抑制层黏素受体过表达在胆管癌细胞免疫逃逸中的作用

目的 探讨抑制层黏素受体(LNR)过表达下调Fas配体基因表达在胆管癌免疫逃逸中的作用.方法 采用流式细胞仪分选出过表达层黏素受体的胆管癌细胞QBC939,用脂质体转染法转染层黏素受体RNA干扰质粒和阴性对照质粒各6 μg至过表达层黏素受体的胆管癌细胞QBC939中,用实时荧光定量PCR法检测未转染组、阴性组和阳性组QBC939细胞Fas配体基因的表达情况.结果 分选后的QBC939细胞层黏素受体的表达率高达95%,继续转染层黏素受体RNA干扰质粒后,其FasL基因表达水平较未转染组和转染阴性对照质粒组明显降低.结论 LNR过表达在胆管癌免疫逃逸中的作用可能是通过Fas-FasL信号通路实现的.     

反义抑制C-myc蛋白表达对人胆管癌细胞株体外增殖的影晌

【目的】探讨反义抑制C-myc蛋白的表达对人胆管癌细胞QBC939体外增殖的影响。【方法】采用常规方法培养QBC939细胞，合成C-mycASODN及Ns0DN，并将其转染QBC939细胞；用Western-blot法检测转染AS（）DN组（转染组）、转染NSODN组（无义组）及空白对照组细胞中c-myc蛋白的表达；通过四甲基噻唑蓝（MTT）实验检测各组细胞在体外的存活率。【结果】无义组与空白对照组灰度值比较无显著性差异（P〉0．05）；转染组的灰度值显著低于空白对照组（P〈0．01）；转染不同浓度（Mmol／L）的cmycASODN后，各组细胞的存活率分别为：0．5组为79．6％、1．0组为75．0％、2．0组为70．9％、4．0组为59．1％、8．0组为47．3％，均显著低于空白对照组（P〈0．01）。【结论】反义抑制c-myc蛋白的表达后，人胆管癌细胞在体外的增殖受到了抑制，且其抑制作用随着c-mycASODN浓度的增加而增强。     

槲皮素与FSCN1基因siRNA联合对卵巢癌生长抑制及免疫功能的影响研究

目的探讨槲皮素与FSCN1基因siRNA对卵巢癌细胞活力、凋亡及免疫功能的影响及机制。方法人卵巢癌SKOV3细胞分为空白对照组、NC组(转染阴性对照siRNA)、槲皮素组(50μmol/L的槲皮素处理细胞后瞬时转染阴性对照siRNA)、si-FSCN1组(细胞转染靶向抑制FSCN1的siRNA)和槲皮素+si-FSCN1组(50μmol/L的槲皮素处理细胞后瞬时转染靶向抑制FSCN1的siRNA),siRNA转染参照Lipofectamine TM 2000说明。各组细胞处理48 h,Western blotting检测FSCN1、β-catenin、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、Bax和血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白表达;MTT检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果 SKOV3细胞转染si-FSCN1后FSCN1蛋白表达明显降低,与空白对照组比较差异显著(P0.05)。槲皮素组和si-FSCN1组细胞活力及β-catenin、cyclin D1和VEGF的蛋白表达均显著低于NC组,高于槲皮素+si-FSCN1组,细胞凋亡率及Bax蛋白表达显著高于NC组,低于槲皮素+si-FSCN1组(P0.05)。结论槲皮素或FSCN1基因siRNA均能抑制卵巢癌细胞活力,诱导细胞凋亡,抑制免疫抑制因子VEGF表达,联合使用效果更强,机制与下调Wnt/β-catenin信号通路有关。     

