纤毛的研究进展

纤毛是一种突出细胞表面的细胞器,有运动纤毛和初级纤毛之分.长期以来初级纤毛都被认为是一种没有任何功能的退化细胞器,最近研究表明初级纤毛是一种机械传感器,发挥机械信号转导的功能.另外,在初级纤毛的装配、解聚及其蛋白组成等方面都有很大进展.     

纤毛的研究进展

纤毛是一种突出细胞表面的细胞器,有运动纤毛和初级纤毛之分.长期以来初级纤毛都被认为是一种没有任何功能的退化细胞器,最近研究表明初级纤毛是一种机械传感器,发挥机械信号转导的功能.另外,在初级纤毛的装配、解聚及其蛋白组成等方面都有很大进展.     

去泛素化酶Mysm1通过调控胶质纤维酸性蛋白的表达调节神经干细胞向星形胶质细胞分化

目的 研究去泛素化酶Mysm1对神经干细胞（NSC）向星形胶质细胞分化的影响及其作用机制。方法从孕12.5 d C57BL/6胎鼠脑组织中分离NSC在体外进行培养,体外诱导NSC向星形胶质细胞分化。免疫荧光染色、实时定量PCR和蛋白质免疫印迹实验检测体外NSC向星形胶质细胞分化过程中Mysm1表达量的变化;使用慢病毒敲低NSC中Mysm1的表达量并通过实时定量PCR和蛋白质免疫印迹实验检测敲低效率;免疫荧光染色和蛋白质免疫印迹实验比较体外敲低Mysm1前后NSC向星形胶质细胞分化的变化;转录组学检测体外敲低NSC内Mysm1后差异基因情况;蛋白质免疫印迹实验验证差异基因相关蛋白的变化;Cut-Tag检测体外NSC向星形胶质细胞分化过程中Mysm1在胶质纤维酸性蛋白（GFAP）基因启动子区域富集情况;在敲低Mysm1的基础上过表达GFAP,免疫荧光染色和蛋白质免疫印迹实验检测体外过表达GFAP前后NSC向星形胶质细胞分化的变化。结果 体外诱导NSC向星形胶质细胞分化时,细胞表达Mysm1逐渐升高;Mysm1敲低会抑制体外NSC向星形胶质细胞分化;Mysm1通过调控GFAP的转录影响NSC...     

初级纤毛对骨骼发育的影响

随着常染色体显性多囊肾病"初级纤毛学说"研究的深入,多囊蛋白-初级纤毛复合体在骨骼发育过程中的重要作用越来越受到人们的关注。多囊蛋白-初级纤毛复合体结构和功能的异常,可导致膜内成骨和软骨内成骨的延迟,且可出现骨质疏松、隐性脊柱裂和软骨发育不良等多种并发症。研究发现骨细胞-成骨细胞表面的初级纤毛作为一种机械感受器,具有多种激素受体和压力门控离子通道,可感受外界应力作用,调节细胞内离子浓度及信号传导通路,从而维持骨的正常发育。本文就多囊蛋白-初级纤毛复合体对骨骼发育影响及其分子机制进行了综述。     

PERK参与调控砷化物诱导细胞自噬反应的信号转导机制研究

目的 探索PERK是否参与调控砷化物诱导的细胞自噬反应.方法 体外培养人肝癌细胞HepG2,以砷化物为刺激源,采用Western印迹方法检测自噬反应标志性蛋白的表达水平、PERK诱导活化状态以及敲低PERK表达水平后砷化物诱导细胞自噬反应和p53诱导活化水平变化情况;采用双荧光素酶报告基因技术检测敲低PERK表达水平后p53的转录激活活性变化.结果 砷化物刺激HepG2细胞后自噬反应相关蛋白Beclin-1诱导表达、LC3发生剪切、p62发生降解反应,同时PERK活化水平显著增强;敲低PERK表达水平后,砷化物刺激作用下Beclin-1的诱导表达、LC3的剪切以及p62的降解均被显著抑制;同样条件下p53在Ser15和Ser392位的磷酸化修饰反应水平和转录激活活性显著下降、p53下游靶基因DAPK1的诱导表达水平被显著抑制.结论 PERK能通过调节p53活化及其下游靶基因DAPK1表达从而介导砷化物诱导的细胞自噬反应.     

