SHP2表达变化对四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠肝组织中Akt表达的影响

目的 探讨含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)过表达及低表达对四氯化碳（CCl4）诱导的肝纤维化大鼠肝组织中蛋白激酶B(Akt)的影响。方法选取160只健康雄性SD大鼠,随机分为对照组、模型组、AdGFP组、Ad-SHP2组和Ad-shRNA/SHP2组,每组32只。采用腹腔注射CCl4法构建大鼠肝纤维化模型,经大鼠尾静脉分别将表达绿色荧光蛋白（GFP）的空病毒Ad-GFP、表达野生型SHP2及GFP的腺病毒Ad-SHP2、表达GFP并携带靶向SHP2的短发夹RNA(shRNA)的腺病毒Ad-shRNA/SHP2注入大鼠体内。各组分别于造模第2、4、6、8周随机选取8只大鼠,留取肝组织标本。采用实时荧光定量PCR法检测各组大鼠肝组织中SHP2、Akt的mRNA表达水平,采用蛋白质印迹法检测各组大鼠肝组织中SHP2、Akt及磷酸化Akt(p-Akt)的蛋白表达水平,采用H-E染色法观察各组大鼠肝组织的病理变化,采用Masson三色染色法观察各组大鼠肝组织的胶原沉积情况。结果 靶向SHP2的shRNA及外源性野生型SHP2基因成功导入肝纤维化大鼠体内,并使大鼠肝组织中SHP2呈低...     

沉默热休克蛋白70-2基因经线粒体依赖通路介导肝癌细胞凋亡

目的 探讨沉默热休克蛋白(HSP)70-2对肝癌细胞生长、凋亡的影响,以及诱导肝癌细胞凋亡的详细作用机制. 方法 Westem blot、免疫细胞化学法检测HSP70-2在4种肝癌细胞和正常肝细胞中的表达.设计合成针对HSP70-2基因的特异性短发夹状RNA(shRNA),构建真核表达载体HSP70-2 shRNA1和HSP70-2 shRNA2.转染肝癌细胞后,四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖,膜联蛋白/碘化丙啶双染法检测细胞凋亡情况,罗丹明染色检测细胞线粒体跨膜电位变化,Western blot检测多聚ADP-核糖聚合酶、caspase-3、caspase-9蛋白切割情况,以及细胞色素C、Bax,Bcl-2蛋白的表达变化. 结果 HSP70-2在4种肝癌细胞中均高表达,在L02细胞中仅有微量表达.HSP70-2 shRNA1、shRNA2均能有效抑制肝癌细胞中HSP70-2的表达.沉默HSP70-2基因显著抑制肝癌细胞生长,诱导肝癌细胞凋亡,转染48 h后,shRNA1和shRNA2诱导HepG2细胞的凋亡指数分别为55.8%±1.8%和57.1%±1.6%,诱导Huh细胞凋亡指数分别为54.9%±1.1%和60.2%±2.6%,与对照组相比,差异均有统计学意义,P值均＜0.01.转染HSP70-2 shRNA 48 h后,肝癌细胞线粒体跨膜电位显著下降,细胞色素C从线粒体释放到胞质中,caspase-3、caspase-9激活,多聚ADP核糖聚合酶被剪切降解,抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少,促凋亡蛋白Bax表达明显增加.结论 沉默HsP70-2能通过激活线粒体凋亡通路导致肝癌细胞凋亡.     

齐墩果酸靶向Bcl-2诱导鼻咽癌细胞发生线粒体主导的凋亡

目的 探索齐墩果酸(OA)对高分化鼻咽癌细胞CNE-1的抑制作用并阐明其机制。方法 选择不同浓度OA处理CNE-1细胞，CCK-8实验检测细胞活力，膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染法和流式细胞术分析细胞凋亡情况。检索数据库ChEMBL筛选OA调控细胞凋亡的潜在靶点，通过Western印迹检测细胞凋亡相关蛋白表达情况。结果 OA导致CNE-1细胞活力降低与细胞凋亡增加。靶标预测发现抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl)-2是OA的潜在靶点。Western印迹结果也证实OA导致线粒体凋亡相关蛋白Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3水平增加，而Bcl-2水平下降。结论 OA能够靶向Bcl-2通过线粒体途径诱导鼻咽癌细胞CNE-1的凋亡，有望作为鼻咽癌治疗的候选药物。     

