多重环介导等温扩增快速检测沙门菌、副溶血弧菌和单核细胞增生性李斯特菌方法的建立

目的：建立能够同时检测沙门菌、副溶血弧菌（VPH）和单核细胞增生性李斯特菌（LM）的多重环介导等温扩增（mLAMP）方法。方法分别针对沙门菌 bcfD 基因、VPH 的 tlh 基因和 LM的 iap 基因设计 mLAMP 引物,以LAMP 进行单重 LAMP 检测。实时浊度监测扩增结果,优化引物浓度配比,进而建立此3种食源性致病菌的mLAMP 检测体系,以 PCR 检测灵敏性作为比较,进行特异性和灵敏性分析。结果实时浊度监测表明,该 mLAMP体系具有良好特异性,可在45 min 内一次性检测以上3种致病菌,且无非特异扩增产生。这3种菌的检测最低限分别为300 fg／μl、4．2 pg／μl 和4．5 pg／μl,与 PCR 检测灵敏度相当。结论该多重 LAMP 可同时检测食品中的沙门菌、VPH 和 LM,可作为大规模样品的初筛或传统方法的辅助方法,用于快速判定样品中是否含有这3种致病菌。     

志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌多重PCR快速检测体系的建立

目的 建立快速检测志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌的多重PCR方法.方法 根据志贺菌ipaH基因、沙门菌ipaB基因及霍乱弧菌EPSM基因设计特异性PCR引物,加热煮沸法制备DNA模板,进行PCR扩增及琼脂糖电泳检测.结果 应用所建立的多重PCR方法能分别或同时快速、特异地检测出志贺菌606bp、沙门菌314bp和霍乱弧菌482bp的目的基因.结论 初步建立了灵敏、特异的一步法检测志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌的多重PCR体系,可用于高危腹泻致病菌的早期快速诊断.     

荧光定量PCR快速检测金黄色葡萄球菌方法的建立

目的利用SmartCycler系统建立一种简便、快速的荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,简称SAU）的方法。方法根据SAU特异nuc基因设计引物和探针,建立检测体系,并在体系中加入内质控IAC,通过另一个标记不同荧光基团的TaqMan探针来监测IAC。用SAU6538株污染饮用水和牛奶模拟实际样本,以评价体系的性能。结果以含nuc片段的线性质粒为模板,反应体系的灵敏度为5拷贝/μl;以6538株基因组DNA为模板,最低检测限为10fg/μl;用涂平板法计数并10倍梯度稀释的菌液提取DNA为模板,最低检测限为50cfu/ml。建立的定量标准曲线的循环域值（Ct）与模板拷贝数呈良好的线性关系（r2≥0.998）,PCR效率E≥96.7%。用SAU6538污染饮用水和牛奶模拟实际样本,灵敏度可达5×102cfu/25ml样本。结论所建立的nuc-IAC荧光定量PCR具有内质控IAC,既能定量检测食物是否被污染,又能监测PCR体系,防止假阴性发生或低估病原菌污染量。     

副溶血弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的 建立一种快速检测副溶血弧菌的实时荧光定量PCR方法.方法 根据副溶血弧菌tdh基因设计合成引物及TaqMan探针,利用阳性质粒和模拟标本建立副溶血弧菌实时荧光定量PCR检测方法.结果 以副溶血弧菌DNA为模板克隆了tdh基因,得到阳性质粒.利用阳性质粒建立了定量PCR方法,得到标准曲线y=-4.9197x+58.72,决定系数(R2)为0.9864.此方法具有很好的特异性,在对15种肠道致病菌的检测中,只有副溶血弧菌基因组DNA的扩增结果为阳性.对粪便和食物模拟标本进行检测,敏感性均为102cfu/μl.此方法重复性较好,对4种浓度(105、104、103、102cfu/μl)的菌液各进行3次检测,结果均为阳性,且Ct值的变异系数＜2%.结论 建立了一种检测副溶血弧菌的荧光定量PCR方法,该法的敏感性和特异均较好,适用于快速、准确地检测食品和粪便中的沙门菌.     