DNA依赖性蛋白激酶催化亚基在电离辐射诱发HeLa细胞自噬中的作用

目的：了解DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（ DNA-PKcs）在电离辐射诱发细胞自噬中的作用。方法通过慢病毒载体（ pSicoR ）构建DNA-PKcs短发夹RNA （ shRNA ）表达载体,并转染HeLa细胞敲低DNA-PKcs表达。CCK-8实验检测细胞增殖活性及细胞放射敏感性,免疫印迹检测自噬相关蛋白表达,免疫荧光实验检测自噬标志物GFP-LC3的表达。结果成功构建shRNA敲低DNA-PKcs表达的HeLa细胞模型,通过该细胞模型观察到抑制DNA-PKcs蛋白表达导致细胞增殖能力降低、放射敏感性增高。 P62和LC3蛋白表达变化,以及细胞内绿色荧光蛋白（ GFP）-LC3免疫荧光斑检测结果显示,DNA-PKcs基因敲低后,明显增加X射线诱发细胞自噬。抑制DNA-PKcs导致哺乳动物西罗莫司（雷帕霉素）靶蛋白（ mTOR）第2481位丝氨酸磷酸化水平降低。结论抑制DNA-PKcs增强受照射宫颈癌HeLa细胞的自噬及放射敏感性,mTOR信号通路可能参与DNA-PKcs对自噬的调节作用。     

原发性纤毛不动综合征诊断方法的应用进展

原发性纤毛不动综合征(PCD)是一种常染色体隐性或性染色体相关的遗传疾病,需要结合患者的临床表现及多种检测手段进行诊断.其中鼻呼出气一氧化氮检测、高频数字视频成像、透射电镜和基因检测是国际指南推荐的检测手段,然而由于复杂的检测设备难以普及,往往对PCD的诊治造成延误.在目前对PCD的诊断中,免疫荧光染色法(IF)的应用日益受到重视,该方法通过对纤毛结构的特异性标志物进行染色,间接检测纤毛结构是否存在异常,具有较高的特异性,在PCD的早期筛查和辅助诊断等方面具有巨大潜力.本文针对PCD的诊断方法进行概述,并着重介绍IF在PCD诊断中的应用进展.     

人肝癌细胞敲低Rab27 B后的差异蛋白质组初步研究

目的：通过分析敲低Rab27B后肝癌细胞蛋白质表达的变化,研究其在肿瘤细胞中的作用及可能的分子机制。方法在人肝癌细胞系MHCC97H中利用Tet-on系统和RNA干扰（RNAi）技术敲低Rab27B 表达,利用iTRAQ定量蛋白质组学技术比较敲低前后肿瘤细胞蛋白表达的差异,并对其进行亚细胞定位、生物过程和分子功能等生物信息学分析。结果 MHCC97H细胞敲低Rab27B后共鉴定到448种差异蛋白[比值（｜Ratio｜）＞1．21, P＜0．05],其中表达趋势与Rab27B正相关的蛋白229种,负相关的蛋白219种。差异蛋白主要涉及囊泡运输、大分子定位、胞内应激等生物过程,有26种差异蛋白分布于8个肿瘤相关信号通路中,其中11种集中在黏着斑（ focal adhesion）信号通路。结论对Rab27B敲低前后MHCC97H细胞全蛋白的iTRAQ分析表明,Rab27B不仅能影响肿瘤细胞的外泌体分泌,还能引起与细胞增殖和迁移等相关的信号通路中重要蛋白的变化,提示Rab27B确实具有调控肿瘤细胞增殖和迁移的分子基础。     

抑制细丝蛋白A促进前列腺癌C4-2细胞迁移

目的 探讨细丝蛋白A(FLNA)对前列腺癌细胞迁移的影响。方法 设计并构建靶向FLNA的shRNA敲低质粒pSIH-H1-shFLNA。包装慢病毒后感染前列腺癌C4-2细胞,获得敲低FLNA的稳定细胞系C4-2-shFLNA。Western印迹检测前列腺癌C4-2细胞中FLNA蛋白表达和PC-1蛋白表达;实时荧光定量PCR(qPCR)检测FLNA以及PC-1 mRNA表达水平;Western印迹检测敲低FLNA对磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B(AKT)信号通路的影响;划痕实验和Transwell实验检测C4-2细胞体外迁移能力。结果 前列腺癌C4-2细胞敲低FLNA后FLNA mRNA和蛋白水平明显下调,PC-1 mRNA水平和蛋白水平表达增加,同时AKT磷酸化水平显著升高。划痕及Transwell实验证实在前列腺癌C4-2细胞中敲低FLNA后细胞迁移能力增强。结论 前列腺癌细胞中敲低FLNA能够激活PI3K/AKT信号通路,促进前列腺癌细胞迁移。     

