Identification of Common Species of Dermatophytes by PCR-RFLP

To establish a simple, sensitive and effective technique for the identification of six common dermatopbytes, polymerase chain reaction （PCR） and PCR-restriction fragment length polymorpbism （RFLP） targeting Topoisomerase Ⅱ gene were used. The DNA of 6 common dermatopbytes was amplified by primer dPsD1 and then primers dPsD2. The products generated by dPsD2 were digested with restriction enzyme Hinc Ⅱ and Hinf Ⅰ separately. A DNA fragment of about 3390 bp was amplified by using primer dPsD1 from the genomic DNA of each dermatopbyte species. The product of dPsD2 was 2380 bp and the restriction profiles of Hinc Ⅱ and Hinf Ⅰ were between 58-1670 bp. By using PCR-RFLP, all of the 6 dermatopbytoses were diagnosed to species level and no obvious difference identification between Hinc Ⅱ and Hinf Ⅰ. It is concluded that the PCR-RFLP identification of dermatopbytes by Hinc Ⅱ or Hinf Ⅰ is efficient and rapid in clinical practice.     

用微小卫星引物PCR鉴定红色毛癣菌和须癣毛癣菌

目的：观察红色毛癣菌和须癣毛菌临床离株DNA PCR指纹的差异,找出一种区分红色毛癣菌和须癣毛癣菌的基因分类方法。方法：采用寡核苷酸重复序列（GACA）4、（GTG）5及M13中心序列（5′-GAGGGTGGCGGTTCT-3′）3上物,对23株红色毛癣菌和11株须癣毛癣菌临床分离株的DNA进行PCR扩增,观察产物电泳带型的差异。结果：在3种引物的扩增产物中,均可见红色毛镁菌和须癣毛癣菌呈现出不同的DNA指纹,其中,以引物（GACA）4扩增的条带差异最为清晰。结论：X工色毛癣菌和须癣毛癣菌可以用PCR方法加以鉴别,以（GACA）4作引物 区这两种菌较为合适。     

Monascus ruber 5031洛伐他汀合成酶基因的PCR分析

目的分析Monascus ruber5031洛伐他汀合成酶基因的结构。方法用3对以土曲霉洛伐他汀合成酶基因为基础设计的PCR引物对红曲霉基因组进行了PCR分析,其中一对引物序列为,正向:5’TTC GAT GCG GCC TTC TTC AAT3’和反向5’ATG GTT CGG CATCGT AAT TCC 3’。结果在红曲霉基因组中相当于土曲霉洛伐他汀合成酶基因的LNKS区域扩增出了745 bp的核酸片段,其序列与土曲霉合成酶的这一区域序列相同。结论土曲霉和红曲霉洛伐他汀合成酶基因存在同源区域。     

基因扩增法检测军团杆菌DNA的研究

采用聚合酶链式反应建立检测军团菌 DNA 的实验诊断方法。结果显示,采用军团菌属5 SrRNA 编码区特异性引物进行扩增,11种军团菌(包括八种嗜肺军团菌)均可见104bp 的阳性扩增带;采用嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强(mip)基因编码区特异性引物扩增,所有八种嗜肺军团菌均可见650 bp 的特异性扩增带,所有三种非嗜肺军团菌扩增结果为阴性。检测敏感性为60 fg 左右。     

Identification of Trichophyton rubrum by PCR- fingerprinting

Objective To observe the unique DNA profile and the relationship between DNA profile and phenotype of Trichophyton rubrum, and establish an effective molecular method to identify T.rubrum. Methods Three primers, including (GACA) 4, (GTG) 5 and M13 core sequence (5’- GAGGGTG- GCGGTTCT- 3’), were used to distinguish variations among 20 clinical isolates of T.rubrum and Trichophyton mentagrophytes.Results Different PCR- fingerprinting was seen between T.rubrum and T.mentagrophytes using three different primers.2 stains of T.rubrum were identified among 6 supposed T.mentagrophytes. Conclusions T.rubrum can be distinguished using PCR, and (GACA) 4 is the most suitable primer.     