脂血和溶血对HBV DNA实时荧光定量PCR检测的影响

目的 探讨溶血和脂血两种因素对HBV DNA实时荧光定量PCR方法 的影响.方法 (1) 收集临床HBV DNA标本,按HBV DNA浓度分为Ⅰ水平、Ⅱ水平;收集HBV DNA阴性的重度乳糜状脂血标本和正常人标本.将以上标本按不同比例混合,制作成极高TG浓度不同HBV DNA水平:AⅠ、AⅡ组;高TG浓度不同HBV DNA水平:BⅠ、BⅡ组;正常TG浓度不同HBV DNA水平:CⅠ、CⅡ组.实时荧光定量PCR扩增.(2)收集临床HBV DNA标本,每人采集3份血标本,其中2份标本进行-20 ℃冷冻不同时间,制成重度溶血DⅠ、DⅡ组;中度溶血EⅠ、EⅡ组;无溶血对照组FⅠ、FⅡ组.实时荧光定量PCR扩增.(3)利用方差分析各检测结果 之间是否有统计学差异.结果 不同浓度脂血和溶血,对两种水平HBV DNA荧光定量PCR检测结果 均无统计学差异.结论 溶血和脂血对实时荧光定量PCR检测HBV DNA结果 无影响.     

实时荧光定量PCR法在检测泌尿生殖道感染病原体中的应用

目的评价荧光定量PCR（FQ-PCR）在实验室检测泌尿生殖道病原体、淋病奈瑟菌（NG）、解脲脲原体（UU）和沙眼衣原体（CT）中的应用。方法 464例拟诊为泌尿生殖道感染者的临床标本,用培养法检测NG、UU病原体和胶体金免疫层析法检测CT抗原,对同一标本同时用FQ-PCR检测NG、UU或CT的核酸。结果 FQ-PCR和培养法检出NG阳性率分别为28.4%（63/222）和14.9%（33/222）,P〈0.01,检测UU的阳性率分别为41.7%（126/302）和32.5%（98/302）,P〈0.05,FQ-PCR和金标法检测CT阳性率分别为18.2%（57/314）和6.1%（19/314）,P〈0.001,FQ-PCR对3种病原体的检出率均明显高于培养法或金标法。结论 FQ-PCR法检测NG、CT以及UU在临床诊断NG,UU和CT感染中具有重要应用价值,是常规方法的有效补充。     

盐度和温度对副溶血弧菌运动能力的影响

目的：研究盐度和温度调节副溶血弧菌（ Vibrio parahaemolyticus）的运动能力。方法将副溶血弧菌接种于不同盐度（0．5％、1．0％、2．0％和4．0％）的爬动和泳动平板上,37℃静置培养4．5 h后,通过比较不同盐度条件菌苔直径的差异来判定盐度对运动能力的影响。接种副溶血弧菌至含2．0％盐的爬动和泳动平板上,并分别置于37℃和26℃静止培养4．5 h后,通过比较不同温度下菌苔直径的差异来研究温度对运动能力的影响。结果与结论副溶血弧菌爬动不受盐度的影响,而其泳动与盐度呈正相关,2．0％时达到极值,4．0％时稍微下降;与26℃培养的结果相比,37℃培养时爬动和泳动均显著增强。这些结果表明盐度和温度能够调节副溶血弧菌的运动能力。     

LAMP和荧光定量PCR检测食品中致病微生物的比较研究

目的比较环介导等温扩增(LAMP)和荧光定量PCR技术对沙门菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的检测效果。方法对2株沙门菌、2株大肠埃希菌和3株金黄色葡萄球菌分别采用LAMP及荧光定量PCR进行检测,比较两种方法的检测结果。结果两种方法均展示很好的检测效果,在对牛奶和污水的检测中,两者的检测率相同,在对虾的检测中,荧光定量PCR相对于LAMP表现更高检测率,对沙门菌和大肠埃希菌的检测率,两法差异均无统计学意义(P>0.05),对金黄色葡萄球菌的检测率,两法差异有统计学意义(P<0.05)。结论荧光定量PCR和LAMP对食品致病菌的检测都具有较高的敏感度。     