沉默ATAD2增加乳腺癌细胞放疗敏感性

目的研究沉默三磷酸腺苷酶家族蛋白(ATAD)2对乳腺癌细胞放疗敏感性的影响。方法以乳腺癌细胞MDA-MB-231作为探讨对象,在乳腺癌细胞中转染ATAD2 shRNA载体,以Realtime PCR和Western印迹检测细胞中ATAD2表达水平。噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖,碘化丙啶(PI)单染法检测细胞周期,膜联蛋白(Annexin) V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,Western印迹检测细胞中激活型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3、细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)4、p21蛋白表达水平,克隆形成实验检测放射敏感性。结果转染ATAD2 shRNA载体后的乳腺癌细胞中ATAD2表达水平降低。沉默ATAD2或放射处理后的乳腺癌细胞增殖能力降低,G0/G1期细胞比例增多,细胞凋亡率升高,细胞中Cleaved Caspase-3、p21蛋白水平升高,CDK4蛋白水平降低。沉默ATAD2和放射共同处理后的乳腺癌细胞增殖能力下降,细胞凋亡率升高,细胞中Cleaved Caspase-3、p21蛋白水平升高,CDK4蛋白水平降低,与沉默ATAD2或放射处理后的乳腺癌细胞比较,差异有统计学意义(P0.05)。沉默ATAD2后的乳腺癌细胞放射增敏比为1.396。结论沉默ATAD2协同放射诱导乳腺癌细胞凋亡,抑制乳腺癌细胞增殖并阻滞细胞周期,沉默ATAD2具有提高乳腺癌细胞放射敏感性的作用。     

survivin基因shRNA真核表达载体的构建及其对人胃癌细胞株中survivin表达的影响

背景:胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员,在胃癌组织中高表达。目的:构建survivin基因短发夹RNA(shRNA)真核表达载体并观察其对人胃癌细胞株BGC823和SGC7901中survivin表达的影响。方法:根据GenBank中survivin基因序列设计并合成能转录shRNA的双链DNA序列,插入含有绿色荧光蛋白(GFP)基因和U6启动子的真核表达载体pRNAT-U6.3中,构建重组载体pRNA-shSUR。重组载体经鉴定后转染胃癌细胞株BGC823和SGC7901,以转染pRNA-shControl作为阴性对照。荧光显微镜下观察转染情况,蛋白质印迹法检测survivin蛋白表达,Annexin V-FITC/PI双染法检测胃癌细胞凋亡情况。结果:成功构建了针对survivin基因的shRNA表达载体。转染胃癌BGC823和SGC7901细胞48 h后,与阴性对照组相比,pRNA-shSUR组GFP表达增强,survivin蛋白表达受到明显抑制(P<0.05),胃癌细胞早期凋亡率明显增加。结论:成功构建靶向survivin基因的特异性shRNA真核表达载体,转染胃癌细胞后可抑制survivin蛋白表达并促进细胞凋亡,为进一步研究survivin基因与胃癌生物学行为以及化疗耐药等的相关性奠定了基础。     

过表达肌浆网钙三磷酸腺苷酶抑制缺氧诱导心肌细胞凋亡的研究

目的研究过表达肌浆网钙ATP酶2a(SERCA2a)能否提高心肌细胞对缺氧的耐受性,评价其对心肌细胞凋亡的影响。方法体外培养的SD乳鼠心肌细胞随机分为对照组、缺氧组、过表达SERCA2a组和SERCA2a+缺氧组,以携带SERCA2a基因的重组腺病毒转染心肌细胞48 h后对其进行缺氧处理。Western blot法检测细胞质内SERCA2a蛋白及Caspase-3表达的变化;膜联蛋白V/碘化丙啶双染色法及流式细胞术检测心肌细胞凋亡率;激光共聚焦显微镜检测细胞质内Ca~(2+)浓度变化。结果与对照组比较,缺氧组SERCA2a蛋白表达水平显著降低,过表达SERCA2a组蛋白含量升高2.5倍(P<0.05),缺氧组Caspase-3蛋白表达升高53.1%,过表达SERCA2a后给予缺氧处理,Caspase-3蛋白表达降低39.7%(P<0.05)。与对照组比较,缺氧组心肌细胞凋亡率显著升高,与缺氧组比较,SERCA2a+缺氧组细胞凋亡率显著下降(P<0.05)。与对照组比较,缺氧组细胞质内Ca~(2+)荧光强度显著升高;与缺氧组比较,SERCA2a+缺氧组细胞质内Ca~(2+)荧光强度显著降低(P<0.05)。结论过表达SERCA2a可减轻细胞内Ca~(2+)超载和抑制Caspase-3激活,进而减少缺氧诱导的心肌细胞凋亡。     

