结核DNA疫苗宿主蛋白残留检测方法的建立

目的 建立结核DNA疫苗中大肠杆菌宿主蛋白残留量检测的方法。方法 采用双抗夹心酶联免疫吸附法(ELISA法)建立结核DNA疫苗中宿主蛋白残留量检测的方法,对方法的准确度、专属性、线性范围和耐用性等进行验证,并采用建立的方法对结核DNA疫苗原液进行测定。结果 大肠杆菌宿主蛋白含量在2～24ng·L^-1范围内,相关系数R²>0.990,线性关系良好;该法宿主蛋白含量在高中低浓度范围内,回收率在70%～120%之内,准确度良好;该法不易受辅料、核酸、孵育温度和孵育时间影响,专属性和耐用性较好;三批原液的宿主蛋白残留量(HCP)均<1μg·mg^-1。结论 此方法有较好的准确度、专属性、重复性、中间精密度和耐用性,可用于结核DNA疫苗的宿主蛋白残留量的检测。     

NMM抗肿瘤治疗性DNA疫苗中卡那霉素残留量检测方法的建立与验证

建立并验证检测NMM抗肿瘤DNA疫苗中卡那霉素残留量的方法。采用间接竞争ELISA方法检测卡那霉素残留量,采用四参数Logstic曲线进行回归分析,并对本方法的专属性、检测限、定量限、线性与范围、精密度、准确度、耐用性等进行验证,验证方法有效后对多批次样品进行检测。使用该方法检测卡那霉素残留量时,样品无需稀释,辅料、质粒DNA对卡那霉素的检测无干扰;本方法检测限为0.15 ng/mL;定量限为0.5 ng/mL;在0.5～40.5 ng/mL范围内线性关系良好,且符合四参数方程式：y=D+(A-D)/[1+(x/C)^B],R²≥0.999;在检测线性范围内加入不同浓度的卡那霉素对照溶液,回收率均值在95%～115%之间(n=12,RSD=6.20%);本方法重复性试验中卡那霉素含量RSD值为4.22%(n=6),中间精密度试验中DNA疫苗中卡那霉素含量RSD值为10.95%。本方法检测实验条件发生微小变动时(不同人员、不同批次试剂盒、不同酶标仪),对测定结果的影响在可接受范围内。应用该方法对7批样品中卡那霉素残留量进行检测,结果表明,每个人用...     

原代地鼠肾细胞疫苗中残余宿主细胞蛋白检测方法的建立及初步验证

目的 建立定量检测原代地鼠肾细胞(primary hamster kidney cell,PHKC)疫苗中残余宿主细胞蛋白含量的方法 .方法 制备PHKC蛋白免疫家兔,对获得的抗血清进行纯化并标记辣根过氧化物酶,通过优化各反应条件建立ELISA方法 ,同时进行方法学验证.结果 ELISA检测方法的最佳包被抗体质量浓度为6 mg/L,酶标抗体工作浓度为1:2000,最佳检测区间为12.500～200.000μg/L,定量限度为23.250μg/L,准确度和精密度较佳.结论 建立了一种简单、准确、可靠检测PHKC病毒性疫苗中宿主细胞蛋白残留量的ELISA双抗体夹心法.     

鸡胚细胞疫苗制品宿主细胞蛋白残留量检测方法的建立

目的 建立鸡胚细胞疫苗制品中宿主细胞蛋白残留量的检测方法.方法 制备鸡胚细胞蛋白和抗鸡胚细胞蛋白抗体,摸索ELISA双抗体夹心法的试验条件,建立酶联免疫检测方法,并进行各项指标的验证.结果 纯化的鸡胚细胞蛋白抗体纯度达到90％以上,抗体效价可达1∶128.蛋白质印迹法分析显示,纯化抗体与鸡胚细胞蛋白呈现特异性结合.该方...     