siRNA抑制人胶质瘤细胞MDM2的表达及细胞增殖

目的研究siRNA对人胶质瘤U251细胞MDM2基因表达的抑制作用及对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法体外合成2对针对MDM2基因的siRNA,经脂质体转染导入U251细胞;用半定量RT-PCR检测siRNA MDM2对MDM2基因表达的抑制作用;并用MTT法检测siRNA MDM2对细胞增殖抑制作用,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果转染siRNA MDM2的细胞的MDM2基因表达分别下调到对照组的31.61%和40.18%;转染阴性对照质粒的MDM2基因没有明显改变。MTT结果表明转染siRNA MDM2后细胞生长受到抑制,与对照组比差异具有显著性（P〈0.5）;同时细胞发生凋亡和细胞周期阻滞,转染siRNA MDM2-1,2的凋亡率分别为49.9%和40.0%,转染阴性对照质粒和对照组未检测出明显的增殖抑制和凋亡改变。结论 siRNA MDM2可以有效抑制U251细胞株中MDM2的表达,并抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

靶向survivin的siRNA并氟尿嘧啶转染对HepG2增殖影响

目的研究靶向survivin的小分子干扰RNA（siRNA）和氟尿嘧啶（5-FU）联用对肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用及对凋亡的影响。方法将HepG2细胞分为空白对照组、阴性对照组、5-FU处理组、siRNA转染组及5-FU＋siRNA转染组。转染采用脂质体法。采用RT-PCR法分别检测HepG2细胞survivin mRNA转录水平;MTT法分别检测靶向survivin的siRNA和5-FU对HepG2细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测HepG2细胞凋亡情况。结果 siRNA转染组、5-FU＋siRNA转染组survivin mRNA表达较空白对照组、阴性对照组、5-FU处理组明显下降（F=326.78,q=5.78～7.12,P〈0.05）。5-FU＋siRNA转染组细胞增殖抑制率为51.58%±1.35%,与其他各组相比明显增高（F=1 293.24,q=15.31～82.26,P〈0.01）。5-FU＋siRNA转染组与其他各组相比细胞凋亡率明显增高（F=13 568.68,q=110.47～327.16,P〈0.01）。结论将靶向survivin的siRNA和5-FU联合应用可以显著抑制肝癌细胞survivin基因表达,并协同抑制HepG2细胞增殖,共同发挥诱导细胞凋亡作用。     

层黏素受体靶向RNA干扰质粒载体的构建

目的 构建层黏素受体RNA干扰质粒,为探讨抑制层黏素受体过表达在胆管癌免疫逃逸中的作用奠定基础.方法 PCR法获得U6启动子序列以及产生siRNA的相应DNA模板序列,将其克隆入pGenesil-3获得RNA干扰载体pGenesil-shLNR.脂质体法将pGenesil-shLNR导入胆管癌细胞QBC939,免疫组化法检测对胆管癌细胞QBC939LNR表达的抑制情况.结果 所构建的载体pGenesil-shLNR能够干扰QBC939细胞中LNR的表达,并且具有新霉素抗性,能够用G-418筛选稳定转化的细胞株.结论 成功构建了抑制胆管癌细胞QBC939表达LNR的RNA干扰质粒载体.     

siRNA对骨肉瘤U2OS细胞株MDM2-mRNA表达的抑制作用

目的 研究载体介导的siRNA（small interfere RNA）技术对骨肉瘤细胞株U20S中MDM2-mRNA表达的抑制作用.方法 依据设计siRNA的原则,以MDM2为靶基因设计并合成有小发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆到载体PGCsilencerTM中构建重组体（PGCsilencerTM-MDM2 siRNA）.实验分转染重组质粒组,转染阴性对照质粒组和只加脂质体的空白组;RT-PCR法观察U20S细胞中MDM2-mRNA表达改变.结果 成功构建发卡样MDM2 siRNA真核表达载体（PGCsilencer TM-MDM2 siRNA）;PGCsilencer TM-MDM2 siRNA转染到U20S细胞后,MDM2-mRNA表达较空白组显著下降（P＜0.05）,转染阴性对照质粒组与空白组无显著差异（P＞0.05）.结论 成功构建PGCsilencer TM-MDM2 siRNA重组体,并能有效抑制U20S细胞中MDM2-mRNA表达.     