敲低细胞角蛋白18对氧化应激诱导细胞凋亡的影响

目的研究氧化应激条件下中间纤维蛋白细胞角蛋白(cytokeratin)的抗凋亡作用。方法利用RNA干扰(RNAi)技术敲低细胞内细胞角蛋白18(CK18)的表达,免疫印迹法检测细胞角蛋白的表达水平,并通过A549细胞建立细胞角蛋白敲低稳定细胞系。利用免疫荧光染色技术观察细胞角蛋白对细胞骨架的影响。利用流式细胞技术检测细胞角蛋白对细胞内ROS(reactive oxygen species)水平及氧化应激诱导细胞凋亡的影响。结果筛选获得3个干扰效果较好的RNAi序列,成功利用A549细胞建立细胞角蛋白敲低的稳定细胞系(A549-KD)。CK18表达敲低导致细胞内多种细胞角蛋白表达广泛下调,并破坏细胞微丝及微管骨架结构。氧化应激条件下A549-KD细胞抗凋亡活性显著降低。结论细胞角蛋白参与维持细胞骨架结构,对抗ROS诱导的细胞凋亡,提示其在细胞的氧化应激过程中发挥保护作用。     

肿瘤坏死因子α通过抑制线粒体呼吸链复合体Ⅲ诱导L929-A细胞发生RIP1激酶依赖性细胞凋亡

目的 探讨肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)诱导L929-A细胞发生受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein 1,RIP1)依赖性凋亡的分子机制.方法 通过胰蛋白酶浓度梯度消化及蛋白质印迹法检测RIP1、胱天蛋白酶8(caspase-8)和Bid蛋白的表达和线粒体定位;利用荧光探针标记法检测TNF-α处理后L929-A细胞内的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、胞内钙离子浓度、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)及三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)浓度,应用试剂盒检测线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ的活性变化;采用RIP1激酶特异性抑制剂坏死抑素1(necrostatin-1,Nec-1)和Bid基因敲除的L929-A细胞评估RIP1激酶活性和Bid蛋白在介导细胞死亡中的作用.结果 RIP1、caspase-8和Bid蛋白均定位在线粒体外膜上;TNF-α处理后3 h即可诱导Bid剪切,伴随Bid剪切,线粒体呼吸链复合体功能检测显示复合体Ⅲ的活性受到抑制,MMP下降.TNF-α处理后6~12 h细胞内ROS升高、钙离子浓度上升、ATP浓度降低;抑制RIP1激酶活性或敲低Bid蛋白可完全拮抗TNF-α诱导的细胞毒性.结论 TNF-α通过诱导RIP1激酶活性依赖的Bid剪切,继而抑制线粒体呼吸链和细胞能量代谢,诱导细胞死亡.     

VEGF/VEGFR2/NRP1与胶质瘤干细胞血管微环境及其靶向分子成像

血管内皮生长因子(VEGF)/血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)/神经纤毛蛋白1(NRP1)信号通路与胶质瘤干细胞(GSC)血管生成过程具有密切的关系。对VEGF/VEGFR2/NRP1进行靶向分子成像,可以对肿瘤血管生成在肿瘤生长、浸润、迁移等过程中的作用有更好的理解,从而有利于肿瘤的早期诊断、合理治疗及判断预后。就VEGF/VEGFR2/NRP1信号通路与胶质瘤干细胞血管微环境的关系以及对其靶向分子成像作一综述。     

黏蛋白3羧基末端蛋白酶切的阻断及N-糖基化的抑制对其细胞膜定位的影响

目的探讨大鼠黏蛋白3(rMuc3)羧基端蛋白酶切反应和羧基端内N-糖苷型糖链与细胞膜定位的关系。方法利用脂质体将包含rMuc3羧基端的3个真核表达载体p20、p20t和p20s/a导入COS-1细胞,并采用N-糖苷型糖链合成抑制剂衣霉素处理转染后的COS-1细胞,抑制其表达蛋白质的N型糖链合成。采用免疫荧光定位法,用抗V5抗体和抗Myc抗体检测Muc3蛋白的表达。结果在甲醇固定的COS-1细胞,细胞核周和细胞表面均能检测到完整的Muc3羧基端p20表达产物;在未经甲醇固定的COS-1细胞,免疫荧光仅限于细胞表面。缺失的rMuc3羧基端的p20t表达产物仅能在细胞核周检测到。Muc3羧基端建立的蛋白酶切阴性突变体p20s/a与p20转染细胞的荧光分布相近。衣霉素抑制糖链合成后不影响膜定位。结论Muc3羧基末端蛋白酶切的阻断及N-糖基化的抑制不能影响Muc3的细胞膜定位,影响其定位的因素主要是SEA组件靠近羧基端的区域,包括该分子的跨膜区和胞质内区域。     

端粒单链结合蛋白hPOT1核定位结构域的鉴定

目的：鉴定端粒单链结合蛋白hPOT1核定位结构域。方法：通过hPOT1的不同长度缺失突变体与EGFP绿色荧光蛋白融合，转染细胞后用荧光显微镜观察融合蛋白在细胞内的定位。结果：确定了hPOT进核序列是定位于第355—375位氨基酸之间的富含碱性氨基酸序列，其中R^377，R^373影响hPOT1的细胞核内定位。结论：鉴定出hPOT1的核定位结构域，该结构域影响了hPOT1不同形式剪接体蛋白的细胞内分布。为进一步研究hPOT1在端粒末端调控中的作用提供了线索。     

