人oGPCRs与Gi1α的基因融合及其在昆虫细胞Sf9的表达

目的获得人孤儿G蛋白偶联受体（oGPCR）与G蛋白α亚基（Gi1α）的融合基因及其表达蛋白。方法采用RT-PCR法,从人HepG2细胞扩增oGPCR成员GPR45,GPR85,GPR174和Gi1α的完整表达序列,运用重叠延伸PCR法扩增得到人oGPCR成员GPR45,GPR85,GPR174分别与Gi1α的融合基因,将各融合基因与供体质粒pFASTBac1重组,而后分别转化DH10Bac菌株获得杆状病毒穿梭杆粒,制备重组杆状病毒并感染Sf9细胞,收获融合蛋白,经Western印迹鉴定。结果得到了上述oGPCR成员的融合基因oGPCRs-Gi1α,并使之在昆虫细胞成功表达,制备了足量的oGPCRs-Gi1α融合蛋白。结论oGPCR可与Gi1α成功融合,昆虫细胞表达体系是制备融合蛋白的理想手段,为今后深入开展oGPCRs的相关研究提供了保障。     

sTNFR1在昆虫细胞中的表达及鉴定

目的 :研究可溶性肿瘤坏死因子受体 (solubleTNFαreceptor1,sTNFR1)在昆虫细胞中的表达。方法 :应用BAC_TO_BAC杆状病毒表达系统 ,构建含有sTNFR1基因的杆状病毒穿梭载体Bacmid ,转染sf2 1昆虫细胞进行高效表达 ,利用TALON金属鏊合层析进行重组蛋白的纯化。免疫印迹和细胞测活方法鉴定重组sTNFR1的生物学活性。结果 :从无血清培养上清中可纯化得到约 3mg L的重组蛋白。免疫印迹反应和细胞活性实验表明 ,重组蛋白具有良好的抗原结合能力和抑制TNF对L92 9细胞的细胞毒作用。结论 :重组sTNFR1在昆虫细胞中表达稳定 ,易于纯化 ,并具有良好的生物学活性     

杆状病毒介导NIS基因放射治疗甲状腺癌的实验研究

目的探讨重组钠／碘同向转运体(NIS)基因杆状病毒介导甲状腺癌细胞放射性碘治疗的可行性。方法构建杆状病毒载体质粒(pFBNIS)并制备重组NIS杆状病毒(BacNIS)，体外感染甲状腺癌细胞，通过免疫荧光检测NIS蛋白的表达，通过动态摄碘及NaC104摄碘抑制实验观察表达蛋白的功能和特性；进行^131I杀伤细胞的克隆形成实验。结果成功构建了重组NIS杆状病毒，受巨细胞病毒(CMV)极早期基因启动子调控；BacNIS体外感染的甲状腺癌细胞表达的NIS蛋白具有摄碘功能和NaC104抑制的特性；BacNIs感染的肿瘤细胞可被^131I有效杀伤。结论BacNIS是介导肿瘤细胞摄碘的有效方法，为杆状病毒介导NIS基因治疗失分化甲状腺癌转移灶提供依据。     

HMGB1促进人骨髓间充质干细胞迁移的实验研究

目的：构建人高迁移率族蛋白（HMGB1）全长编码基因的原核表达载体，诱导和纯化重组蛋白，分析其对人骨髓间充质干细胞的迁移作用。方法：RT—PCR方法从人的单个核细胞中扩增出HMGB1全长编码基因，克隆于原核表达载体pET-24a—d（＋），经IPTG诱导表达，通过亲和层析方法纯化得到携带（His）。标签的HMGB1融合蛋白；RT—PCR方法检测间充质干细胞HMGB1受体的表达；观察HMGB1对人骨髓来源间充质干细胞的迁移作用。结果：构建了融合蛋白HMGB1的原核表达载体，获得了高度纯化的HMGB1融合蛋白。RT-PCR方法检测到间充质干细胞表达HMGB1的某些受体如RAGE和TLR-4。HMGB1在体外能够诱导人骨髓来源的间充质干细胞的迁移。结论：重组HMGB1蛋白能够诱导骨髓间充质干细胞的迁移，此作用有可能通过RAGE和（或）TLR-4介导。     

