低温缺氧条件下脂质体介导的寡核苷酸对人脐静脉内皮细胞-304的转染

目的 研究在Euro-Collins溶液(ECs)中,低温(4 ℃)缺氧条件下体内阳离子脂质体转染剂(In vivo liposome)介导NF-κB诱捕物寡核苷酸(NF-κB decoy ODN)在人脐静脉内皮细胞株ECV-304中的转染效率。方法 (1) 将ECV-304在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中以37 ℃、5% CO₂的条件培养,待生长至单层融合后,进行试验。(2) 使用前配制脂质体-ODN复合物,脂质体与ODN 的+/-电荷比率为2。(3) 应用荧光显微镜和流式细胞仪,观察在ECs中、4 ℃条件下,ODN浓度分别为0.50、0.75、1.00、1.25 μmol/L时,缺氧保存2、4、6、8 h后ECV-304的平均荧光强度(MFI)和ODN的胞内分布;同时设立裸ODN转染为对照组,观察对ECV-304的转染效率。结果 在ECs中、4 ℃缺氧保存条件下,随着保存时间的延长和脂质体-ODN浓度的升高,ECV-304的MFI增强,保存6 h后MFI基本达到了最大强度,并且大部分ODN均位于细胞核内;而ODN的细胞摄取率无差异。但与裸转染相比,MFI和细胞摄取率均有显著差异性。结论 在ECs中和低温缺氧条件下,脂质体可以高效地将NF-κB decoy ODN转染到ECV-304细胞核,为供体器官在基因调控水平的保护研究提供了实验依据。     

影响人脐静脉内皮细胞脂质体转染pReceiver-M29-PRKCB1效率因素的探讨

目的:探讨影响人脐静脉内皮细胞转染效率的因素,为优化外源基因在其中的表达提供实验依据.方法:选用适于转染人脐静脉内皮细胞的脂质体lipofectin,采用不同的转染条件:脂质体和DNA的用量;铺板密度;细胞与DNA-脂质体复合物孵育时间转染内皮细胞.荧光显微镜、流式细胞仪测定不同转染参数下的转染效率.结果:(1)24孔板中,铺板密度大于2×104个/孔和孵育时间超过4h,反而使转染效率下降.(2)随质粒质量增加转染效率逐渐上升,达峰后质粒质量的增加并不能显著增高转染效率.(3)特染效率达峰前,随着脂质体用量的增加,转染效率增高;达峰后,脂质体用量的增加,转染效率反降低.当DNA(μg)和脂质体(μl]的用量比为1∶6～1∶8时,获得最高的转染效率:18.62%.结论:采用优化后的转染参数在人脐静脉内皮细胞转染中可获得较优的转染效率.     

人脐静脉内皮细胞的培养

目的：培养的内皮细胞为基础和临床研究提供体外模型,并为进一步研究内皮细胞对造血的影响提供实验材料。方法：经胶原酶消化获得人脐静脉内皮细胞,用ＲＰＭＩ－１６４０加２０％的胎牛血清进行培养。结果：成簇状的内皮细胞最初形成于培养皿（或培养瓶）的底层,继而细胞迅速生长,融合成片,约７天细胞呈单层多角形镶嵌排列。透射电镜观察,原代培养细胞的胞质内含内皮细胞特有的细胞器（ＷＰＢｓ）。兔抗人Ⅷ因子相关抗原（ⅧＲ：Ａｇ）免疫组织化学染色实验证实,培养的内皮细胞含有ⅧＲ：Ａｇ。结论：本实验的各项结果从形态,免疫组化及透射电镜的观察均符合内皮细胞的特征,因此确信所培养的内皮细胞可提供作进一步深入的细胞生物学及对造血影响的研究。     