HPV E6蛋白调控miRNA-145表达的分子机制及其在宫颈癌侵袭转移中的意义

目的研究宫颈癌细胞中HPV E6蛋白调控miRNA-145表达的分子机制及其在宫颈癌侵袭转移中的意义。方法 Northern-blot方法检测宫颈癌细胞中过表达p53对miR-145表达的影响;检测宫颈癌细胞中敲低HPV E6表达对miR-145表达的影响。Western-blot方法检测过表达HPV E6对内源性及外源性p53表达的影响;检测宫颈癌细胞中敲低HPV E6对外源性p53的表达的影响。应用划痕愈合实验,检测过表达miR-145的HeLa细胞与母本HeLa在细胞迁徙能力上的差异;Trans-well试验观察过表达miR-145的HeLa细胞与母本HeLa在细胞侵袭能力上的差异。结果宫颈癌细胞中过表达p53可显著上调miR-145的表达;过表达HPV E6可降低p53的表达;宫颈癌细胞中敲低HPV E6表达可增强p53的表达,并且可增强双氧水诱导的miR-145表达;过表达miR-145抑制细胞的迁徙、侵袭能力。结论 HPV E6通过抑制p53下调miR-145表达,从而促进宫颈癌细胞侵袭。     

Erbin表达缺失诱导MDA-453人乳腺癌细胞对曲妥珠单抗耐药

目的：探索Erbin表达缺失导致Her2阳性的人乳腺癌细胞MDA-453对曲妥珠单抗敏感性的影响。方法设计、构建含人Erbin基因特异性的短发夹RNA（ shRNA）及对照shRNA的干扰载体,转染MDA-453人乳腺癌细胞。经G418加压筛选,获得稳定敲低Erbin的MDA-453细胞（ MDA-453-Erbin sh）和稳定表达对照shRNA的MDA-453细胞（ MDA-453-NC）,以后者作为对照细胞。应用Western印迹法检测MDA-453-NC和MDA-453-Erbin sh细胞中Erbin表达水平。分别通过细胞增殖活性实验及细胞集落形成实验,观察敲低Erbin的MDA-453细胞对曲妥珠单抗敏感性的变化。通过免疫组化染色法,分析Erbin在人乳腺癌及正常乳腺组织中的表达。结果建立了稳定敲低Erbin的MDA-453细胞株,发现敲低Erbin表达可诱导MDA-453细胞对曲妥珠单抗产生抗性。与正常乳腺上皮组织相比,人乳腺癌组织标本中Erbin表达水平降低。结论 Erbin表达缺失可能影响乳腺癌对曲妥珠单抗治疗的敏感性。     

2-氯脱氧腺苷(2-CDA)诱导人黑色素瘤A375细胞凋亡的机制探讨

目的探索2-氯脱氧腺苷(2-CDA)诱导人黑色素瘤A375细胞凋亡的机制。方法取对数生长期A375细胞,MTT比色法检测2-CDA对其体外增殖的抑制作用,Annexin V/PI双标法流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blotting检测细胞内蛋白水平的变化。结果 2-CDA对A375细胞增殖具有明显抑制作用,且随浓度增加及作用时间延长而逐渐增强,48h时的半数抑制浓度(IC50)为3.04μmol/L;Annexin V/PI双染并经流式细胞术检测显示2-CDA能够明显诱导细胞凋亡;Western blotting检测显示2-CDA能够显著下调Stat3的磷酸化水平,2-CDA作用后细胞凋亡信号蛋白caspase-3发生剪切而活化,导致其下游蛋白PARP发生剪切而诱导细胞凋亡。结论 2-CDA可通过抑制Stat3蛋白活性并激活Caspase-3而诱导A375细胞发生凋亡。     

Rack1敲低促进TGF-β诱导的A549细胞的上皮-间充质转化

目的 研究Rack1分子在TGF-β诱导A549细胞发生上皮-间充质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)过程中的功能.方法 制备携带不同Rack1干涉序列的慢病毒颗粒,并感染A549细胞建立稳定细胞系.选取敲低效率较高的细胞系,利用MTS、细胞划痕、免疫印迹等技术检测Rack1敲低后细胞的增殖、TGF-β诱导的迁移及相关分子表达水平的改变.结果 获得了Rack1稳定敲低的细胞系,Rack1敲低后细胞增殖减慢,TGF-β诱导的迁移加快,钙黏蛋白E(E-cadherin)下调和胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)磷酸化水平升高.结论 Rack1分子敲低促进EMT的发生.