环状RNA-PCAC1在肝癌细胞增殖、侵袭和转移中作用机制研究

目的：探讨环状RNA-PCAC1在肝癌细胞中的表达情况及其对肝癌细胞增殖、侵袭和转移的作用机制。方法：采用实时荧光定量PCR检测不同肝癌细胞和正常肝细胞系中circ＿RNA＿PCAC1的表达情况。实验分为siRNA组和NC组,将将circ＿RNA＿PCAC1沉默慢病毒及阴性对照慢病毒感染肝癌细胞。分别采用CCK-8实验,平板克隆形成实验,划痕实验和Transwell实验检测细胞增殖,迁移和侵袭能力。结果：qRT-PCR检测结果显示：circ＿RNA＿PCAC1在人肝癌细胞系Li-7、HepG2、Hep3B中的表达量明显高于HL-7702细胞系（P<0.05）,siRNA组的circ＿RNA＿PCAC1表达水平明显低于NC组（P<0.05）,与NC组细胞相比,siRNA组HepG2细胞明显抑制生长,circ＿RNA＿PCAC1进行siRNA后细胞形成的克隆数目,迁移数目和细胞侵袭数明显减少（P<0.05）。结论：circ＿RNA＿PCAC1在肝癌细胞中表达上调,沉默circ＿RNA＿PCAC1可以明显制肝癌细胞增殖,迁移和侵袭,其为治疗肝癌提供了新思路。     

siRNA抑制人肝癌细胞MDM2表达及细胞增殖的研究

目的探讨siRNA对人肝癌HepG2细胞MDM2基因表达的抑制作用及对增殖的影响。方法体外合成针对MDM2基因的siRNA质粒,转染HepG2细胞株;应用RT-PCR和western blot方法检测siRNA对MDM2和P53基因和蛋白表达的影响,并用MTT法检测siRNA对细胞增殖抑制作用,流式细胞仪检测细胞周期。结果和空白组比转染siMDM2-1,2的HepG2细胞的MDM2基因和蛋白表达减低,而P53基因和蛋白表达增加。阴性对照质粒组的基因表达未见明显改变。转染siRNA MDM2后细胞生长受到抑制,转染siMDM2-1,2和阴性对照质粒后的抑制率分别是46.3%、56.1%和3%。和对照组比较,转染siMDM2-1,2的hepG2细胞的细胞周期发生明显改变,而转染对照质粒的hepG细胞周期未发生明显变化。结论 siRNA MDM2可以有效抑制HepG2细胞株中MDM2的表达,促进P53的表达,同时可以使细胞周期发生变化,这可能是其抑制肿瘤细胞增殖的主要机制之一。     

siRNA沉默表皮生长因子受体蛋白表达对肾癌细胞生物学行为的影响

目的观察在siRNA沉默EGFR基因处理后肾癌细胞的生物学行为情况。方法将肾癌细胞株ACHN分为3组,对照组不进行任何干预,阴性对照转染组使用加入非特异性转染试剂及siRNA干预,观察组使用加入特性性转染试剂及siRNA干预,分别检测3组细胞的EGFR表达量、增殖活性、生长曲线、迁移及侵袭活性。结果经siRNA处理72 h后,观察组细胞EGFR表达水平明显低于阴性对照转染组和对照组;观察组细胞生长活跃能力显著低于对照组和阴性对照转染组,且在处理48 h后RNAi组细胞数显著低于对照组和阴性对照转染组(P0.05);较空白组和阴性对照转染组,观察组细胞生长受到显著抑制(P0.05);12 h时及24 h时观察组细胞划痕距离显著高于对照组和阴性对照转染组(P0.05);12 h时对照组、阴性对照转染组穿膜细胞数差异无统计学意义(P0.05),观察组穿膜细胞数显著低于对照组和阴性对照转染组(P0.05)。结论采用siRNA沉默EGFR蛋白后,可有效改善肾癌细胞的增殖、生长、迁移及侵袭等生物学活性。     