人凝血因子Ⅶ重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建表达人凝血因子Ⅶ（FⅦ）的重组腺病毒载体,利用腺病毒载体介导哺乳动物细胞表达重组人凝血因子Ⅶ（rhFⅦ）。方法利用BamHⅠ和EcoR Ⅴ双酶切pcDNA 3．1－FⅦ载体得到FⅦ基因片段,补平后,插入经SalⅠ单酶切、补平并去磷酸化处理的加强型绿色荧光蛋白（ GFP）表达盒的pAdTrack－CMV腺病毒穿梭载体,构建pAdTrack－CMV－FⅦ,继而进行酶切和测序鉴定;经PmeⅠ单酶切线性化后,pAdTrack－CMV－FⅦ在BJ5183感受态菌内与pAdEasy－1腺病毒骨架发生同源重组,构建重组表达FⅦ的腺病毒质粒pAd－FⅦ;经PacⅠ酶切后的pAd－FⅦ,使用PEI试剂转染293 A细胞,包装表达FⅦ的重组腺病毒Ad－FⅦ;利用Western 印迹检测重组腺病毒Ad－FⅦ介导293 A细胞表达FⅦ的蛋白水平;通过观察EGFP的表达来判断质粒转染及病毒感染细胞的效率。结果经酶切和测序鉴定,FⅦ克隆到pAdTrack－CMV腺病毒穿梭载体中,获得重组质粒pAdTrack－CMV－FⅦ;将其与pAdEasy－1在细菌内发生同源重组,成功获得FⅦ重组腺病毒质粒pAd－FⅦ;在293A细胞内包装重组腺病毒,Western印迹检测到FⅦ蛋白的表达。结论成功构建重组腺病毒Ad－FⅦ,并实现了rhFⅦ在哺乳动物细胞中的表达,为利用哺乳动物细胞表达rhFⅦ的研究奠定了基础。     

铜绿假单胞菌外毒素A表达载体的构建及可溶性表达

目的 实现铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)全基因的可溶性表达。方法 用基因重组技术构建pMAL-PEA原核分泌型表达载体,并在大肠杆菌BL21中进行表达,然后利用直链淀粉树脂对表达蛋白进行亲和层析纯化。结果 酶切鉴定及测序结果表明pMAL-P2X载体上成功地插入了PEA全基因。用IPTG诱导目的基因表达,表达的融合蛋白量约占细菌总蛋白的20％。表达产物经超声处理后,80％的融合蛋白存在于上清液中,说明实现了PEA的可溶性表达。表达的融合蛋白经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE电泳,显示为一条蛋白带,分子量约为112kD。结论成功地对PEA全基因进行了可溶性表达和纯化,获得了稳定表达的工程菌,为深入研究：PEA的致病机制和制备用于免疫导向治疗的重组毒素奠定了基础。     

融合蛋白D2C-SN对登革2型病毒增殖的影响

目的：观察登革2型病毒衣壳蛋白（D2C）与葡萄球菌核酸酶（SN）融合蛋白在哺乳动物细胞中对登革2型病毒增殖的影响。方法：通过基因重组构建可在哺乳动物细胞中表达融合蛋白D2C-SN的重组质粒pc／D2C-SN，同步构建pc／D2C-SN用作对照。病毒感染BHK21细胞后，通过阳离子转染试剂将重组质粒导入感染细胞，在此基础上评价融合蛋白D2C-SN抗登革病毒感染的治疗效果。结果：融合蛋白D2C-SN能够在哺乳动物细胞中表达，对宿主细胞没有明显的毒性；与正常BHK21细胞相比较，可导致病毒感染性滴度降到原来的1／60—1／12。结论：融合蛋白D2C-SN在细胞水平能够有效抑制登革病毒的增殖。有可能成为潜在的抗登革病毒感染的治疗性药物。     