荧光定量PCR检测TB-DNA在各类检样中的阳性率分析

目的:分析各类检样使用荧光定量PCR法检测TB-DNA的阳性率情况。方法:收集我院2006年7月~2007年4月期间临床疑似或确诊为结核病患者的各类检样192例,使用荧光定量PCR法进行TB-DNA检测。其中136例检样同时进行抗酸染色查找结核分支杆菌。结果:192例检样中检出TB-DNA阳性28例,总阳性率为14.6%。其中脓液、肺泡灌洗液、痰液和胸水中的阳性率最高,分别达到47.4%、25.7%、30.4%、8.7%。抗酸染色阳性率为7.4%、两种方法结果一致率为95%。结论:荧光定量PCR法检测各类检样中的TB-DNA具有特异、敏感、快速、准确、阴、阳性预测值高的优点。优于传统的涂片、培养等方法,应作为结核病病原学诊断的首选项目使用。     

金黄色葡萄球菌α-溶血素的表达、纯化及中和性抗体的制备

目的：利用大肠杆菌重组表达金黄色葡萄球菌（SAU）重要的外分泌毒力因子α-溶血素（alpha hemolysin, Hla）,检测Hla蛋白对不同种属红细胞的裂解作用;制备其特异性抗体,并检测抗体的中和活性。方法以SAU NCTC-8325菌株基因组为模板,PCR扩增hla基因,构建重组表达载体pET-28a-Hla,转化大肠杆菌BL21（DE3）,利用IPTG诱导表达,通过Ni2＋柱亲和纯化获得Hla蛋白;通过红细胞裂解实验测定Hla蛋白的溶血活性。结果重组Hla蛋白以可溶形式表达,细胞裂解实验表明,纯化的Hla蛋白可以显著裂解兔红细胞,但人红细胞和羊红细胞对Hla杀伤作用不敏感。 ELISA结果表明,获得了效价较高的多克隆抗体。该抗体可以有效抑制Hla对兔红细胞的裂解作用。结论 SAU的Hla蛋白对不同种属红细胞的溶解能力不同,为探讨Hla裂解细胞的机制给予一定的提示;同时所制备的特异性抗体（ anti-Hla）可以抑制Hla的溶血作用,为深入研究Hla的致病机制奠定了基础。     

白血病融合基因BCR-ABL和PML-RARα多重实时定量检测方法的建立

目的建立白血病常见融合基因BCR-ABL和PML-RARα多重实时定量检测方法。方法针对BCR-ABL和PML-RARα融合基因序列分别设计引物及不同荧光信号的Taqman探针,同时以肿瘤细胞K562、NB4总RNA所逆转录的c DNA为模板,通过PCR扩增出BCR-ABL599 bp和PML-RARα496 bp的基因片段,定向插入p MD18-T载体,制备成标准品并绘制标准曲线,运用实时荧光定量PCR扩增曲线判定是否具有融合基因,同时定量融合基因拷贝数。结果成功构建BCR-ABL和PML-RARα质粒标准品。应用RQ-PCR法,以Actin为内参,对临床血液样本进行检测,分析样本是否具有这两类融合基因及融合基因拷贝数。结论本研究以探针荧光信号及其信号类型来判断是否具有融合基因及融合基因类型,同时通过BCR-ABL和PML-RARα质粒标准品所绘制的标准曲线来定量融合基因初始拷贝数。在同一体系中同时检测两种常见的融合基因有利于防止漏检、节约成本,对临床检验具有普遍意义。     