Establishment of a multiplex PCR system to diagnose tuberculosis and other bacterial infections

BactirialinfectiousdiseasesareverycommoninchildrenofChina.Manysevereinfectionssuchaspu-rulentmeningitis,tuberculousmeningitisandsepsisstillthreatenchildren'shealthandeventheirlives.Bacterialcultureisaclassicmethedtodetectthepathogensofinfectiousdiseases,butithastotakeseveraldaysforgeneralbacteriaandeven4to8weeksfortuberclebacillus(Tb).ltcouldbringsomeperplexitiesfordoctorstodeterminetheeffectivetherapy.So,arapid,specificandsensitivemethodisrequiredfordiagnoslngbacterialinfections,speciallydif…     

TaqMan 探针荧光定量PCR支原体快速检测方法的建立及应用

目的： 在支原体16SrRNA的种属特异性区域设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立荧光定量PCR方法,检测细胞培养物中支原体。方法：选择16srRNA支原体种属特异性区域作为扩增区,设计支原体通用引物,PCR扩增片段的预期大小为288 bp。回收PCR扩增产物,连接pMD-18T载体,转化JM109大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR鉴定后提取质粒。构建荧光定量PCR绝对定量的标准品,设计荧光定量引物、探针,采用矩阵法对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验灵敏度并与普通PCR法及培养法进行比较;对支原体及其他5种革兰氏阳性杆菌进行特异性检验;对培养法、普通PCR法及荧光定量PCR法检测样本的灵敏度进行比较。结果：支原体PCR产物大小约为288 bp,质粒质量浓度为13.9 mg/L,A260/Ａ280 (Ratio)为1
.780,质粒溶液浓度为4.25×109拷贝/ μL。10 μmol/L的引物浓度和10 μmol/L-1探针浓度为最佳反应浓度,双温循环及60℃退火温度为最佳的循环条件。检测灵敏度为4.250×101 拷贝。拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式：Ct= －2.916×log拷贝数+40.02。特异性检验中5种革兰氏阳性杆菌样本检测均为阴性,支原体样本为阳性,表明特异性好。准确性检测中变异系数小,表明稳定性好。组内及组间相同浓度样本检测具有相同的Ct值,表明重现性好。样本检验中,荧光定量PCR检测出的阳性样本高于普通PCR及培养法。结论：支原体荧光定量PCR法检测细胞样本及临床样本中支原体快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好。     

PCR技术检测棘阿米巴26S核糖体DNA

目的:用聚合酶链反应(PCR)方法检测棘阿米巴的26S核糖体DNA(26S rDNA,Rns),为早期诊断棘阿米巴角膜炎提供方法.方法:分离培养三株不同基因型棘阿米巴虫株,提取虫株基因组DNA,合成棘阿米巴属特异性引物(ArDNA-a),通过聚合酶链反应(PCR)扩增部分26S rDNA序列.结果:三株不同基因型棘阿米巴虫株属于两种基因型,其中Acanthamoeba sp.CJY/s2株和Acanthamoeba sp.CJY/s株属于Rns T4基因型,Acastellanii Neff株属于Neff基因型.PCR扩增后,Acanthamoeba sp.CJY/s2和Acastellanii Neff株的26S核糖体DNA基因片段扩增出分子量大小为126 bp的特定扩增带,而Acanthamoeba sp.CJY/s株的26S核糖体DNA基因片段则未得到预期的扩增带.结论:用棘阿米巴属特异性引物(ArDNA-a)可以有效扩增Acanthamoeba sp.CJY/s2和Acastellanii Neff株的26S核糖体DNA基因,可以为部分棘阿米巴性角膜炎的早期检测提供新的检测手段.     

弓形虫529 bp重复序列基因的PCR阳性质控质粒的构建

目的：构建含有弓形虫529 bp高度重复序列基因的重组质粒,为基于该基因的弓形虫病分子生物学诊断建立标准阳性对照品。方法：以弓形虫RH株基因组DNA为模板,对529 bp的基因片段进行扩增,将纯化后的PCR产物与pMD18-T载体连接后转入大肠埃希菌DH-5α中,提取重组质粒PCR及测序鉴定。以弓形虫529 bp基因为靶基因设计的检测引物,扩增弓形虫基因组DNA及质粒DNA。结果：PCR产物序列与GENBANK中弓形虫529 bp基因序列完全一致。以弓形虫基因组DNA和质粒DNA为模板,成功扩增出预期的249bp基因片段。结论：成功构建可作为标准阳性对照品的含有弓形虫529 bp高度重复序列基因的重组质粒pMD-18-Tox,为经济实用的弓形虫诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