川芎嗪对人脐静脉内皮细胞ECV304增殖的影响

川芎为活血化瘀代表性中药，临床应用甚广。川芎嗪(Tranethylpyrazine，TMP)为川芎主要有效成分之一。前期研究表明，川芎嗪注射液能抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠移植瘤的生长和肺转移，可降低肿瘤组织微血管密度和抑制肿瘤细胞血管内皮生长因子(VEGF)的表达。本试验旨在进一步探讨川     

人CD40分子基因转染人脐静脉内皮细胞ECV-304

目的 构建人CD40的真核表达载体，建立持续、稳定高表达CD40的人脐静脉内皮细胞ECV-304。方法 将含有CD40的克隆载体pUCD40酶切后，再克隆到真核表达载体pCDNA3．1中，构建重组质粒pCDNA3．1（＋）／CD40，并对重组质粒进行酶切鉴定。然后用脂质体法将重组质粒转染ECV-304，G418筛选转染的细胞。RT-PCR、Western-blotting和流式细胞仪定性定量检测转染后的ECV-304的CD40的表达情况。结果 经酶切鉴定，重组体中已插入目的基因片段CD40。RT-PCR和Western-blotting证实，重组质粒转染的ECV-304中有CD40基因的表达，流式细胞仪检测转染后的ECV-304的CD40的表达率为95％。结论 成功构建了真核表达载体pCDNA3．1（＋）／CD40．并建立了高表达CD40的ECV-304，为筛选抗动脉粥样硬化药物奠定了基础.     

丙氨酰谷氨酰胺二肽对人脐静脉内皮细胞ECV304缺氧缺糖损伤的保护作用

目的 观察丙氨酰谷氨酰胺二肽（丙谷二肽）对人脐静脉内皮细胞ECV304缺氧缺糖损伤的保护作用,并探讨其可能的作用机制。方法 在以低氧低糖培养人脐静脉内皮细胞ECV304为细胞损伤模型的基础上,以噻唑蓝（MTT）比色法优化丙谷二肽的最佳作用浓度,显微镜观察细胞形态变化,流式细胞术检测线粒体膜电位。自动生化分析仪测定乳酸脱氢酶（LDH）活性,比色法检测谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）的浓度,RT-PCR方法检测细胞内肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6 (IL-6)、热休克蛋白70 (HSP70)、葡萄糖调节蛋白78 (GRP78) 和缺氧诱导因子-1α (HIF-1α) mRNA的表达。结果 丙谷二肽能够使细胞在缺氧缺糖应激下存活率增加,线粒体损伤减轻,LDH分泌降低,GSH产生增加,HSP70和HIF-1α mRNA的表达增加。结论 丙谷二肽对细胞缺氧缺糖损伤有明显的保护作用,这种保护作用可能与保护线粒体、维持细胞膜结构完整、上调细胞中应激基因HSP70和HIF-1α的表达有关。     

人脐静脉内皮细胞传代培养方法

内皮细胞在一些生理、病理过程中起重要作用。内皮细胞培养方法广泛用于其形态、功能、代谢的研究。我们采用改良Jaffe法成功传代培养人脐静脉内皮细胞。材料与方法: 内皮细胞分离与培养:用酶消化法分离内皮细胞。取正常娩出胎盘之脐带(20～25cm),置4℃cord缓冲液中保存(一般不超过6h)。操作在超净台     