靶向性血小板衍生生长因子siRNA对肝星状细胞增殖的影响

目的探讨小干扰RNA（siRNA）降低血小板衍生生长因子B链（PDGF-B）基因对肝星状细胞（HSCs）增殖与细胞外基质表达的影响。方法构建PDGF-B靶向siRNA重组表达质粒pSilencer3.l-Hlhygro-PDGF-B siR-NA,将重组质粒转染HSCs细胞,噻唑蓝（MTT）法测定转染后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h的增殖抑制率;半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）与免疫印迹检测转染后36 h HSCs细胞PDGF-B表达。放免法检测HSCs细胞株上清液中透明质酸和Ⅲ型前胶原的表达。结果经酶切鉴定和测序结果证实PDGF-B靶向siRNA重组表达载体构建成功,转染重组质粒36 h后,PDGF-B siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3干预组的HSCs增殖抑制率明显高于对照质粒转染组（34.04%、14.89%、25.53%VS 3.19%;均P〈0.01～0.05）;RT-PCR和免疫印迹显示：各siRNA表达质粒阳性HSCs细胞PDGF-B mRNA和蛋白表达明显降低,与空脂质体组及对照质粒组比较,差异具有统计学意义（均P〈0.05）,放免法显示：siRNAs干预组HSCs细胞透明质酸和Ⅲ型前胶原表达明显降低,与空脂质体组及对照质粒组比较,差异具有统计学意义（均P〈0.05）。结论靶向PDGF-B链的siRNA可降低HSCs的PDGF-B基因表达,具有抑制HSCs增殖和分泌细胞外基质的能力。     

RNA干扰MBP-1基因对胃癌细胞SGC-7901增殖影响

目的：探讨 MBP-1（c-myc promter binding protein 1,MBP-1）基因表达沉默对胃癌细胞株 SGC-7901细胞增殖影响。方法实验分3组：空白对照组（未转染胃癌细胞）、阴性对照组（转染错义序列）和干扰组（转染 MBP-1 shRNA）。设计2条针对MBP-1基因的小干扰 RNA 片段及1条阴性对照 siRNA,并构建入 pSIREN-retroQ 质粒。将构建的重组 pSIREN-retroQ 质粒通过 Lipofectamine 2000脂质体转染胃癌 SGC-7901细胞,嘌呤霉素筛选稳转株细胞。Real time PCR 和 Western blot 分别检测MBP-1表达。MTT 法对 MBP-1干扰后 SGC-7901细胞增殖进行检测。结果通过 PCR 扩增阳性克隆及测序,说明已成功构建MBP-1干扰及对照重组 pSIREN-retroQ 质粒。通过 Lipofectamine 2000脂质体将重组质粒转染胃癌 SGC-7901细胞,并通过嘌呤霉素筛选2周,说明已成功构建 MBP-1干扰及对照 SGC-7901稳转株细胞。Real time PCR 检测,干扰组 MBP-1 mRNA 相对表达量与空白对照组相比显著下调（P ＜0.05）。Western blot 检测 MBP-1蛋白表达,干扰组 MBP-1表达量与空白对照组相比也都显著下调。MTT 法检测结果表明,MBP-1干扰组细胞在48、72、96和120 h 增殖能力比空白对照组都有显著的升高（P ＜0.05）。结论下调 MBP-1基因表达能明显促进胃癌细胞 SGC-7901的增殖,从而为胃癌基因治疗提供了新靶点。     

基因芯片技术分析抗癌生物活性肽对人胆管癌QBC939细胞凋亡基因表达谱调控的影响

目的利用基因芯片探讨抗癌活性肽诱导人胆管癌细胞QBC939细胞后凋亡相关基因表达的差异性;寻找关键基因并分析其可能的作用机制。方法采用RPMI1640培养基体外培养人胆管癌QBC939细胞,将其分为两组,空白对照组和抗癌活性肽实验组,选用指数增长期细胞用于实验。Trizol法提取总RNA,采用定制基因芯片对1 153条凋亡相关基因的表达进行检测,对基因芯片数据进行处理和生物学信息分析。结果在1 153条基因中,抗癌活性肽组与对照组比较基因表达谱存在差异;差异表达基因中,上调基因121条,下调基因120条,其中表达差别有显著性意义的基因共89条,包括下调基因84条,上调基因4条,无变化1条。上调显著基因为共济失调毛细血管扩张症突变（ATM）基因、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因。结论抗癌活性肽对多种胆管癌细胞凋亡相关基因有调控作用,研究结果为进一步开展抗癌活性肽调控靶基因的研究奠定了基础。     