红系衍生核因子相关因子2基因在芬维A胺诱导NB4细胞凋亡中的作用

目的:研究干扰红系衍生核因子相关因子2(NRF-2)基因表达对芬维A胺诱导NB4白血病细胞凋亡的影响,探寻白血病治疗的新思路。方法:采用核转染技术将NRF-2的小干扰RNA(siRNA)转入NB4细胞干扰NRF-2的表达,然后再用芬维A胺(1μmol/L)处理NB4细胞,24、48 h后应用流式细胞术膜联蛋白(Annexin-V)异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)双标记法检测细胞凋亡情况。结果:1μmol/L芬维A胺能明显诱导NB4细胞凋亡,并呈时间依赖性和药物剂量依赖性,在凋亡发生过程中NRF-2的mRNA和蛋白水平有上升趋势。通过RNA干扰NRF-2表达后,NRF-2的mRNA以及蛋白水平都明显下降,芬维A胺诱导NB4细胞凋亡的效能也随之减弱。流式细胞术分析干扰组细胞凋亡率仅(29.90±2.45)%,明显低于非干扰组的(43.85±14.40)%(P=0.001)。结论:NRF-2在芬维A胺诱导NB4细胞凋亡过程中扮演着重要的角色,提示芬维A胺可能通过氧化应激途径诱导细胞凋亡。通过这样的途径,设计提高白血病细胞的氧化应激能力可能成为靶向治疗白血病的新途径。     

Racl shRNA对卵巢癌细胞株Skov3生物学行为的影响

目的 为Racl shRNA治疗卵巢癌提供实验依据.方法 Racl shRNA载体pGPU6/GFP/Racl-524以LipofectimineTM2000介导转染卵巢癌细胞株Skov3,Transwell肿瘤细胞迁移和侵袭实验检测转染细胞的迁移和侵袭能力,Western印迹分析转染细胞MMP2蛋白的表达情况.结果 转染Racl shRNA载体pGPU6/GFP/Racl-524组、转染非特异shRNA载体pGPU6/GFP/NC组和未转染组迁移到滤膜底面的细胞数分别为97±21、319±75、365±92.而侵袭到滤膜底面的细胞数分别为79±22、285±63、324±84,转染Racl shRNA载体组与转染pGPU6/GFP/NC组、未转染组比较差异显著(P<0.05),转染pGPU6/GFP/NC组与未转染组相比无统计学意义(P>0.05).转染Racl shRNA载体pGPU6/GFP/Racl-524组MMP2蛋白的表达量下降.结论 Racl shRNA载体pGPU6/GFP/Racl-524可有效抑制卵巢癌细胞Skov3的迁移和侵袭,该抑制作用可能是通过调控MMP2的表达而实现的.     

Rac1 shRNA对卵巢癌细胞株Skov3生物学行为的影响

目的为Rac1 shRNA治疗卵巢癌提供实验依据。方法 Rac1 shRNA载体pGPU6/GFP/Rac1-524以L ipofectim ineTM2000介导转染卵巢癌细胞株Skov3,Transwell肿瘤细胞迁移和侵袭实验检测转染细胞的迁移和侵袭能力,W estern印迹分析转染细胞MMP2蛋白的表达情况。结果转染Rac1 shRNA载体pGPU6/GFP/Rac1-524组、转染非特异shRNA载体pGPU6/GFP/NC组和未转染组迁移到滤膜底面的细胞数分别为97±21、319±75、365±92,而侵袭到滤膜底面的细胞数分别为79±22、285±63、324±84,转染Rac1 shRNA载体组与转染pGPU6/GFP/NC组、未转染组比较差异显著(P<0.05),转染pGPU6/GFP/NC组与未转染组相比无统计学意义(P>0.05)。转染Rac1 shRNA载体pGPU6/GFP/Rac1-524组MMP2蛋白的表达量下降。结论 Rac1 shRNA载体pGPU6/GFP/Rac1-524可有效抑制卵巢癌细胞Skov3的迁移和侵袭,该抑制作用可能是通过调控MMP2的表达而实现的。     

