结核分枝杆菌Rv0901基因原核表达质粒的构建及其表达

目的　为研究结核分枝杆菌基因Rv0 90 1的功能提供材料。方法　PCR扩增Rv0 90 1基因编码序列 ,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX 1λT获得重组表达质粒 ,转化大肠杆菌后用IPTG进行诱导表达 ,通过SDS PAGE、GST 纯化试剂盒鉴定并纯化表达产物。结果　从结核杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Rv0 90 1基因 ;成功构建了融合表达质粒pGEX Rv0 90 1;重组质粒经IPTG诱导后能在大肠杆菌中稳定表达 4 5kDa的GST Rv0 90 1融合蛋白。结论　本实验成功表达并纯化GST Rv0 90 1融合蛋白 ,为Rv0 90 1基因功能的研究打下了基础。     

结核分枝杆菌H37Rv株Rv1494和Rv1495 假想蛋白基因的克隆表达

目的 为探索参与调控结核分枝杆菌(MTB)持续性感染的相关分子,对MTB H37Rv株编码Rv1494、Rv1495假想蛋白基因进行克隆、表达及Western blotting鉴定.方法 采用Bioedit、Dnaman软件及Pfam数据库对MTB H37Rv株Rv1494、Rv1495基因编码蛋白质的氨基酸组分、蛋白模块以及其与大肠杆菌E.coli的mazEF蛋白家族的同源性进行分析.以H37Rv株基因组为模板,分别对Rv1494、Rv1495基因进行克隆,构建pET32a( )原核表达质粒,转化BL21宿主菌.重组蛋白经SDS-PAGE电泳分离纯化和Western blotting鉴定.结果 生物信息学分析提示,Rv1494基因、Rv1495基因编码的蛋白质分别与大肠杆菌E.coli染色体编码的mazEF家族中的抗毒素和毒素具有一定程度的同源性,分别为26%和29.75%;经测序表明原核表达重组质粒构建成功.负载重组质粒的BL21菌经IPTG诱导后可表达出分子大小与预期值相一致的融合蛋白,表达量均可达到菌体总蛋白的60%.重组蛋白经Western blotting检测出特异性阳性信号.结论 首次对MTB H37Rv株编码Rv1494、Rv1495假想蛋白基因进行克隆表达,为进一步探讨该基因在参与调控MTB持续性感染过程中的功能奠定基础.     

结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达载体.方法:PCR扩增Rv2389基因,测序正确后克隆入真核表达载体pCDNA3.1(-),重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染CHO细胞后, 分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达.结果:构建了重组质粒pCDNA- Rv2389, RT-PCR结果证明Rv2389可在CHO细胞中转录,间接免疫荧光检测证明,表达有Rv2389蛋白的细胞着染.结论:成功构建了结核分枝杆菌Rv2389基因的真核表达载体pCDNA-Rv2389,Rv2389基因可以在CHO细胞中表达.     

结核分枝杆菌基因Rv2660c、Rv2460c、Rv3875、Rv3804c细胞表位融合蛋白的表达及其免疫原性评价

  目的  评价结核分枝杆菌基因Rv2660c、Rv2460c、Rv3875和Rv3804c的细胞表位融合蛋白的免疫原性,为研制新型多阶段结核疫苗提供可靠的靶抗原。  方法  将Rv2660c、Rv2460c、Rv3875和Rv3804c基因中的细胞表位串联构成融合抗原基因(命名为msv),克隆到原核表达载体pEASY-Blunt E1中,诱导表达后采用亲和层析纯化表达产物,经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用纯化的融合抗原蛋白免疫小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的特异性抗体滴度;分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,采用淋巴细胞增殖法检测其免疫原性。  结果  成功构建了能表达融合抗原基因msv的原核表达质粒;SDS-PAGE和Western blot结果表明,表达产物亲和层析纯化后,获得相对分子质量为41.3×103的目的蛋白;ELISA检测免疫小鼠血清抗体滴度,结果表明特异性抗体效价约为1:81 920;淋巴细胞增殖实验结果表明,抗原致敏的淋巴细胞经融合蛋白msv刺激后明显增殖。  结论  成功表达并纯化出融合蛋白msv,该融合蛋白可诱导小鼠特异性抗体表达和刺激细胞免疫应答,可作为结核疫苗的抗原组分。     

结核分枝杆菌Rv2994基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

目的构建结核分枝杆菌假想药物外排泵蛋白编码基因Rv2994的重组穿梭质粒pMV-2994,并对其进行鉴定。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,应用PCR技术扩增Rv2994基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX-1λT,获得重组表达质粒pGEX-2994,测序鉴定。酶切该基因片段,定向重组入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261,构建重组质粒pMV-2994,通过限制性内切酶酶切及PCR鉴定。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出的Rv2994基因与GenBank公布的序列一致,经过酶切及PCR鉴定,表明Rv2994基因成功插入了pMV261穿梭载体。结论成功构建了重组穿梭质粒pMV-2994,为进一步研究Rv2994基因功能奠定了基础。     