荧光定量PCR快速检测在病毒性角膜炎诊疗中的应用

目的 为病毒性角膜炎的患者进行疱疹病毒病原学快速检测,根据检测结果指导临床治疗。方法 选取未进行抗病毒药物治疗的患者,根据病情分别取其泪液或病变区角膜上皮细胞,用荧光定量PCR方法对单纯疱疹病毒（herpessimplex virus,HSV）1型、HSV2、水痘-带状疱疹病毒（varicella zoster virus,VZV）、人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）和EB病毒（EB virus,EBV）的核酸进行定量检测。结果 90例病毒性角膜炎患者中有54例检测出疱疹病毒核酸,检出率为60.0%;发病后首次就诊的病毒性角膜炎患者中疱疹病毒核酸的检出率为94.7%,明显高于多次发作后就诊的患者（检出率为34.6%）,2者差异比较具有统计学意义（P<0.001）。发病后首次就诊的病毒性角膜炎患者感染的主要病毒为HSV1、EBV和HSV2,多次发作后就诊的患者感染的病毒主要为HSV1和HCMV。5种疱疹病毒中HSV占病毒检出数的74.0%,上皮型角膜炎中疱疹病毒核酸的检出率为30.6%,基质型角膜炎中疱疹病毒核酸的检出率为95.1%,基质型角膜炎中疱疹病毒检出率高于上皮型角膜炎(P<0.001）。上皮型角膜炎中HSV1病毒的检出率和平均拷贝数明显高于其他病毒;基质型角膜炎中HSV1、HSV2病毒的拷贝数明显高于其他疱疹病毒拷贝数。结论 病毒性角膜炎患者应尽早进行核酸检测以明确疱疹病毒类型及拷贝数,检测结果为进一步的抗病毒治疗和疗效判断提供科学依据。     

MecA、Nuc基因在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测中的应用

目的通过对180株金黄色葡萄球菌临床分离株MecA、Nuc基因的检测,以期选择出一种适合临床的并能简便、快速、准确检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA）的方法。方法细菌鉴定及药敏采用全自动细菌鉴定和药敏分析仪。MecA、Nuc基因检测采用荧光定量聚合酶链反应（fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR）法。结果FQ-PCR对180株金黄色葡萄球菌MecA、Nuc基因检出率为75.0%,全自动细菌鉴定和药敏分析仪对180株金黄色葡萄球菌的MRSA检出率为72.8%,2种检测方法比较差异无统计学意义（P＞0.05）。全自动细菌鉴定和药敏分析仪对MRSA的检测正确率为94.8%。结论FQ-PCR检测MRSA正确率高,只需要1～2 h即可完成。该方法快速、简便、准确,值得推广应用。     

临床微生物检测中荧光定量PCR技术的应用研究

目的 探讨在临床微生物检测中应用荧光定量PCR技术的临床价值.方法 选择2018年5月-2019年6月收治100例患者作为研究对象,观察采集标本在临床微生物检测中应用荧光定量PCR技术的检测结果.结果 60例粪便标本中,检出沙门菌20株,检出率为33.33％,副溶血性弧菌12株,检出率为20.00％,肠出血性大肠杆菌O...     

探讨实时荧光PCR法检测乙肝病毒DNA在临床中的应用

目的:探讨实时荧光PCR法检测乙肝病毒DNA在临床中的应用.方法:对168例临床乙肝病毒携带者的血清标本用ELISA法进行定性检测,再用实时荧光PCR定量检测,对两种检测结果进行相关性分析.血清标志物的检测顺序设定为:(1)HBsAg;(2)HbsAb ;(3)HbeAg;(4)HbeAb;(5)HbcAb;(6)PreS1 -Ag.结果:几种乙肝模式中,"大三阳"患者的DNA阳性检出率和拷贝数均比其他模式高,并有显著性差异.PreS1-Ag的阳性率与乙肝DNA的阳性率有很好的一致性,但由于两者检测的成分和表达的意义不完全一致,因此不能等同于或代替HBV-DNA的检测.结论:PCR定量测定HBV-DNA可以真实地反映体内乙肝病毒感染和复制及病毒载量情况,更有利于临床治疗和疗效的观察.并且实时荧光PCR法检测HBV-DNA具有快速、准确等优点,而且对低复制持续感染乙肝病人也能诊断.     