脂质体介导NF-κB decoy ODN低温缺氧对ECV-304的转染及复氧后对其黏附分子mRNA表达的影响

目的:探讨在Euro-Collin's(ECs)中,低温缺氧条件下脂质体(in vivo liposome)介导NF-κB诱捕物寡核苷酸(NF-κB decoy ODN)对人脐静脉内皮细胞株(ECV-304)的转染效率以及复氧后对其NF-κB活性及受其调控的黏附分子mRNA表达的影响. 方法:应用脂质体/decoy ODN、脂质体/scrambled ODN复合物,在低温缺氧的ECs转染ECV-304. 应用荧光显微镜和流式细胞仪,观察在4℃条件下,decoy ODN浓度为1.0 μmol/L的ECs缺氧保存ECV-304 6 h后的平均荧光强度(MFI)和摄取率以及ODN的胞内分布;同时设立裸ODN转染为对照, 观察脂质体介导decoy ODN对ECV-304的转染效率. 应用凝胶电泳迁移改变试验(EMSA)分析ECV-304低温缺氧保存6 h/复氧后不同时间的NF-κB 活性以及decoy ODN对NF-κB活性抑制效果. 利用RT-PCR方法检测各组ECV-304的ICAM-1, VCAM-1以及P-selectin的mRNA表达. 结果:ECV-304在ECs中4℃缺氧保存6 h后,脂质体介导ODN对ECV-304转染的MFI为1072.7±33.1,是裸ODN转染的91.1倍,细胞对ODN的摄取率为(93.1±2.6)%,是裸ODN转染的71.5倍;脂质体介导ODN 转染的ECV-304,荧光显微镜下可见部分荧光颗粒分布于胞质,胞核内呈强荧光颗粒,而裸ODN转染的ECV-304,胞质内偶见少量荧光,胞核内未见荧光颗粒. ESMA显示ECV-304低温缺氧保存6 h/复氧后1 h NF-κB活性开始升高,4 h达到高峰;转染decoy ODN的ECV-304复氧后4 h其NF-κB活性受到抑制,而转染scrambled.ODN的ECV-304复氧后4 h其NF-κB不被抑制. RT-PCR结果显示decoy ODN转染ECV-304后,其ICAM-1, VCAM-1以及P-selectin的mRNA的表达低于未转染组和scrambled.ODN转染组,有显著性差异. 结论:在ECs中以及低温缺氧条件下,脂质体能高效地将decoy ODN转染到ECV-304的胞核中,而裸ODN则不能进入细胞;经decoy ODN转染的ECV-304,在低温缺氧保存/复氧后,其NF-κB活性被抑制,并且其黏附分子的mRNA表达被抑制.     

人CD40分子基因转染人脐静脉内皮细胞ECV-304

目的构建人CD40的真核表达载体,建立持续﹑稳定高表达CD40的人脐静脉内皮细胞ECV-304。方法将含有CD40的克隆载体pUCD40酶切后,再克隆到真核表达载体pCDNA3.1中,构建重组质粒pCDNA3.1( )/CD40,并对重组质粒进行酶切鉴定。然后用脂质体法将重组质粒转染ECV-304,G418筛选转染的细胞。RT-PCR﹑Western-blotting和流式细胞仪定性定量检测转染后的ECV-304的CD40的表达情况。结果经酶切鉴定,重组体中已插入目的基因片段CD40。RT-PCR和Western-blotting证实,重组质粒转染的ECV-304中有CD40基因的表达,流式细胞仪检测转染后的ECV-304的CD40的表达率为95%。结论成功构建了真核表达载体pCDNA3.1( )/CD40,并建立了高表达CD40的ECV-304,为筛选抗动脉粥样硬化药物奠定了基础。     

Sulindac derivative- induced apoptosis in a human umbilical vein endothelial cell line ECV304

Objective To investigate the effects of sulindac metabolites on proliferation and apoptosis in the human umbilical vein endothelial cell line ECV304 in vitro.Methods The proliferation profile of ECV304 was determined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method. Cell cycle distribution, apoptosis and the ultrastructure of ECV304 were detected by flow cytometry (FCM) and electron microscopy, respectively.Results MTT assay showed that the sulfide inhibited the proliferation of ECV304 and its effect was dose- dependent; the IC50 was 200 μmol/L. FCM showed that the sulfide changed cell cycle distribution. The cell cycle distribution was as follows: G1 phase (control group 77. 74%±1. 58%; sulfone group 75. 63%±2. 12%; sulfide group 46. 12%±1. 60%); S phase (control group 13. 64%±1. 22%; sulfone group 16. 40±2. 30%; sulfide group 27. 26%±2. 08%); G2- M phase (control group 8. 61%±0. 67%; sulfone group 7. 98%±0. 49%; sulfide group 26. 62%±3. 54%). The apoptosis rates in the control group, sulfone group and sulfide group were 6. 08%±3. 39%, 4. 81%±2. 14% and 51. 90%±5. 67%, respectively. Sulfide reduced the proportion of G1 phase, increased the proportion of S phase, G2- M phase and the apoptosis rate significantly (P<0. 01, vs control). In the sulfide- treated cells, there were nuclear fragmentation and chromosomal condensation, shrinkage of the cell and loss of contact with neighboring cells. Apoptotic bodies were observed. Sulfone showed no effect on cell proliferation, cell cycle distribution or cell morphology.Conclusions Sulfide can significantly reduce the proliferation of ECV304, change the cell cycle distribution and arrest cells in G2- M phase where apoptosis may be induced. Sulfone has no such effects on this cell line.     