miR-217靶向SPRY1调控血管内皮细胞增殖和凋亡的分子机制

目的探讨miR-217对血管内皮细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法运用25μmol/ml高糖建立血管内皮细胞EAhy926损伤;运用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞中miR-217、软脂酰化磷蛋白(SPRY1)的表达;将HG+anti-miR-con组(转染anti-miR-con)、HG+anti-miR-217组(转染anti-miR-217)、HG+pcDNA组(转染pcDNA)、HG+pcDNA-SPRY1组(转染pcDNA-SPRY1)、HG+anti-miR-217+si-con组(共转染anti-miR-217和si-con)、HG+anti-miR-217+si-SPRY1组(共转染anti-miR-217和si-SPRY1)用脂质体法转染至EAhy926细胞,再用高糖处理;Western印迹检测细胞中SPRY1、细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂(p21)、B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的蛋白表达;噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染法检测细胞凋亡;双荧光素酶报告基因实验检测miR-217与SPRY1的靶向结合关系。结果成功建立高糖诱导的血管内皮细胞EAhy926;与NG组相比,HG组细胞中miR-217表达明显上调,SPRY1表达明显下调(P 0.05);抑制miR-217、过表达SPRY1均可促进高糖诱导的EAhy926细胞增殖,抑制凋亡,上调p21、Bcl-2,下调Bax;miR-217可抑制野生型SPRY1细胞的荧光活性,负向调控SPRY1表达;敲减SPRY1可逆转抑制miR-217对高糖诱导的EAhy926细胞增殖、凋亡的调控及相关蛋白表达的影响。结论 miR-217可调控血管内皮细胞的增殖、凋亡,其机制可能与靶向SPRY1有关,可为高糖引起的心血管疾病的治疗提供新方向。     

腺病毒介导的靶向P85和Akt1短发夹RNA对人胃腺癌细胞生长抑制作用的研究

目的 构建靶向P85和蛋白激酶B1(PKB1/Akt1)的短发夹RNA(shRNA)腺病毒载体,研究其对人胃腺癌细胞SGC-7901生长的抑制效果.方法 构建腺病毒载体rAd5-P+A,体外转染SGC-7901细胞后,以实时定量PCR和Western blot分别检测P85和Akt1的mRNA和蛋白质的表达.以噻唑蓝比色分析法(MTT法)和流式细胞法评价转染后胃癌细胞的增殖活性.构建裸鼠皮下荷瘤模型进一步观察rAd5-P+A对SGC-7901细胞生长的抑制效果,并应用原位末端标记技术(TUNEL法)检测肿瘤细胞的凋亡情况.结果 成功构建的rAd5-P+A重组腺病毒载体转染SGC-7901细胞后可显著抑制p85和Akt1的mRNA表达,而P85和Aktl蛋白表达量在转染48 h、72 h后分别下调57.5%、63.7%和67.8%、75.6%,与空白对照组和通用腺病毒对照(rAd5-HK)组相比,差异具有统计学意义(P=0.005,P=0.003).与空白对照组和rAd5-HK组相比,SGC-7901细胞的增殖活性在rAd5-P+A转染后第2天明显下降(P<0.001),且rAd5-P+A转染组进入S期的细胞数减少了5.9%～7.1%,而进入G0/G1期的细胞增加了12.1%～13.7%.裸鼠皮下荷瘤模型治疗实验也显示,rAd5-P+A可抑制胃癌细胞的生长,诱导细胞的凋亡.结论 腺病毒介导的靶向P85和Akt1的shRNA可抑制人胃腺癌细胞的生长,这可能为胃腺癌靶向性联合基因治疗提供新的策略.     