结核分枝杆菌 Rv0757基因的原核表达及其编码蛋白对巨噬细胞功能的影响

目的构建结核杆菌Rv0757基因原核表达重组质粒pET28a-Rv0757,并研究表达的目标蛋白对小鼠骨髓巨噬细胞株ANA-1细胞的作用。方法将扩增出的Rv0757基因重组到原核表达质粒pET28a(+),并通过SDS-PAGE和Western blot鉴定诱导表达的目的蛋白。纯化目标蛋白后将目标蛋白PhoP作用于小鼠ANA-1细胞,检测活细胞数、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、一氧化氮(NO)和细胞凋亡指标。结果成功构建出pET28a-Rv0757原核表达质粒,诱导表达的目标蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定分析,其相对分子质量约为32×103。目的蛋白作用于小鼠ANA-1细胞后对活细胞数和细胞上清LDH活力无明显影响,但可以明显抑制细胞释放NO和细胞凋亡。结论本研究成功构建了原核表达载体pET28a-Rv0757,并成功表达出目标蛋白,该蛋白对小鼠ANA-1细胞没有毒性损伤,但可以抑制细胞释放NO和细胞的凋亡。     

结核分枝杆菌抗原Rv1258c、Rv1410c及Rv3425的HLA限制性CTL表位预测

目的:预测结核分枝杆菌(MTB)相关抗原Rv1258c、Rv1410c及Rv3425的HLA限制性细胞毒性T细胞(CTL)表位.方法:通过NCBI数据库获取各蛋白的氨基酸序列,利用BLAST分析其与人类蛋白质的同源性,利用SYFPEITHI、BIMAS和NetCTL数据库预测分析MTB相关抗原的HLA-A2与HLA-A...     

Rv1272和Rv1273与结核分枝杆菌耐药相关性研究

目的研究结核分枝杆菌Rv1272和Rv1273基因编码蛋白与药物外排的关系。方法利用生物信息学方法分析Rv1272和Rv1273基因及其编码蛋白的结构,采用PCR技术扩增该两个基因,并与pMF406质粒连接构建重组质粒,测序正确后,电穿孔法将重组质粒转化耻垢分枝杆菌m c2155。采用W estern b lotting对两个目的蛋白进行亚细胞定位;试管法测定重组菌株对常用的9种抗菌药物的最低抑菌浓度(M IC),以转化pMF406空质粒的耻垢分枝杆菌作为对照菌株。结果经测序验证重组质粒构建成功,W estern b lotting结果显示Rv1272和Rv1273为膜蛋白。试管法测定结果显示:含有目的基因的重组菌株对9种抗菌药物的M IC与对照菌株比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Rv1272和Rv1273蛋白为膜蛋白,未发现其与结核菌耐药之间的直接关系。     

体内IFN-γ基因转染巨噬细胞对化疗小鼠免疫功能的影响

采用磷酸钙-DNA共沉淀法,将IFN-γ真核表达质粒直接注射至经大剂量化疗后的小鼠腹腔内,可成功地转染腹腔巨噬细胞（MФ）,并表达基因产物。能刺激脾脏增生,促进淋巴细胞增殖,增加腹腔巨噬细胞数量,提高腹腔MФ的细胞毒活性,诱导腹腔MФ产生IL-1、TNF和NO。实验结果提示:IFN-γ基因转染MФ可增强化疗后受损机体的免疫功能。     

结核分枝杆菌特异性抗原Rv3117的克隆表达和诱导小鼠免疫应答的实验研究

目的 克隆表达结核分枝杆菌Rv3117蛋白,并进行诱导小鼠免疫应答的初步研究.方法 通过聚合酶链反应(PCR)扩增结核分枝杆菌Rv3117基因,克隆入pET32a载体,构建重组质粒pET32a-Rv3117,转化入大肠埃希菌BL21(E.coli) plysS(DE3),异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,镍柱亲和纯化,通过SDS-PAGE鉴定其表达情况;以目的蛋白免疫C57BL/6小鼠血清并行Western blotting分析.结果 成功构建原核表达载体pET32a-Rv3117,获得纯化的目的蛋白,其在E.coli BL21 plysS(DE3)中主要以可溶性形式表达,相对分子质量(48 100)与预期相符.Western blotting分析结果显示在目标位置有阳性条带.结论 成功克隆结核分枝杆菌重组蛋白Rv3117,其能够诱导C57BL/6小鼠的免疫应答.     