ISSR-PCR在石斛种间鉴别中的应用

目的 采用ISSR-PCR方法对石斛属9种植物进行鉴别,探讨不同种石斛在DNA分子水平上的差异。方法 选取10条由SSR组成的引物,对9种石斛进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳分析。结果 10条引物中有7条扩增出多态性条带。每条引物可检测的多态性位点最少7个,最多14个,扩增片段大小为220-1260 bp。其中,引物UBC-807和UBC-864具有较高的多态性条带比率,均可以独立将所有被测种区分开来。结论ISSR-PCR作为一种简便、可靠的分子标记鉴定技术,可以作为石斛属种间鉴别的方法之一。     

布鲁菌病半套式PCR检测方法的建立

目的 建立布鲁菌属半套式PCR检测方法。方法根据布鲁菌BCSP-31蛋白基因设计三条引物，扩增目的片段长223bP，通过条件优化，建立了布鲁菌属半套式PCR检测方法。利用所建立的PCR方法对六个种布鲁菌和Y．CenterO：9，S．TyPhi，E．Coli O：157进行检测验证其特异性，通过对活菌计数检测验证其敏感性。结果检测结果表明六个种布鲁菌均可扩出223bP的目的片段，而Y．Center O：9，S．TyPhi和E．Coli O：157不能扩出目的片段。通过对活菌计数最低可检测到20个细菌。结论本研究建立了敏感、特异的布鲁菌病半套式PCR快速检测方法，为布鲁菌的检测和试剂盒的研制奠定了基础。     

绒山羊和绵羊源东毕吸虫ITS rDNA的PCR扩增及序列分析

目的扩增绒山羊和绵羊源东毕吸虫的ITS rDNA序列并进行分析比较。方法运用PCR方法，以保守引物BD1和BD2扩增从黑龙江绒山羊和绵羊体内分离的东毕吸虫（Oriemobilharzia spp．）rDNA的内转录间隔区（ITS-1及ITS-2）。PCR产物经测序后进行序列分析。结果黑龙江绒山羊和绵羊东毕吸虫的ITS序列总长均为875bp，其中ITS-1序列长为384Up，5．8S序列长为159Up，ITS-2序列长为332Up。黑龙江绒山羊和绵羊东毕吸虫的ITS序列相似性为99．9％，只有一个碱基差异，存在于ITS-2序列中。结论本研究在国际上首次报道了绒山羊和绵羊东毕吸虫的ITS序列，证实绒山羊和绵羊源东毕吸虫代表同一个种。这些结果为东毕吸虫分子生物学的进一步研究奠定了基础，并为寄生虫分子系统学研究提供了新资料。     

常见曲霉菌的反向斑点杂交技术的研究

目的 建立常见曲霉菌的反向斑点杂交诊断技术.方法 针对曲霉菌内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)保守基因设计引物和杂交探针,对探针标记、固定在尼龙膜,形成一种杂交膜与PCR产物进行斑点杂交,显色.结果 真菌通用引物扩增常见曲霉菌ITS2基因DNA片段,大小为350bp左右.构建了常见曲霉菌的反向斑点杂交膜,与其PCR产物反应特异性好,灵敏度高.结论 利用PCR技术和反向斑点杂交技术鉴定常见的曲霉菌,方法特异性好、灵敏度高,符合临床需要,能为侵袭性真菌感染提供新的选择.     

PCR-RFLP法对单纯疱疹病毒感染诊断和分型的研究

目的 建立单纯疱疹病毒的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）检测法,为生殖器疱疹的诊断及分型提供可靠而特异的方法。方法 以特异性引物法为对照,用一对单纯疱疹病毒外层通用引物扩增出长度为438bp的片断,并进行酶切以分型。结果 PCR-RFLP法可特异性检测出单纯疱疹病毒并进行分型,同特异性引物法比较。两种方法无显著性差异。结论 PCR-RFLP法是一种准确、特异的对单纯疱疹病毒感染进行诊断和分型的方法。     

Researches on DLA-DRB1 genotyping by PCR-RFLP I. A study of serology and cellularly defined DLA haplotypes and their segregation

Summary The polymerase chain reaction based restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method was used to study DLA class II gene in dogs. Genomic DNA from 11 DLA homozygous reference dogs representing 8 different haplotypes and 2 families with a total of 16 animals were amplified by the oligonucleotide primer pair (HLA-DRB-AMP-A/B) cross-hybriding HLA-DRB specific and fit for the amplification of DLA-DRB1 gene. The corresponding amplified DNA products were 235 base pairs^[1]. Amplified DNA was digested by 32 different restriction endonucleases, which could recognize allelic variations within DLA-DRB. After digesting only with Hae III, Hha I, Hinf I, Rsa I and Sau 96 I high polymorphism was revealed respectively and 9 distinct RFLP pattern were shown, which could be correlate to the DLA haplotypes studied. The 8 cellular established DLA-D specificities present in the reference panel were defined unequivocally by PCR-RFLP and correlated with DLADw5 and Dw6 two subtypes. The segregation pattern of four different DLA-DRB types could be demonstrated in two families. Based on these data we conclude that PCRRFLP typing utilizing the above mentioned primer pair and endonucleases is a valuable tool to define DLA class II types in the dog.     