腺病毒介导的靶向P85和Akt1短发夹RNA对人胃腺癌细胞生长抑制作用的研究

目的 构建靶向P85和蛋白激酶B1(PKB1/Akt1)的短发夹RNA(shRNA)腺病毒载体,研究其对人胃腺癌细胞SGC-7901生长的抑制效果.方法 构建腺病毒载体rAd5-P+A,体外转染SGC-7901细胞后,以实时定量PCR和Western blot分别检测P85和Akt1的mRNA和蛋白质的表达.以噻唑蓝比色分析法(MTT法)和流式细胞法评价转染后胃癌细胞的增殖活性.构建裸鼠皮下荷瘤模型进一步观察rAd5-P+A对SGC-7901细胞生长的抑制效果,并应用原位末端标记技术(TUNEL法)检测肿瘤细胞的凋亡情况.结果 成功构建的rAd5-P+A重组腺病毒载体转染SGC-7901细胞后可显著抑制p85和Akt1的mRNA表达,而P85和Aktl蛋白表达量在转染48 h、72 h后分别下调57.5%、63.7%和67.8%、75.6%,与空白对照组和通用腺病毒对照(rAd5-HK)组相比,差异具有统计学意义(P=0.005,P=0.003).与空白对照组和rAd5-HK组相比,SGC-7901细胞的增殖活性在rAd5-P+A转染后第2天明显下降(P<0.001),且rAd5-P+A转染组进入S期的细胞数减少了5.9%～7.1%,而进入G0/G1期的细胞增加了12.1%～13.7%.裸鼠皮下荷瘤模型治疗实验也显示,rAd5-P+A可抑制胃癌细胞的生长,诱导细胞的凋亡.结论 腺病毒介导的靶向P85和Akt1的shRNA可抑制人胃腺癌细胞的生长,这可能为胃腺癌靶向性联合基因治疗提供新的策略.     

腺病毒介导短发夹RNA沉默Nkx2.5基因对乳鼠心肌细胞的影响

目的探讨腺病毒介导短发夹RNA下调Nkx2.5基因表达对体外培养大鼠乳鼠心肌细胞(NRVMs)的影响。方法采用胰酶和Ⅱ型胶原酶混合消化法分离NRVMs,随机分为阴性对照组(NC组)和实验组。实验组转染携带靶向Nkx2.5的RNA干扰序列(短发夹RNA,shRNA)和绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒Ad-Nkx2.5-shRNA-GFP,NC组转染等量的仅携带GFP的对照组腺病毒Ad-GFP。以不同感染复数(MOI)转染细胞选取最适MOI,按最适MOI转染NRVMs 48h后,采用实时荧光聚合酶链式反应和蛋白质免疫印迹检测Nkx2.5沉默效果,保证沉默效果之后,检测起搏细胞发育相关转录因子(Tbx3、Tbx18、Shox2和Isl1)、起搏相关离子通道超极化激活环核苷酸门控通道4型(HCN4)和缝隙链接蛋白40(Cx40)mRNA和蛋白水平变化,采取免疫荧光法检测HCN4蛋白的表达。结果分离培养的原代NRVMs 48h呈现成簇搏动,α-actin检测心肌纯度达0.91±0.01,转染NRVMs的最适MOI=20,构建的病毒可有效下调Nkx2.5水平(P<0.05);下调心肌细胞Nkx2.5水平后,起搏细胞发育相关转录因子、HCN4表达水平升高(P<0.05),心室肌相关缝隙连接蛋白Cx40表达水平下降(P<0.05)。荧光显微镜观察实验组红色荧光即离子通道HCN4表达强于对照组。结论下调Nkx2.5可将NRVMs重编程为起搏样细胞。     