双启动子杆状病毒介导131I肿瘤靶向治疗的实验研究

目的构建由人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控的N1S基因以及由早期生长应答因子1（Egr1）启动子调控的人纤溶酶原Kringle5（K5）基因的双启动子重组杆状病毒载体,探讨同时靶向肿瘤细胞与血管内皮细胞的基因治疗模式的可行性。方法将hTERT启动子和N1S基因片段以及Egr1启动子和麟基因片段分别亚克隆至杆状病毒载体,经草地贪夜蛾卵巢细胞（Sf9）包装并扩增得到重组杆状病毒（Bac—hTERT-N1S—Egr1-K5）,同时将CMV启动子调控的重组杆状病毒（Bac—CMV-NIS—Egr1-K5）以及不含NIS基因或不含硒基因的重组杆状病毒（Bac—hTERT-O—Egrl-K5、Bac-hTERT-NIS—Egr1-0）作为对照组。采用荧光定量PCR及Westernblot分析NISmRNA和蛋白在人宫颈癌细胞HeLa中的靶向表达,以及131I辐射对K5mRNA和蛋白的表达调控。通过摄碘实验、NaClO4抑制实验以及细胞增殖抑制实验验证NIS蛋白的功能及由其介导的131I抑瘤作用。通过细胞凋亡实验评估K5蛋白对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的促凋亡作用。统计学检验采用方差分析。结果成功构建重组杆状病毒Bac—hTERT-NIS—Egr1-K5。荧光定量PCR及Westernblot显示肿瘤特异性启动子hTERT介导的NIS基因仅在HeLa细胞中有表达,而在正常肺纤维细胞MRC5中无表达。131I可以调控辐射敏感启动子Egr1下游您基因的转录和翻译。细胞摄碘实验显示Bac-hTERT-NIS—Egr1-K5感染的HeLa细胞摄碘增加了5．6倍,与未加NaClO4组比,其摄碘能被NaClO4显著抑制（F=199．296,P〈0．05）。131I对Bac—hTERT-NIS—Egr1-K5感染的HeLa细胞的抑制效果明显,细胞存活率仅为38．3％。Bac—hTERT-NIS—Egrl一K5感染的HUVEC细胞在131I照射下的凋亡率（30．8％）显著高于Bac．hTERT-NIS—Egr1-0组和未加病毒组（11．2％和10．9％,F=19．926、45．409,均P〈0．05）。结论重组杆状病毒Bac-hTERT-NIS—Egrl．K5可使NIS基因在肿瘤细胞?     

登革病毒衣壳蛋白与葡萄球菌核酸酶融合蛋白在大肠杆菌中的表达

目的：实现登革病毒衣壳蛋白C与葡萄球菌核酸酶SN融合蛋白在大肠杆菌中的表达。方法：利用基因重组技术将通过BamHⅠ连接在一起的CSN基因克隆入表达载体pLEX，转化大肠杆茵G1724并以色氨酸诱导表达，用SDS-PAGE和免疫印迹法鉴定表达的融合蛋白，采用TDA显色法检测融合蛋白中SN的活性。结果与结论：成功构建重组表达载体pLEX-CSN并在大肠杆菌中获得表达，表达的融合蛋白相对分子质量约27000，可被抗登革病毒C蛋白抗体识别，并具有SN的生物活性。为探讨登革病毒衣壳蛋白靶向性抗病毒作用奠定了基础。     

鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低分子量尿激酶融合蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中的高效表达

目的：构建鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶融合基因,并在中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）中高效表达。方法：应用重组ＤＮＡ 技术,将编码尿激酶原信号肽的ＤＮＡ 片段,与鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶基因融合在一起,并插入真核表达载体ｐＭＪＫ３ 中,构建成重组质粒ｐＭＪＫ３Ｄ。通过细胞电击穿孔法,将该重组质粒转染到中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株（ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－ ）中,转染细胞经选择培养基筛选,并采用ＭＴＸ加压扩增培养。结果：得到了高效表达融合蛋白的细胞株,表达水平为３００ Ｕ／（１０６ 细胞·ｄ）。通过ＥＬＩＳＡ 和溶解圈方法鉴定,该融合蛋白可与Ｄ－二聚体结合,并具有激活纤溶酶原溶解纤维蛋白的活性。结论：成功构建并获得高效表达双功能融合蛋白的细胞株,为进一步研究这一双功能融合蛋白的体内外特异溶栓活性以及评价其作为新型导向溶栓制剂奠定了基础。     

S100A2全长基因真核表达载体pEGFP-N2-S100A2的构建及其在胃癌细胞系BGC-823中的表达

 目的 克隆S100A2 cDNA,构建pEGFP-N2-S100A2重组表达载体,转染胃癌细胞系BGC-823,为探讨其对胃癌细胞系的影响奠定实验基础.方法 应用RT-PCR 和DNA 重组技术构建pEGFP-N2-S100A2 融合蛋白表达载体,质粒经测序正确后,用脂质体转染BGC-823 细胞.结果 重组质粒经限制性酶切鉴定得到与S100A2全长基因长度一致(294 bp) 的酶切产物; 测序分析证实,重组质粒中含有一与GenBank 上登录的S100A2基因(NM-005978) 序列完全一致的序列,表明成功地完成了表达载体的构建; 荧光显微镜下可见转染的BGC-823 细胞有绿色荧光蛋白的表达.结论 构建完成真核表达载体pEGFP-N2-S100A2,S100A2基因在BGC-823细胞内成功表达.     