RAPD技术分析嗜人按蚊种型方法的建立

目的：建立用RAPD－PCR技术鉴别中国不同纬度地区嗜人按蚊，特别是海南岛嗜人按蚊与大陆嗜人按蚊间有无种型差异的新方法。方法：收集海南，四川，江苏三地嗜人按蚊标本并传代培养，优化蚊基因组的DNA的提取纯化及RAPD－PCR扩增和产物检测的条件，筛选5条RAPD引物，结果：筛选出1条适合三地嗜人按蚊的引物并制定出了稳定的RAPD图谱，建立了RAPD－PCR分析嗜人按蚊种型的方法。结论：不同纬度三地嗜人按蚊大部分谱带是相同的，但它们的谱带数不一定相同，且少数谱带是完全不同的，初步表明我国嗜人按蚊存在一定的种型差异，从而为解释海南嗜人按蚊在生态习性和传疟作用方面为何与大陆嗜人按蚊不同从分子水平提供了一定的科学依据。     

东方田鼠特异DNA片段的克隆及核苷酸序列分析

根据泰泽氏菌rDNA序列设计出二对特异引物，以标准菌RJ株和大肠杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌纯化的DNA为模板，进行套式PCR反应。结果用外引物扩增，泰泽氏菌和大肠杆菌均出现625bp的反应带，其它细菌无反应带；而用内引物第二次扩增，只有泰泽氏菌出现196bp的特异扩增带，将PCR方法应用于人工免疫抑制的SD大鼠，检出率为30％（9／30）。同时将此30份血清用间接免疫荧光法（IFA）进行检测，结果未检出阳性样品。结果提示，套式PCR方法具有特异性强、敏感性高，简便快速的特点。     

16 SrRNA基因聚合酶链反应检测细菌感染的研究

目的：探索快速可靠的检测细菌感染的新方法。方法：通过自行设计合成的细菌１６ＳｒＲＮＡ基因高度保守区引物,对２０ 种标准菌株、１２ 种２７ 株临床分离的细菌株、人基因组ＤＮＡ及巨细胞病毒进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增。结果：对所测细菌株均获得３７１ ｂｐ 扩增产物,而与人基因组ＤＮＡ、巨细胞病毒无交叉阳性反应,ＰＣＲ最低能检测ｌｐｇ 大肠杆菌ＤＮＡ。结论：建立了用共同引物ＰＣＲ扩增以判断是否存在细菌感染的方法,该方法检测快速,敏感性和特异性高。     

5种常见念珠菌反向斑点杂交技术的研究

目的建立白色念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌的反向斑点杂交诊断技术。方法针对念珠菌ERG11保守基因设计引物和杂交探针,对探针进行标记然后固定在尼龙膜形成一种杂交膜,将PCR产物点样在杂交膜进行斑点杂交,显色。结果通过通用引物扩增五种常见念珠菌DNA片段,大小为350bp。构建了5种念珠菌的反向斑点杂交膜,与其PCR产物反应特异性好,灵敏度高。结论本研究建立的反向斑点杂交技术可快速、准确地鉴定临床常见念珠菌,有望在临床微生物诊断中广泛应用。     

尿路致病性大肠杆菌溶血素A基因的克隆和序列分析

目的构建尿路致病性大肠杆菌（Uropathogenic Escherichia coli,UPEC）溶血素A（hemolysin A,HLYA）hlya基因重组质粒。方法根据已知GenBank中的hlya基因序列,设计合成一对引物,用PCR方法从尿路致病性大肠杆菌溶血素A基因组DNA中扩增编码hlya的基因片段,克隆至pUC18质粒,转化大肠杆菌DH5aЭ感受态细胞,经酶切及PCR鉴定,而后进行测序。结果hlya基因体外扩增产物大小约744bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,测序结果与己知序列基本吻合。结论在国内首次克隆了尿路致病性大肠杆菌hlya基因,为研究hlya的功能和探讨hlya作为特异性诊断靶抗原的研究奠定了基础。