OSX基因沉默对醛固酮诱导的小鼠血管平滑肌细胞钙化的影响

目的研究成骨相关转录因子(OSX)沉默对醛固酮诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)成骨样分化和钙化的影响。方法体外原代培养小鼠的VSMC。针对小鼠OSX基因设计合成小分子干扰RNA(siRNA)序列,使用Lipo 2000为载体,转染体外培养的VSMC;FAM荧光标记siRNA优化转染条件。实时PCR检测OSX mRNA表达。将siRNA序列转染VSMC,细胞分为4组:1正常组;2醛固酮组(1.5 mmol/L);3siRNA转染组:醛固酮+OSX-siRNA;4阴性转染对照组:醛固酮+阴性对照siRNA。实时RT-PCR及免疫印迹法检测OSX、整联结合涎蛋白(Ibsp)基因和蛋白表达;茜素红染色观察细胞钙盐沉积。结果与醛固酮组相比,siRNA转染组OSX mRNA表达在转染后24 h及48 h均明显低于醛固酮组(均P0.01);OSX蛋白表达在转染后48 h和72 h均低于醛固酮组(均P0.01),以48 h最明显。siRNA有效沉默OSX基因表达后,OSX转染组Ibsp mRNA和蛋白的表达低于醛固酮组(均P0.01),而且细胞钙盐沉积低于高磷组。结论 OSX-siRNA可以有效抑制VSMC OSX基因和蛋白的表达,从而抑制醛固酮诱导的VSMC成骨样分化和细胞钙化。OSX可以成为CKD血管钙化治疗的靶点。     

下调STAT3基因调控腺样囊性癌细胞生长的实验研究

目的:探讨RNA干扰技术沉默STAT3基因调控腺样囊性癌细胞生长的实验研究。方法:人腺样囊性癌生长细胞株ACC 2常规培养,分别采用A组为空白转染组,B组转染阴性对照siRNA(NC),C组转染特异性的siRNA(siRNA组)转染进ACC2,采用qRT PCR和Western blot法检测转染后STAT3 mRNA和蛋白表达水平的变化。MTT检测转染后腺样囊性癌细胞增殖。结果:ACC2细胞转染STAT3 siRNA 48 h后,STAT3 mRNA和蛋白的表达均受到明显抑制(P0.05)。ACC 2生长72 h细胞转染后细胞增殖受到抑制,较对照组有显著性差异(P0.05)。结论:STAT3基因有可能成为腺样囊性癌细胞生长基因治疗中重要的靶基因。     

siRNA对肝癌细胞异常表达FAT10基因的抑制效应研究

目的：探讨小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）对原发性肝癌（肝癌）细胞中异常表达的类泛素蛋白FAT10的抑制作用,研究其对肝癌细胞生长的影响。方法：针对FAT10基因设计4条siRNA序列,并转染至人肝癌细胞株Hep3B细胞,通过实时荧光定量PCR检测siRNA对FAT10基因表达的影响,使用四甲基偶氮唑蓝法检测siRNA对Hep3B细胞生长情况的影响,采用流式细胞术分析siRNA对Hep3B细胞周期变化的影响。结果：Hep3B细胞转染siRNA后,FAT10mRNA表达降低,Hep3B细胞的生长受到了明显的抑制,其生长主要停滞在G0／G1期,而S期和G2／M期细胞所占比例下降。结论：siRNA可抑制Hep3B细胞FAT10基因的表达,并抑制Hep3B细胞的生长。FAT10基因可能是调控肝癌基因表达的新的靶基因。     