CB-GFP融合基因在COS-7细胞中的表达与定位

目的：构建以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）为报告基因的重组表达质粒pEGFP-N1-CB，转染体外培养的COS-7细胞，以观察CB重组蛋白在真核细胞中的表达及定位。方法：PCR方法扩增得到去除终止密码的cB融合基因序列，克隆入真核表达载体pEGFP-N1中，构建重组表达载体pEGFP-N1-CB。脂质体法转染体外培养的COST细胞后，以RT-PCR和Western印迹方法验证其mRNA及蛋白的表达，并在活细胞状态下用荧光显微镜、激光共聚焦显微成像技术直接观察CB-GFP融合蛋白在细胞中的分布和定位。结果：RT．PCR及Western印迹结果均证明CB—GFP融合基因表达载体pEGFP-N1-CB在COS．7细胞中获得了表达。荧光显微镜观察显示，在空载体pEGFP-N1转染组中，COST细胞内荧光呈弥散分布；重组质粒pEGFP-N1-CB转染组中，绿色荧光主要聚集在细胞浆中。结论：CB融合基因能在真核细胞COST中得到高效表达，且蛋白表达主要定位于细胞浆中，本试验为CB重组蛋白的提取及进一步功能研究奠定了基础。     

载体介导的siRNA对SGC-7901胃癌细胞中hPOT1表达的抑制作用

目的构建人端粒保护蛋白（hPOT1）基因的短链干扰核糖核酸（siRNA）表达载体，观察其在胃癌细胞中抑制hPOT1基因表达的作用，为进一步研究hPOT1在胃癌细胞生长增殖中的作用打下基础。方法设计并化学合成64nt编码hPOT1 siRNA基因片段的寡核苷酸，退火成双链后将其连接到pSUPER质粒的H1 RNA启动子下游，构建psiRNA-hPOT1重组质粒。经酶切、测序鉴定后，用脂质体介导的基因转染方法，转人SGC-7901胃癌细胞，用半定量RT-PCR检测hPOT1表达水平的变化。结果测序结果表明重组质粒psiRNA-hPOT1 64个碱基成功插人到预定位置，并且序列完全一致。hPOT1 siRNA表达载体psiRNA-hPOT1转入胃癌细胞后，可明显抑制SGC-7901细胞hPOT1的表达。结论构建的hPOT1基因的siRNA表达载体psiRNA-hPOT1重组质粒能显著抑制hPOT1基因在SGC-7901胃癌细胞中的表达。     

鼠抗人纤维蛋白单链抗体—低分子量尿激酶融合蛋白在？…

目的;构建鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶融合蛋白,并在中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）中高效表达。方法：应用重组ＤＮＡ技术,将编码尿激酶原信号肽的ＤＮＡ片段,与鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶基因融合在一起,并插入真核表达载体ｐＭＪＫ３中,构建成重组质粒ｐＭＪＫ３Ｄ。通过细胞电击穿孔法,将该重组质中粒转染到中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株中,转染细胞经选择培养基筛选。     

骨唾液蛋白非融合荧光蛋白载体的构建及其在特异性骨转移乳腺癌细胞中的稳定表达

目的 构建骨唾液蛋白(BSP)非融合荧光表达载体,建立稳定高效表达BSP和荧光蛋白的乳腺癌细胞系,为进一步研究BSP在乳腺癌细胞骨转移中的作用奠定基础。方法 从构建好的pB-hBSP载体中用PCR方法扩增hBSP基因,通过BglⅡ和PstⅠ两个限制性酶切位点定向克隆至真核表达载体pIRES2一EGFP,构建重组载体pIRES2-hBSP-EGFP。利用脂质体转染的方法将构建好的重组质粒转入特异性骨转移的乳腺癌细胞株MDA-MB-23180中,并利用G418和流式细胞仪筛选阳性克隆。结果 成功构建hBSP和EGFP非融合表达的真核表达载体pIRES2-hBSP EGFP,并成功转染特异骨转移的乳腺癌细胞株,获得hBSP的稳定转染细胞株,荧光显微镜下可观察到荧光蛋白标记。结论 真核表达载体CRFS2-hBSP-EGFP的构建及hBSP稳定转染细胞株的获得为研究BSP在乳腺癌骨转移中的作用奠定了的基础。     