EA.HY926人脐静脉内皮细胞株与原代细胞生物特性的比较研究

目的比较培养EA．HY926人脐静脉内皮细胞株与原代脐静脉内皮细胞（HUVECs）的优缺点及生物学特性。方法通过倒置显微镜、透射电镜形态学鉴定、Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检查及生长曲线测定,比较2种脐静脉内皮细胞的形态、生长喵线等差异。结果透射电镜观察到原代HUVECs中发现较多Webel—Palade小体,而EA．HY926细胞株较少见。免疫组织化学染色ImageProPlus6．0软件进行分析EA．HY926人脐静脉内皮细胞株与原代HUVECs平均光密度值分别为（2234．02±78．78）、（4138．80±594．01）。原代HUVECs的染色程度明显较EA．HY926细胞株高,差异有统计学意义（Pd0．01）。EA．HY926人脐静脉内皮细胞株生长曲线较原代HUVECs稳定。结论培养原代HUVECs耗时长,生长期较短,易出现杂细胞的污染,细胞的增殖能力有限,花费昂贵。EA．HY926细胞株虽生物特性较差,但其操作简便,具有一定程度的原代HUVECs所具有的生物特性,细胞均一以及增长旺盛,可用于较复杂、细胞创伤较大的体外内皮细胞的研究。     

重组人内皮抑素腺病毒对人脐静脉内皮细胞系的影响

目的 探讨重组人内皮抑素腺病毒(Ad-hEndo)感染人脐静脉内皮细胞(ECV-304)后,对细胞生长状态及生理功能的影响.方法 重组人内皮抑素腺病毒Ad-hEndo感染ECV-304细胞,western blot测定hEndostatin蛋白表达情况,流式细胞术检测Ad-hEndo引起ECV-304细胞凋亡情况,并绘制各组细胞生长曲线.结果 与对照组相比,病毒感染48 h后检测到明显的hEndostatin蛋白表达,Ad-hEndo在感染3 d后出现ECV-304细胞凋亡,且ECV-304细胞在Ad-hEndo感染后生长受到明显限制.结论 Ad-hEndo感染的ECV-304细胞能有效表达hEndostatin,hEndostatin能诱导ECV-304细胞发生细胞凋亡且明显抑制其生长增殖.     