H37Rv结核标准菌株构建豚鼠膝关节滑膜结核模型的研究

目的探索利用H37Rv结核标准菌株构建豚鼠膝关节滑膜结核病理模型的方法。方法对经过福氏佐剂免疫和致敏的豚鼠,行膝关节腔H37Rv菌株两种菌量(1×107/mL,50μL及100μL)的注射感染,观察豚鼠感染结核菌后膝关节滑膜组织及关节软骨与骨的病理变化,并行膝关节滑膜集菌培养。结果豚鼠膝关节在行两种菌量的H37Rv菌株感染后,局部肿胀均较明显,但动物的全身反应都较轻微。两组动物的膝关节滑膜病理切片均显示有典型的结核结节及其内的干酪样坏死灶形成;切片抗酸染色均检出有抗酸染色阳性的分枝杆菌;两组动物的关节滑膜匀浆培养均有结核分枝杆菌生长。结论通过在经预先免疫与致敏豚鼠的膝关节局部进行适当剂量的H37Rv结核菌株的注射感染,可以构建出与人类滑膜结核病理变化相似的豚鼠膝关节滑膜结核。     

结核分枝杆菌特异性蛋白片段Rv3388和6种特异抗原在结核抗体检测中的应用价值

目的 对结核分枝杆菌( MTB) PE家族的所有成员的结构进行分析,预测其抗原表位,截取Rv3388蛋白的优势抗原片段,对重组Rv3388蛋白及其它6种MTB特异性抗原进行评估,探讨不同结核特异性抗原与血清抗体的反应模式,评价血清学检测在结核病诊断中的价值. 方法 利用基因合成技术重叠延伸PCR扩增Rv3388蛋白637~731位的编码基因片段, 原核表达并纯化重组蛋白pET32a/Rv3388637-731 ,将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA法对该抗血清进行免疫原性分析. 同时对这7种MTB特异性蛋白的特异性及敏感性进行评价. 结果 重组蛋白pET32a/Rv3388637-731在大肠杆菌中的表达量占全菌蛋白的80%,ELISA显示有较强的免疫原性. 7 种 MTB特异性抗原具有不同的反应模式,单个抗原检测敏感性较差. 结论 对MTB PE家族的蛋白结构分析,表达并纯化重组蛋白pET32a/ Rv3388637-731 ,7种蛋白在血清抗体检测中具有抗原互补性,不同抗原与机体反应存在不同反应模式,提高结核抗体检测敏感性应多种抗原联合检测.     

结核杆菌H37Rv异柠檬酸裂解酶基因的克隆及表达

目的构建在大肠杆菌中高效表达结核杆菌H37Rv异柠檬酸裂解酶(ICL)的重组质粒,实现ICL在原核表达系统的高效稳定表达.方法采用PCR和克隆技术构建含有结核杆菌H37Rv ICL基因的表达质粒pET30(a)-Rv0467,转化至E.coli BL21(DE3)中诱导表达.目的蛋白经金属螯合层析纯化后,对其活性进行初步研究.结果构建了高效表达结核杆菌H37Rv ICL的质粒;在E.coli BL21(DE3)中得到高效表达,目的蛋白占总蛋白含量的30%;表达产物以可溶性形式存在,通过金属螯合层析纯化,所得酶的纯度为90%;目的蛋白具有ICL的活性.结论利用原核表达系统成功克隆表达了结核杆菌H37Rv的ICL,为以ICL为靶点建立新型抗结核药物奠定了基础.     

脾切除对小鼠腹腔巨噬细胞数量和功能的影响

目的：研究脾切除对小鼠腹腔巨噬细胞数量和功能活性的影响。方法：术后4周获取腹腔常居巨噬细胞和炎症巨噬细胞,检测其数量、吞噬功能和一氧化氨水平。结果：与正常对照组和假手术组比较,脾切除组小鼠的2种巨噬细胞不仅数量明显减少,而且它们的吞噬功能和一氧化氮水平呈明显下降。结论：提示脾切除造成的单核吞噬细胞继发性炎症反应的捐伤和巨噬细胞功能活性的降低,可能是脾切除后(凶险性)感染的重要因素。     

淋巴结核丸对H37Rv、耐多药结核菌体外药敏实验研究

目的:淋巴结核丸对强毒人型结核菌(H37Rv)及耐多药结核菌(mutiple drugs resistant Bacillus tuberculosis,MDR-TB)在体外药敏实验。方法:用美国B-D公司生产试剂12B培养液和Bectec-460检测仪检测。结果:实验表明淋巴结核丸对H37Rv具有抑制作用,最低抑菌浓度为22.5mg/ml;对MDR-TB具有显著的抗菌作用P<0.01,最低抗菌浓度为22.5mg/ml,而对照药异烟肼、利福平、乙胺丁醇无抑菌作用。结论:用淋巴结核丸对H37Rv、MDR-TB均具有抑菌作用。