人Survivin基因重组腺病毒载体的构建及其表达

目的　构建含有人Survivin基因的重组腺病毒载体,为转染树突状细胞(DC)构建DC疫苗和基因治疗奠定基础。方法　自行设计一对分别含有KpnⅠ和XholⅠ酶切位点的Survivin基因上下游引物,以质粒pCITE/Survivin为模板,通过PCR扩增获得Survivin基因全序列。片段回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack CMV,获得重组质粒pAdTrack CMV Survivin。通过KpnⅠ和XholⅠ双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体pAdTrack Survivin转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy 1 的BJ5183菌。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。同时将病毒上清转染成纤维细胞,通过观察GFP的表达以及Western blot分析观察Survivin蛋白表达。结果　成功构建了含有人Survivin基因的重组腺病毒,病毒滴度为1 65×108pfu/L。Western blot检测可见16 5kD的Survivin蛋白表达。结论　该重组腺病毒载体的构建及成功转染到成纤维细胞内表达为下一步以人Survivin作为靶抗原的基因治疗奠定了基础。     

PTD-NGF融合蛋白的制备、活性分析及其跨膜功能研究

目的:构建PTD-NGF融合基因,检测表达的重组蛋白生物学活性和跨膜转运功能.方法:提取小鼠大脑组织RNA逆转录后,钓取β-NGF基因.PCR技术构建PTD-NGF融合基因,插入表达质粒pBV220后,转化大肠杆菌DH5α进行表达与纯化.稀释法复性后,SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达重组蛋白.PC12细胞分化培养检测融合蛋白的生物学活性.重组蛋白与HepG2细胞共孵育,免疫组化检测其跨膜功能.结果:PTD-NGF融合基因测序正确,表达产物与目的蛋白大小相符,能与NGF抗体发生结合反应.纯化后蛋白纯度可约达90%以上,重组蛋白经复性可诱导PC12细胞出现明显分化,并能跨膜进入HepG2细胞内部.结论:成功构建了融合基因,表达的重组蛋白具有显著的生物学活性及跨膜转运功能.     

神经特异性转录因子DAT1绿荧光蛋白表达载体的构建及其在C8细胞中的表达定位

目的：构建神经特异性转录因子DAT1与绿荧光蛋白融合表达的表达载体，并检测其在C8星形胶质细胞中的表达。方法：采用基因重组技术将DAT1基因和绿色荧光蛋白基因融合，构建绿荧光蛋白表达载体pEGFP—C1-DAT1，测序验证序列无误后。用脂质体法将重组质粒转入C8细胞，荧光显微镜观察DAT1的表达及定位。结果：测序验证结果表明，重组质粒含有DAT1全长编码序列，转染实验表明EGFP—DAT1能在C8细胞中正确表达，且：DAT1蛋白主要定位于细胞核中。结论：DAT1全长cDNA基因绿色荧光蛋白表达载体构建成功，在C8细胞中可以正确表达，为进一步研究DAT1的功能奠定了基础。     

应用Red重组技术构建四环素抗性多基因串联表达载体

目的构建一种四环素抗性的多基因串联表达载体。方法设计同源臂引物,通过重叠延伸PCR获取含四环素抗性基因的打靶序列,应用pKD46介导的Red重组系统,在DH5α内替换多基因串联表达载体pET-m28a（＋）中的抗性基因序列;再利用同尾酶（isocaudarner）策略,将sfp和accA1两基因串联组合于pET-mt28a（＋）中,并进行共表达鉴定。结果获得了含四环素抗性的重组质粒pET-mt28a（＋）;构建了两基因串联重组质粒pET/sfp/accA1-mt28a（＋）,且两基因能够在同一载体上协同表达。结论成功构建了一种四环素抗性表达载体pET-mt28a（＋）,并可介导多基因的协同表达,为红霉素合成通路在大肠杆菌中的重建奠定了基础。     

含有RSV G蛋白片段和CTL表位融合蛋白的表达及纯化

目的：构建表达呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白片段(G126，来自100-225氨基酸)和来自：RSVM2蛋白的CTL表位的原核表达质粒，探索适宜的表达和纯化条件，获得融合表达产物，为进行体内外实验检测奠定基础。方法：利用PCR技术，从质粒puC18(G10)、puC18(CTL)中扩增G126和CTL基因，通过DNA重组技术构建含：DsbAG126-Linker-CTL(DsbA-GLC)融合基因的表达载体pET(GLC)。转化宿主菌E.coli BL21(DE3)plysS进行诱导表达，并采用亲和层析纯化目的蛋白。结果：DsbA-GLC在E．coli BL21(DE3)plysS中可获得高效表达，表达量可达菌体总蛋白的21％。通过可溶性测试，DsbA-GLC能以可溶性形式表达。纯化后目的蛋白的纯度可达到95％以上。结论：实现RSVG126和M2蛋白CTL表位的融合表达，所获得的重组蛋白可作为抗原用于RSV重组蛋白疫苗的筛选。