肠道病毒71型抗原定量检测方法的建立

目的 建立肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)抗原的定量检测方法,用于EV71疫苗生产过程中EV71抗原含量的监测.方法 用EV71抗原免疫新西兰兔制备抗EV71多克隆抗体,纯化后用辣根过氧化物酶标记.采用双抗体夹心ELISA法建立抗原检测系统.以EV71国家抗原标准品为定量标准,建立剂量反应曲线,确定该方法的线性范围和定量限,并对该方法的特异性、精密度、准确性、稳定性及适用性等进行验证.结果 建立的ELISA法的线性范围为5～80 U/ml,定量限为5 U/ml,线性决定系数均大于0.990 0;不同浓度样品回收率为85.0％～110.0％,变异系数均小于15％;置于2～8℃及37℃3、6d的抗体包被板对不同浓度样品的检测值变异系数均小于15％;该方法可特异性检测EV71原液,与非EV71样品无交叉反应.结论 建立了EV71抗原定量检测方法,为EV71疫苗生产工艺过程的质量控制奠定了基础.     

口服脊髓灰质炎减毒活疫苗中庆大霉素残留量检测方法的验证

目的  验证口服脊髓灰质炎减毒活疫苗（人二倍体细胞）中庆大霉素残留量的检测方法。方法  应用庆大霉素ELISA试剂盒建立庆大霉素残留量的检测方法。对该方法标准曲线的线性、线性范围内的准确度、精密度、专属性、耐用性、检测限及定量限进行验证。结果  验证的标准曲线线性良好,相关系数>0.98。该法检测高、中、低浓度的庆大霉素标准品的回收率为92.7%～123.6%;检测同一批次的供试品的相对标准偏差为8%;不同试验人员检测同一批次供试品和不同批次试剂盒检测同一批次供试品,相对标准偏差均<15%;庆大霉素加样回收率为95.9%～121.3%;该法在（37±1） ℃温度范围内耐用性良好;该法测定庆大霉素的检测限为0.040 ng/ml,定量限为0.135 ng/ml。结论  用于检测口服脊髓灰质炎减毒活疫苗（人二倍体细胞）中庆大霉素残留量的方法是有效的。     

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒抗原定量检测方法的建立

目的 建立定量检测发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV)抗原的方法,以用于疫苗生产过程中SFTSV抗原含量的检测.方法 用SFTSV抗原免疫BALB/c小鼠,制备抗SFTSV单克隆抗体.抗体纯化后以辣根过氧化物酶进行标记,建立双抗体夹心ELISA法.确定该法的线性范围和灵敏度,并对该法的准确性、精密性、专属性进行验证.结果 建立的ELISA法的线性范围为0.117～2.000 mg/L,定量限为0.117 mg/L,线性的决定系数为0.990 3.该法具有良好的准确性和精密度,样品回收率为98％,变异系数均＜8％.该法的专属性良好,对6株不同SFTSV的检测结果均为阳性,而与其他布尼亚病毒、Vero细胞培养上清及其他生产辅料均无交叉反应.结论 成功建立了SFTSV抗原的定量检测方法,为疫苗生产的质量控制奠定了基础.     

检测黑猩猩腺病毒68型抗原的双抗体夹心ELISA的建立

目的  建立定量黑猩猩腺病毒68型（chimpanzee adenovirus type 68，AdC68）含量的双抗体夹心ELISA，并验证其可行性。方法  用表达绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）的非复制型AdC68（AdC68GFP）感染HEK293细胞，收获病变细胞并进行超速离心纯化AdC68GFP。用纯化AdC68GFP免疫家兔制备抗AdC68GFP抗体。以抗AdC68GFP抗体为包被抗体，辣根过氧化物酶标记的抗腺病毒HEXON IgG为酶标抗体，建立双抗体夹心ELISA，确定该法的线性范围，并验证该法的准确度、精密度、专属性和适用性。结果  纯化AdC68GFP的蛋白浓度为38.8 µg/ml，其中HEK293细胞的蛋白浓度低于0.3 µg/ml。双抗体夹心ELISA的最适包被抗体和酶标抗体浓度分别为1∶50和1∶500。该法的线性范围为0.06~3.88 µg/ml，线性相关系数为0.999 6。高、低浓度AdC68GFP样品的回收率分别为93.17%和94.33%，变异系数分别为6.72%和3.44%。该法可特异性检测AdC68GFP抗原，未发现与HEK293细胞蛋白发生交叉反应。应用该法检测AdC68GFP纯化过程中的样品可反映病毒的纯化效果。结论  建立的双抗体夹心ELISA具有良好的准确度、精密度和特异性，可用于AdC68纯化工艺过程中对病毒蛋白含量的快速检测。     