靶向封闭EEF1A2对胰腺癌细胞凋亡的作用及其机制研究

目的 观察靶向封闭EEF1A2基因对胰腺癌细胞株凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制.方法 体外转录制备2对EEF1A2 siRNA,应用脂质体技术转染胰腺癌细胞株BxPC-3,半定量RT-PCR、蛋白质印迹法检测转染前后EEF1A2基因表达的变化.运用膜联蛋白V/碘化丙啶法检测细胞凋亡率;蛋白质印迹法检测细胞中caspase-3、caspase-8、caspase-9、聚二磷酸腺苷核糖多聚酶(PARP)细胞色素C和Bid等凋亡相关蛋白表达变化.结果 2对EEF1A2 siRNA均能有效降低BxPC-3细胞中EEF1A2的表达,其中第2对siRNA静默效果更佳,EEF1A2在mRNA和蛋白质水平的表达抑制率均达75%左右.抑制BxPC-3细胞中EEF1A2的表达后,细胞的早期凋亡率为15.28%±3.65%,显著高于阴性对照组的10.11%±3.05%和空白组的9.41%±4.14%,同时伴随出现caspase-3、caspase-8、caspase-9、PARP和Bid的蛋白活化增强和细胞色素C表达增加.结论 抑制EEF1A2表达能明显诱导胰腺癌细胞BxPC-3的凋亡,而死亡受体途径和线粒体途径的激活可能均参与凋亡的发生.     

Rac1shRNA对卵巢癌细胞株Skov3细胞周期及凋亡的影响

目的 为Rac1 shRNA应用于卵巢癌治疗提供实验依据.方法 将筛选的有效的Rac1 shRNA载体pGPU6/GFP/Rac1-524以LipofectimineTM2000介导转染卵巢癌细胞株Skov3,48 h后收集细胞,RT-PCR检测转染细胞cyclin D1 mRNA的表达;将转染细胞标记AnnexinⅤ,流式细胞术检测分析转染细胞的凋亡情况.结果 转染Rac1 shRNA pGPU6/GFP/Rac1-524的卵巢癌细胞株Skov3的cyclin D1 mRNA表达量下降;Annexin Ⅴ阳性细胞数(54%)明显高于未转染组(5.6%);Annexin Ⅴ和PI双阳性的细胞数(32.3%)也明显高于未转染组(3.2%).结论 Rac1 shRNA pGPU6/GFP/Rac1-524可以下调cyclin D1的表达,并促使Skov3细胞凋亡.     

shRNA介导mcl-1基因沉默对人肝癌细胞HepG2凋亡的影响

目的观察shRNA介导mcl-1基因沉默对肝癌细胞HepG2的凋亡作用。方法构建靶向mcl-1基因的shRNA表达载体，经脂质体介导将其转入HepG2细胞内，48h后利用RT—PCR和Westernblot检测mcl-1mRNA和蛋白水平，Hoechst染色进行凋亡形态学观察，流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果所构建的shRNA表达载体能明显降低HepG2细胞内mcl-1mRNA和蛋白水平。转染shRNA表达载体的细胞经Hoechst染色出现明显凋亡核形态学表现。经流式检测，shRNA组的凋亡率明显高于阴性对照组（7．74％±0．97％vs2．81％±0．46％，P=0．001）。结论shRNA介导mcl-1基因沉默可导致HepG2细胞凋亡，靶向mcl-1基因的RNA干扰可能是肝癌治疗的有效途径之一。     

血管内皮生长因子-A siRNA对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响及机制

目的通过RNA干扰技术特异性地使人肝癌细胞株Hep G2中血管内皮生长因子(VEGF)-A表达下调,检测细胞凋亡率变化及pAkt、生成素、caspase-3表达。方法采用脂质体介导将针对靶基因VEGF-A的小片段RNA导入人Hep G2细胞内,用Western印迹和RT-PCR技术检测人Hep G2细胞内VEGF-A、p-Akt、生成素、caspase-3的表达,用膜联蛋白(Annexin-V)/碘化丙啶(PI)双标记流式细胞术检测细胞凋亡。结果细胞转染成功后,VEGF-A siRNA组VEGF-A mRNA表达量显著降低,较RNA干扰组下降80.88%(0.26±0.07 vs 1.36±0.05,P0.01),VEGF-A蛋白表达量显著降低,较RNA干扰组下降75.34%(0.18±0.02 vs 0.73±0.06,P0.01);细胞凋亡率增加,VEGF-A siRNA组较RNA干扰组增高21.96%(28.21%±1.75%vs 6.25%±0.82%,P0.01)。伴随p-Akt和生存素蛋白水平降低和caspase-3表达上调(P0.01)。结论通过RNA干扰技术特异性地使人肝癌细胞株Hep G2中VEGF-A表达下调,可以诱导Hep G2细胞发生凋亡,这可能是通过PI3K/p-Akt/生存素信号转导通路实现的。     