脂质体介导NF-кB decoy ODN低温缺氧对ECV-304的转染及复氧后对下游粘附分子及趋化因子基因表达的影响

目的探讨在Euro-Collin's(ECs)中,低温(4℃)缺氧条件下脂质体(in v1vo Liposome)介导N F-κ B诱捕物寡核苷酸(NF-κ B decoy ODN)对人脐静脉内皮细胞株(ECV-304)的转染效率以及复氧后对其细胞分子表达的影响.方法ECV-304在10?S的RPMI 1640培养液,37℃、5%CO2条件下培养,生长至单层融合后进行试验.使用前配制Liposome/decoy ODN和scrambled ODN复合物,Liposome与ODN的 /-电荷比率为2.应用荧光显微镜和流式细胞仪,观察在4℃条件下,ODN浓度1.0μM的ECs缺氧保存6h后ECV-304的平均荧光强度(MFI)和摄取率以及ODN的胞内分布;同时设立裸ODN转染为对照,观察Liposome介导ODN对ECV-304的转染效率.利用RT-PCR方法检测各组ECV-304的ICAM-1、VCAM-1、IL-8、MCP-1以及P-selectin的mRNA表达.结果在ECs中、4℃缺氧保存ECV-304 6h后,LiPosome介导ODN对ECV-304转染的MFI为10172.71±33.14,是裸ODN转染的91.1倍,细胞对ODN的摄取率为93.06±2.60%,是裸ODN转染的71 5倍.Liposome介导ODN转染的ECV-304,荧光显微镜下可见部分荧光颗粒分布于胞浆,胞核内可见强荧光颗粒;而裸ODN转染的ECV-304,胞浆内偶见少量荧光,胞核内未见荧光颗粒RT-PCR检测显示Liposome/decoy ODN转染ECV-304后,其ICAM-1,VCAM-1,IL-8,MCP-1以及P-selectin的mRNA的表达低于未转染组和Scramb.ODN转染组,有显著性差异.结论低温缺氧条件下和ECs中,Liposome能有效地将ODN转染到ECV-304的胞核中,而裸ODN则不能进入细胞;经Liposome/decoy ODN处理的ECV-3 04,其下游粘附分子及趋化因子的基因表达被抑制.     

降钙素基因相关肽对缺氧状态下培养的血管内皮细胞的影响

目的　观察不同浓度的降钙素基因相关肽 ( CGRP)对缺氧状态下人脐静脉血管内皮细胞的影响 .方法　用培养的人脐静脉血管内皮细胞建立缺氧模型 ,观察血管内皮细胞在缺氧状态下细胞膜流动性 ,5 1铬释放率 ,台芬蓝摄取率和细胞内钙 ,镁含量的变化以及 1× 10 - 9,1× 10 - 8,1× 10 - 7mol.L- 1 CGRP对血管内皮细胞的影响 .结果　 1× 10 - 9,1×10 - 8,1× 10 - 7mol.L- 1 CGRP可降低缺氧 12 0 min时细胞膜流动性 ,5 1 铬释放率 ,台芬蓝摄取率及减少细胞内镁的丢失 ,1× 10 - 8mol.L- 1 CGRP的效果最好 .结论　 CGRP对血管内皮细胞缺氧损伤具有直接保护作用 ,在一定范围内存在浓度效应关系     

EDA-A1基因突变体对人脐静脉内皮细胞 ECV304增殖及细胞周期的影响

目的：研究少汗型外胚层发育不良症 EDA‐A1基因突变体对人脐静脉内皮细胞（ECV ）周期和增殖活性的影响。方法构建 EDA‐A1基因编码序列（CDS）突变体和野生型的真核表达载体 pcDNA3．1（‐）‐EDA‐A1‐M /W ,转染人脐静脉内皮细胞,逆转录 PCR（RT‐PCR）扩增 EDA‐A1基因,蛋白免疫印迹法（Western blot）法检测 EDA‐A1蛋白表达,M TT 法、流式细胞术检测EDA‐A1基因突变体对 ECV 细胞增殖和细胞周期的影响。结果 RT‐PCR 、Western blot 结果显示,野生型组和突变体组 ECV细胞表达 EDA‐A1基因及其蛋白,而空质粒转染组[pcDNA3．1（‐）]和空白对照组细胞无表达。与对照组（空质粒租）相比,突变体组 ECV 细胞增殖活性下降,生长抑制率为45．70％（P＜0．01）,野生型细胞增殖活性无明显改变（P＞0．05）。突变体组中有更多细胞进入 G0/G1期、S 期;野生型组 S 期细胞增多,G2/M 期细胞明显减少（P＜0．05）。结论突变体和野生型 EDA‐A1基因对 ECV 细胞增殖和细胞周期有不同的生物学功能。