14型肺炎球菌多糖双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的  建立并验证测定14型肺炎球菌多糖（pneumococcal capsular polysaccharide serotype 14，PS14）浓度的双抗体夹心ELISA。方法  采用Protein G亲和层析纯化兔血清，得到兔抗PS14多克隆抗体（多抗）。以鼠抗PS14单克隆抗体（单抗）为捕获抗体，兔抗PS14多抗为检测抗体，碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG为二抗，PS14为参考品建立双抗体夹心ELISA法。确定鼠抗PS14单抗和兔抗PS14多抗的工作浓度，建立标准曲线，并验证该方法的准确性、精密度和特异性，考察佐剂对该方法的影响。结果  鼠抗PS14单抗的最适工作浓度为5 μg/ml，兔抗PS14多抗的最适工作浓度为1 μg/ml，标准曲线的范围为9.375 ~ 600.000 ng/ml，线性良好，相关系数为0.999。测定多糖样品的PS14回收率为110% ~ 140%，多糖蛋白结合物样品的PS14回收率为90% ~110%。平均批内和批间精密度分别是5.64%和7.14%。13价结合物混合样品的PS14回收率为85% ~100%；含有佐剂的疫苗样品的PS14回收率为85% ~110%。结论  成功建立了双抗体夹心ELISA法，该方法准确性、精密度、特异性良好，且检测结果不受佐剂的影响，具有一定耐用性。     

重组溶葡萄球菌酶中宿主菌残余蛋白含量的测定

制备球形芽孢杆菌菌体蛋白作为免疫抗原，免疫家免制备抗血清，建立了一种测定重组溶葡萄球菌酶中残余宿主菌菌体蛋白含量的双抗体夹心酶联免疫吸附测定法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。结果表明，建立的双抗体夹心ELISA法快速、简便、灵敏，检测范围宽，能检测出制品中的微量菌体蛋白；对3批重组溶葡萄球菌酶原液的检测合格，制品中残余宿主菌蛋白含量小于万分之二。此方法可以用于重组溶葡萄球菌酶中残余宿主菌菌体蛋白含量的测定。     

重组人血管内皮抑制素的双抗体夹心ELISA特异性定量检测

建立了特异性检测重组人血管内皮抑制素(1)的双抗体夹心ELISA法,可区别内源性endostatin和1.1在7.8～1 000ng/ml浓度范围内线性良好,批内、批间RSD为3.9%～5.3%和4.4%～7.1%,平均回收率为97.70.     

应用ELISA法检测门冬酰胺酶中残余大肠杆菌菌体蛋白含量的研究

采用Cygnus公司"大肠杆菌菌体残留蛋白检测试剂盒"检测门冬酰胺酶中残余宿主菌菌体蛋白含量,建立门冬酰胺酶中宿主菌菌体蛋白残留检测方法并进行了相关方法验证。验证结果表明:宿主菌菌体蛋白浓度在0～100 ng/mL范围内呈良好的线性关系,线性相关系数大于0.99,不同实验人员测得的精密度RSD均小于5%,平均回收率为94.34%。通过对8批门冬酰胺酶样品的检测,测得门冬酰胺酶中的残余宿主菌体蛋白含量均小于550×10-6。该方法具有快速,操作安全简便等优点,灵敏度高,重现性好,可用于门冬酰胺酶的宿主菌体蛋白的残留检测。     

检测百日咳毒素的双抗体夹心ELISA法的建立

目的  建立白喉-破伤风-无细胞百日咳疫苗生产中百日咳毒素（pertussis toxin, PT）含量的测定方法。方法  免疫家兔制备高效价抗PT血清,纯化抗PT多克隆抗体并进行酶标记,建立双抗体夹心ELISA法并对其进行验证。结果  建立的方法在0~20 ng/ml PT测量区间呈现最佳线性,相关系数＞0.99,且重复性好。检测百日咳丝状血凝素和黏着素,结果均为阴性,说明该法特异性良好。试验内10次、不同试验间3次测定16.0、8.0、4.0、3.0 ng/ml PT,变异系数为2.8%~9.7%,回收率为95.7%~106.0%,精密度和准确度验证均符合常规质量控制要求,定量限度为3.0 ng/ml。结论  该方法能有效检测百日咳杆菌大罐发酵过程中分泌的PT,为PT质量控制奠定了重要基础。     