虾青素对碘海醇诱导的大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的观察虾青素(AST)对碘海醇(I)诱导的大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响。方法大鼠肾小管上皮细胞株(NRK-52E)正常培养生长80%后,随机分为空白对照(Control)组、溶剂对照(DMSO)组、I组、AST预处理(AST+I)组、AST预处理+沉默信息调节因子2相关酶(SIRT)1抑制剂烟酰胺(AST+I+NA)组,I+SIRT1抑制剂(I+NA)组。不同因素干预细胞后,采用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色检测细胞凋亡的形态学变化;膜联蛋白(Annexin)-V-FITC/碘化丙啶(PI)双标流式细胞仪检测细胞凋亡率;线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)荧光探针检测线粒体膜电位;Western印迹检测SIRT1、P53、Bax和Bcl-2蛋白表达。结果 AST能显著减轻I诱导的大鼠肾小管上皮细胞凋亡,稳定线粒体膜电位,显著上调SIRT1蛋白表达,显著减少线粒体凋亡相关蛋白P53、Bax表达,显著增加Bcl-2表达(均P0.05)。结论 AST可能通过上调SIRT1蛋白表达,稳定线粒体膜电位,调控细胞凋亡相关蛋白表达对I诱导的大鼠肾小管上皮损伤发挥保护作用。     

shRNA沉默干扰HMGA2基因对胃癌细胞株MKN-45的增殖与凋亡的影响

目的:观察小分子RNA(shRNA)沉默后HMG-A2基因在胃癌细胞株MKN-45的表达,并探讨HMGA2基因对胃癌细胞的增殖与凋亡的影响.方法:构建针对人HMGA2基因的shRNA真核表达载体,瞬时转染人胃癌细胞株MKN-45.用细胞免疫组化的方法观察转染72h后HMGA2的蛋白表达水平,以MTT比色法、流式细胞术检测转染后MKN-45细胞的生长增殖、凋亡的情况.结果:转染HMGA2-shRNA组的蛋白表达强度(171.34±19.61)明显弱于scrambled组(143.48±19.04)和空白对照组(141.79±18.09,P<0.05),较之scrambled组(5.66%±0.63%)和空白对照组,HMGA2-shRNA组(39.32%±2.37%)能明显抑制细胞的增殖(P<0.05),HMGA2-shRNA组的凋亡率(39.67%±2.35%)与scrambled组(4.29%±1.33%)和空白对照组(5.05%±1.84%)相比明显增加(P<0.05).结论:靶向HMGA2基因的shRNA可以有效抑制人胃癌MKN-45细胞的生长,并促进细胞的凋亡,HMGA2可能是胃癌治疗的一个潜在靶点.     

野生型PTEN基因对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖、凋亡和侵袭活性的影响

目的 探讨外源性野生型PTEN基因对人多发性骨髓瘤(MM)细胞株RPMI8226增殖、凋亡、侵袭活性的影响以及PTEN/FAK信号传导通路在细胞侵袭活性中的作用.方法 将携带人野生型PTEN及绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-PTEN-GFP)及空载体腺病毒(Ad-GFP)体外转染至RPMI8226细胞.通过MTT法检测细胞生长曲线,Hoechst33342染色检测细胞凋亡,荧光定量PCR(FQ-PCR)检测PTEN及FAK mRNA水平变化,Western印迹检测PTEN、FAK及p-FAK蛋白变化,Transwell小室检测RPMI8226细胞侵袭能力.结果 Ad-PTEN-GFP以感染复数为100转染RPMI8226细胞后,第4天达到最大生长抑制率为42.01%,Ad-PTEN-GFP转染RPMI 8226细胞72 h后细胞凋亡率为(35.02±6.80)%,PTEN mRNA及蛋白表达升高,FAK mRNA以及FAK、p-FAK蛋白表达下调,与Ad-GFP组相比差异显著(P<0.01,P<0.05);Transwell小室结果显示,转染Ad-PTEN-GFP组漏入下室内及黏附于下室面细胞数量较Ad-GFP组显著减少(P<0.01).结论 转染野生型PTEN基因的RPMI8226细胞增殖受抑,凋亡增加,细胞侵袭力明显减弱,其作用可能与下调FAK、p-FAK表达有关.