实时荧光定量PCR检测应力性骨折新兵外周血TNFRSF10C mRNA表达

目的:检测TNFRSF10C基因在应力性骨折(SF)患者与正常人之间的表达差异。方法:采用1:1配比的病例对照研究,选取入伍新兵SF病例及正常对照各10例,取受试者空腹肘静脉血,采用实时荧光定量PCR检测TNFRSF10C基因表达,结合管家基因GAPDH进行相对定量分析。结果:设计并合成了一组只特异性结合人TNFRSF10C基因的实时荧光定量PCR引物,结果未发现非特异性扩增。10例SF样本中有7例TNFRSF10C基因表达上调,上调1.4倍至6.7倍,另3例SF样本TNFRSF10C基因表达下调,分别为50%、90%和90%。结论:本研究建立的TNFRSF10C基因实时荧光定量PCR检测体系特异性好、可靠。TNFRSF10C基因表达结果为分析SF发病的分子机制及SF早期诊断提供了重要线索。     

宫颈癌患者行荧光定量PCR技术检测外周血MMP-9mRNA的价值探究

目的探讨分析宫颈癌患者采用荧光定量PCR技术检测外周血MMP-9mRNA的临床价值。方法选取2017年4月-2019年4月收治的宫颈癌患者30例及妇科良性肿瘤患者30例作为研究对象,通过实时荧光定量PCR技术检测患者外周血MMP-9mRNA表达情况,分析MMP-9mRNA表达与临床病理相关性。结果研究组外周血MMP-9mRNA阳性检出率80.00%(24/30);对照组外周血MMP-9mRNA阳性检出率46.67%(14/30);研究组外周血MMP-9mRNA阳性检出率相比对照组明显更高(P<0.05);患者年龄、病理类型、肿瘤分期、病理分化、淋巴结转移是影响MMP-9mRNA表达的因素(P<0.05);淋巴结转移、肿瘤分期是导致MMP-9mRNA表达阳性表达的危险因素。结论针对宫颈癌患者行荧光定量PCR技术检测外周血MMP-9mRNA有助于对患者肿瘤微转移情况进行及时监测与干预,以减少患者肿瘤远处转移的发生率并改善患者预后。     

荧光实时定量PCR检测老年人外周血淋巴细胞β1和β2肾上腺素能受体基因mRNA表达

目的建立荧光实时定量PCR法检测老年人外周血淋巴细胞β1和β2肾上腺素能受体(AR)基因mRNA表达。方法随机选择ASAⅠ~Ⅱ级老年患者30例,分离外周静脉血淋巴细胞,采用荧光实时定量PCR法检测β1和β2-AR基因mRNA表达,并与半定量PCR检测结果进行比较。结果30例患者外周血淋巴细胞荧光实时定量PCR均检出β1和β2-AR mRNA表达,不同性别组同一基因表达量无显著差异(P>0.05);荧光实时定量PCR检测β2-AR mRNA表达量显著高于β1-AR mRNA(P<0.001),而半定量PCR随着循环次数增加,β1和β2-AR mRNA表达差异减小。结论所建立的荧光实时定量PCR成功检测老年人外周血淋巴细胞β1和β2-AR基因mRNA表达,有较高的灵敏性及特异性;半定量PCR扩增平台期影响试验结果判断。     

亚洲副溶血弧菌临床菌株的基于碱基序列和肽链序列的多位点序列分型研究

目的：了解来自亚洲的副溶血弧菌临床菌株的群组结构和克隆复合体构成。方法在 pubMLST 公共数据中筛选具有完整 ST 型及 pST 型的来自亚洲的副溶血弧菌临床菌株数据,进行亚群分析和克隆复合体分析,并分别构建基于 ST 型和 pST 型的最小生成树。结果从数据库中共筛选到具有 ST 型及 pST 型的来自亚洲的副溶血弧菌临床菌株数据341条,共含有157个 ST 型,以 ST3型为最多。其中有214条菌株数据来自中国（包括港台地区）,覆盖了133个 ST 型,其中仍以 ST3型为最多。利用 eBURST 软件对数据进行分析,共发现了17个组,94个单体。STRUCTURE 软件分析显示,来自亚洲的副溶血弧菌临床菌株的适宜亚群数为7,各亚群内的样品平均距离为0．9113。结论来自亚洲的副溶血弧菌临床菌株具有高度多态性,可细分为7个亚群,MLST 分型时以 ST3型为多,AA-MLST 分型时以 pST2型为主。