检测大肠杆菌菌体蛋白的夹心ELISA试剂盒的建立及应用研究

目的  建立特异、敏感的检测大肠杆菌菌体蛋白的夹心ELISA试剂盒。方法  采用大肠杆菌菌体蛋白免疫家兔,制备得到高效价抗菌体蛋白抗血清。将经饱和硫酸铵盐析、阴离子交换柱层析和亲和层析纯化的兔抗大肠杆菌菌体蛋白特异性多克隆抗体作为包被抗体和检测抗体,用生物素标记检测抗体,并加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素。结果　建立的大肠杆菌菌体蛋白夹心ELISA检测方法的敏感性为0.32 μg/L,检测范围为1~100 μg/L,与国际同类商品化试剂盒相当。此法具有良好的稳定性,其批内变异系数小于7.7%,批间变异系数小于6.2%。结论  建立了特异、敏感、稳定的检测大肠杆菌菌体蛋白的夹心ELISA试剂盒,为生物制品中残留大肠杆菌菌体蛋白的质量控制提供了一种重要的检测方法。     

高效液相色谱-示差折光法测定NMM抗肿瘤DNA疫苗中甘露醇含量

目的 建立测定NMM抗肿瘤DNA疫苗中甘露醇含量的高效液相色谱-示差折光法。方法 检测器为示差折光检测器,色谱柱为SUGAR SC1011阳离子钙型交换柱(300 mm×8 mm,6μm),流动相为纯化水,流速为1.0 mL/min,柱温为80℃,检测池温度为37℃,进样量为10μL。结果 甘露醇的质量浓度在0.02～5.00 mg/mL(R²=1.000 0,n=6)范围内与峰面积线性关系良好;定量限为13.37μg/mL;精密度、重复性、稳定性试验结果的RSD均小于2.0%;加样回收率为97.76%,RSD为0.97%(n=9)。3批小试样品和中试样品中甘露醇的含量分别为20.02,19.95 mg/mL。结论 该方法操作简便、重复性好、结果准确,可用于NMM抗肿瘤DNA疫苗中甘露醇的含量测定。     

检测脑膜炎球菌多糖疫苗Y群多糖含量和分子大小的双抗体夹心ELISA法的建立和初步应用

目的建立测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖疫苗（groupsA，C，Y，W135meningococ—calpolysaccharidevaccine，MPV4）Y群多糖含量的双抗体夹心ELISA法。方法采用杂交瘤技术制备抗Y群多糖单克隆抗体，并通过过碘酸钠法用辣根过氧化物酶标记单克隆抗体。分别以抗Y群多糖不同位点的单克隆抗体作为包被抗体和酶标二抗，通过优化反应条件来建立双抗体夹心ELISA法，同时进行方法学验证。结果建立的双抗体夹心ELISA法特异性良好，未检出与A、C、W135群多糖的交叉反应。Y群多糖在2．5～20．0ng／ml范围的剂量反应曲线呈现最佳线性关系，相关系数〉0．99。该法的试验内和试验间准确度较好，精密度较佳，定量限度为4ng／ml。采用该法测定3批MPV4Y群多糖显示，Y群多糖的含量、多糖分子大小‰值和回收率的结果均与先前的检定结果一致，符合暂行质量标准。结论建立的双抗体夹心ELISA法可用于MPV4Y群多糖的关键质量指标测定。     

