPIC9K-Myticin A.高抗性多拷贝阳性表达菌株GS115/pPIC9K-Myticin A经甲醇诱导后,Tricine-SDS-PAGE证实其相对分子质量为4 500,表达量为14%以上,纯化后纯度达到90%以上.Western印迹法证实所表达样品为Myticin A.表达样品对巨大芽胞杆菌的生长有抑制作用,对小鼠成纤维细胞(L929)、胰腺癌细胞(SW1990)、结肠腺癌细胞(LoVo)的生长均有明显抑制作用.结论:应用毕赤酵母表达系统能较好地表达抗菌肽Myticin A,生物学活性研究证实其具有抗革兰阳性菌作用,明显抑制肿瘤细胞生长.     

人Endostatin在毕赤酵母菌中的表达及其抑癌活性研究

目的在毕赤酵母中获得有活性的分泌型重组Endostatin.方法一步法抽提胎肝总RNA,RT-PCR扩增endostatin全基因.用T-A克隆技术构建克隆载体;双酶切回收550bp的endostatin基因,亚克隆入酵母表达载体.重组质粒分别以PCR、酶切及测序鉴定.电转化法将线形化的重组表达DNA转导入GS¨5感受态细胞,SDS-PAGE电泳筛选阳性重组子,G25及Heprin亲和层析柱初步纯化重组蛋白.MTT法测定重组endosatatin对血管内皮细胞增殖的抑制作用.结果RT-PCR获得550bp的特异扩增条带,T-A克隆后,PCR挑选阳性重组子,测序证实序列正确;亚克隆后的表达载体,PCR可得550bp的特异条带,EcoRI、Not I双酶切获得550bp和3kb的条带,与预期一致,DNA测序证明核苷酸序列100%正确.SDSPAGE证实重组菌较空白有一明显条带,Heparin亲和层析后,1mol/INaCl洗脱的蛋白峰在体外可特异性抑制血管内皮细胞的增殖.结论在毕赤酵母菌中成功地获得了分泌表达的活性endostatin蛋白.     

人血管内皮生长因子受体2胞外段在毕赤氏巴斯德酵母中的表达

目的探讨在毕赤氏巴斯德酵母（Pichia pastoris）中高效表达有真核蛋白结构的人血管内皮生长因子受体2胞外段（heVEGFR-2）的可行性。方法从重组质粒pORF-heVEGFR-2经PCR获全长heVEGFR-2 DNA,构建重组毕赤氏巴斯德酵母分泌性表达载体,电转化Pichia pastoris X-33。用抗药性表型和甲醇诱导筛选出重组heVEGFR-2蛋白表达阳性的转化子（X-33-heVEGFR-2）。结果SDS-PAGE显示,获分子量约108kDa的重组heVEGFR-2蛋白,约占X-33-heVEGFR-2分泌性表达蛋白总量的45％。该重组蛋白在表达上清中的质量浓度达80mg／L。其heVEGFR-2部分分子量约106kDa。Western blot证实,该蛋白能特异地与大鼠抗小鼠VEGFR-2单克隆抗体结合。结论毕赤氏巴斯德酵母能高效表达有真核蛋白结构的人血管内皮生长因子受体2胞外段蛋白全段。     

戊型肝炎病毒 ORF2截短蛋白 p154在毕赤酵母中的分泌性表达及其抗原性

目的：利用毕赤酵母系统表达戊型肝炎病毒（HEV）ORF2编码蛋白第452～605氨基酸多肽（p154）,探讨毕赤酵母表达系统用于研发戊型肝炎基因工程疫苗的可能性。方法：采集戊型肝炎患者粪便,进行RT-PCR检测和测序鉴定,并依此为模板扩增ORF2 p154基因,克隆到表达载体pPICZαA上,电转化入毕赤酵母宿主菌GS115,经筛选鉴定后将携带目的基因的重组克隆菌进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析。结果：利用基因重组技术构建了含HEV p154片段的pPICZαA重组质粒,并在毕赤酵母菌株GS115中实现了分泌性表达,表达的目的蛋白p154分子质量约为22 kDa,上清中p154表达量可达到200μg· ml -1。 p154可与HEV感染兔恢复期血清及HEV单克隆抗体6F9进行反应,表明酵母表达的p154具有良好的抗原性。结论：HEV ORF2 p154在毕赤酵母表达系统中得到了成功表达,为进一步研发真核表达的戊型肝炎基因工程疫苗奠定了实验基础。