CLC-3 siRNA对人肺动脉平滑肌细胞增殖及细胞周期的影响

目的探讨CLC-3siRNA对人肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖及细胞周期的影响。方法应用脂质体3000将CLC-3siRNA转入PASMC。通过免疫印记法测定了CLC-3siRNA干扰后PASMC的CLC-3表达水平;应用台盼蓝染色计数法计数了细胞增殖;流式细胞仪测定了细胞周期。结果(1)CLC-3siRNA可降低PASMC的CLC-3表达;(2)CLC-3siRNA干扰可显著抑制PASMC增殖,与空白对照、阴性对照siRNA转染组相比P0.05;(3)CLC-3siRNA干扰可显著减少PASMC的S期细胞、增加G1期细胞,与空白对照、阴性对照siRNA转染组相比P0.05。结论 CLC-3siRNA干扰PASMC表达CLC-3,可抑制PASMC的增殖并影响其细胞周期进程。     

沉默缺氧诱导因子-1α对卵巢癌化疗敏感性的影响

目的观察沉默缺氧诱导因子HIF-1α对卵巢癌细胞化疗敏感性的相关影响并探讨其机理。方法构建HIF-1α基因短发夹RNA真核表达质粒,并转染卵巢癌细胞SKOV3（人卵巢浆液性囊腺癌细胞株）。实验可分为空白组,非特异对照组（转染pNonspecific-siRNA,即SKOV3NS）,目的siRNA组（转染pHIF-siRNA,即SKOV3siRNA）3组,用RT-PCR及Western Blot法分别检测各组HIF-1α基因的mRNA和蛋白的表达水平。细胞经过20μmol/L顺铂作用后,用MTT法检测细胞生长抑制率,流式细胞术（FCS）检测细胞凋亡率。结果 SKOV3siRNA转染组HIF-1α基因在mRNA水平和蛋白水平表达均明显降低,SKOV3siRNA组肿瘤细胞的生长抑制率和细胞凋亡率均明显增高（P〈0.05）。结论 RNA干扰技术沉默HIF-1α能够有效地抑制卵巢癌SKOV3细胞HIF-1α基因表达,增强其对化疗药物顺铂的敏感性。     

siRNA干扰ARD1对人结直肠腺癌细胞株基因表达谱的影响

目的 探讨siRNA干扰抑制ARD1的表达对人结直肠腺癌细胞株基因表达谱的影响.方法 利用脂质体将筛选出的有效沉默ARD1的siRNA分别转染到SW620、HCT-8两株细胞中,提取两株细胞的总RNA并应用安捷伦人全基因表达谱芯片检测转染前后基因表达谱的变化.结果 两株细胞中,转染组相对于阴性对照组,21个基因共同上调...     

胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1表达对鼻咽癌细胞系CNE1发生发展的研究

目的探讨胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBP-rP1)对鼻咽癌细胞系CNE1细胞的增殖、侵袭、迁移能力的影响。方法构建2条特异性针对IGFBP-rP1基因的小干扰RNA(siRNA32、siRNA34)及其阴性对照siRNA,将CNE1细胞分为4个转染组:siRNA32组(siRNA32转染)、siRNA34组(siRNA34转染)、阴性对照组(阴性对照siRNA转染)、空白组(不做任何处理),分别培养24h或48h后检测相关指标。结果siRNA32组和siRNA34组IGFBP-rP1mRNA及蛋白表达水平显著低于阴性对照组和空白组(P0.05);siRNA32组和siRNA34组CNE1细胞迁移数、穿过PVP-F膜的CNE1细胞数显著低于阴性对照组和空白组(P0.05);培养24、48h后,siRNA32组和siRNA34组CNE1细胞增殖OD值显著低于阴性对照组和空白组(P0.05);培养48h后,siRNA32组和siRNA34组G0/G1期、G2/M期细胞所占比例显著高于阴性对照组和空白组(P0.05);siRNA32组和siRNA34组S期细胞所占比例显著低于阴性对照组和空白组(P0.05)。结论抑制IGFBP-rP1表达能降低鼻咽癌CNE1细胞的增殖、侵袭、迁移能力,为临床治疗鼻咽癌提供一种新的思路。