荧光定量PCR法测定重组人干扰素α2b原液中宿主DNA的残留

目的建立重组人干扰素α2b原液中宿主DNA残留量测定的方法并进行验证,用于对该产品的质量控制。方法通过wako DNA提取试剂盒提取干扰素原液中的宿主残留DNA,再利用SYBRGreen染料法对样品和标准DNA进行定量PCR测定,根据标准曲线对样品中的DNA残留量分析。对建立的方法进行引物特异性以及结果准确性和精密性的验证,同时对企业提供的3批干扰素原液中的残留DNA测定。结果该方法检测假单胞菌基因组DNA的最低准确定量浓度可达12 fg/μL,DNA含量在12 fg/μL~120 ng/μL范围内线性良好,标准曲线的相关系数r=0.998;wako DNA提取试剂盒提取不同量的加标样品回收率均在50%~200%范围内;该方法检测3批干扰素原液的DNA残留量均低于标准限度,符合《中国药典》三部2010年版和2015年版中关于假单胞菌产重组人干扰素α2b原液中宿主DNA残留量的要求。结论 wako DNA提取试剂盒能解决干扰素原液中样品前处理的技术难点,与定量PCR法结合能够简便、快速、准确地对干扰素原液中残留的DNA定量测定。     

冻干甲型肝炎减毒活疫苗三氯甲烷残留量检测方法的建立及验证

目的  建立准确可靠检测冻干甲型肝炎减毒活疫苗中三氯甲烷残留量的方法。方法  采用顶空气相色谱进行三氯甲烷残留量检测,用外标法计算三氯甲烷含量。对方法的专属性、线性、范围、准确度、精密度、定量限和耐用性进行验证。结果  三氯甲烷峰5次进样峰面积的相对标准偏差小于5%,且与其他峰分离度大于1.5。阳性对照溶液在相应保留时间处可见三氯甲烷峰,阴性对照溶液无三氯甲烷峰。三氯甲烷的浓度在10~1 000 ng/ml范围内与峰面积成线性关系。浓度为600 ng/ml的供试品溶液回收率在91.3%~99.0%之间,含量相对标准偏差均小于4%。定量限浓度为0.022 g/ml。结论  建立的三氯甲烷残留量检测方法具有良好的专属性、线性、范围、准确度、精密度和耐用性,符合定量检测的需求。     

人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗酶联免疫检测法的建立及其应用

目的建立人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗(HPV16 L2E6E7)酶联免疫的检测方法,用于疫苗发酵过程中的重组蛋白表达的监控。方法用常规方法制备兔抗HPV16 L2E6E7多克隆抗体作为包被抗体,商品化小鼠抗HPV16 E7单克隆抗体为检测抗体,夹心ELISA方法检测HPV16 L2E6E7抗原参考品,建立抗原标准曲线,确定线性范围及检测限,同时验证该方法的特异性。结果建立了检测HPV16 L2E6E7抗原含量的夹心ELISA方法,抗原参考品系列浓度在19.53~1 250 ng·m L-1内有很好的线性(R2>0.99)和回收率(90%~110%);特异性好,不受发酵液中宿主菌蛋白的干扰。结论建立了人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗重组抗原含量的测定方法,为该疫苗的发酵工艺的质控提供了有效技术手段。     

测定脑膜炎球菌疫苗C群多糖的双抗体夹心ELISA法的建立

目的 建立测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖疫苗(groups A,C,Y,W135 meningococcal polysaccharide vaccine,MPV4)C群多糖含量的双抗体夹心ELISA法.  方法 制备抗C群多糖多克隆抗体,所得的多克隆抗体经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后,用过碘酸钠法对其标记辣根过氧化物酶.分别将抗C群多糖多克隆抗体作为包被抗体和酶标二抗,建立双抗体夹心ELISA法,优化反应条件,对C群多糖进行特异性定量测定.  结果 建立的双抗体夹心ELISA法特异性较好,未检出与A、Y、W135群多糖的交叉反应.C群多糖在2.5～20.0 ng/ml质量浓度范围的剂量反应曲线线性最佳,相关系数大于0.99.该法的准确度和精密度均较好,试验内和试验间变异系数和多糖回收率分别为0.6％ ～9.1％和87.5％ ～ 100.0％,定量限度为4.0 ng/ml.采用该法测定3批MPV4显示,C群多糖含量及多糖分子大小KD值和回收率的测定结果均与先前的测定结果一致,均符合暂行质量标准.  结论 建立的双抗体夹心ELISA法可用于MPV4 C群多糖的关键质量指标测定.