Sox2诱导小鼠胚胎成纤维细胞直接重编程为神经干细胞

目的:探讨Sox2诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)直接重编程为神经干细胞的方法,为诱导神经干细胞(induced neural stem cells,i NSCs)作为种子细胞治疗脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)奠定实验基础。方法:逆转录病毒感染Sox2转录因子的MEFs在神经干细胞培养基中贴壁培养10 d。随后,悬浮、贴壁反复循环培养3次。Real-time PCR检测神经干细胞标志基因和多潜能标志基因的表达。i NSCs在分化培养基中贴壁培养7~14 d,免疫荧光分别检测神经干细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的标志物nestin、MAP2、GFAP和MBP的表达。将i NSCs显微注射至小鼠大脑皮质,7~14 d后免疫荧光检测神经细胞标志物nestin、MAP2、GFAP和MBP的表达。结果:Real-time PCR显示i NSCs的多种神经干细胞标志基因nestin、Blbp、Pax6和zbtb16表达较诱导前显著增高(P0.05),且i NSCs不表达多潜能相关基因Nanog、Oct4和zfp42。免疫荧光显示i NSCs高表达神经干细胞标志物nestin。免疫荧光同时表明i NSCs可在体内外存活并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论:Sox2可以诱导MEFs直接重编程为神经干细胞。i NSCs具有自我更新的能力,且在体内外都具有三向分化潜能,可作为修复SCI合适的种子细胞。     

星形胶质细胞条件培养液促进新生大鼠海马神经干细胞分化

目的探讨星形胶质细胞条件培养液(ACM)对神经干细胞(NSCs)体外分化的影响。方法行新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞的纯化培养后收集ACM,将新生大鼠海马NSCs单克隆培养后行nestin免疫细胞荧光染色,诱导分化5d后行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(GALC)免疫细胞荧光染色;将单克隆培养的NSCs分为对照组和实验组,对照组为单纯NSCs培养液,实验组根据NSCs培养液与ACM比的不同分3组:A组(2:1),B组(1:1),C组(1:2)。各组培养1周,采用NSE免疫细胞荧光检测方法标记神经元并计数和统计学分析。结果纯化的星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白抗体标记阳性率为96.5%;单克隆培养的海马NSCs呈nestin阳性,诱导后呈NSE、GFAP和GALC阳性表达。ACM培养的海马NSCs各组分化为神经元的比例明显高于对照组(<0.01),其中A组的比例最高。结论ACM可以促进新生大鼠海马NSCs向神经元分化。     

神经干细胞的生物学特性和体外培养鉴定

神经干细胞(NSCs)是具有自我更新和多向分化能力的细胞,存在于胚胎、胎儿和成人的脑室下区、齿状回、纹状体、室管膜下区等部位。通过机械分离或酶消化法能从其存在部位分离出NSCs。当培养基中表皮生长因子(EGF)和成纤维生长因子(bFGF)浓度均为20ng·mL-1时,NSCs能通过对称分裂和不对称分裂在体外增殖,当培养基中bFGF浓度为1～10ng·mL时,NSCs可向神经元和胶质细胞分化。目前,表达Nestin、自我增-1殖和多潜能分化能力是鉴定NSCs的三大条件,但还没有NSCs特异性的鉴定方法。     

大面积脑梗塞患者自体神经干细胞的培养与鉴定

目的:通过改进原代培养方法,从大面积脑梗塞患者废弃脑组织中培养、传代和鉴定自体神经干细胞(NSCs),并进行诱导分化研究。方法:收集2例右侧大面积脑梗塞患者手术中废弃脑组织各1 g以上,按改良方法进行原代培养并传代,通过细胞免疫荧光染色检测NSCs标志物巢蛋白(nestin)的表达。传代培养至7代时选取部分细胞进行诱导分化研究,通过细胞免疫荧光染色检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和微管蛋白(β-tubulin)的表达来评估NSCs分化情况。结果:培养3～7 d后,2例患者废弃脑组织中均可见干细胞球生长,nestin检测呈阳性表达。经传代培养至第10代后,仍可维持其神经干细胞特征,选取7代贴壁细胞经β-Tubulin及GFAP免疫荧光检测可见阳性表达。结论:成功从大面积脑梗塞患者前颞叶(邻近于海马区)废弃脑组织中分离培养获得自体NSCs,并可向神经元样细胞及星形胶质样细胞分化。     

新生大鼠不同脑区内神经前体细胞生物学特性比较

为了观察海马、中脑和顶叶皮质内神经前体细胞的体外生长特性及其分化后所产生的神经元的形态特征,本研究使用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)体外扩增细胞技术和克隆形成实验分析了神经前体细胞的自我更新特性;采用神经前体细胞和骨髓基质细胞共培养方式,通过免疫细胞化学染色方法,研究了神经前体细胞的分化特点。结果发现:(1)新生大鼠海马、中脑和顶叶皮质内的神经前体细胞,在体外的分裂增殖能力无明显区别;(2)新生大鼠海马、中脑和顶叶皮质内的神经前体细胞在相同的条件下,其后代细胞中,神经元和胶质细胞所占的比例基本相同,但不同脑区内神经前体细胞所产生的神经元的形态却表现出明显不同。这些结果提示新生大鼠不同脑区内神经前体细胞的分化潜能已有了一定限制。     

体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为神经干细胞的实验研究

目的:探讨体外诱导小鼠胚胎干细胞(ESCs)分化为神经干细胞(NSCs)的可能性。方法: ESCs经胚胎体阶段, 以视黄酸及视网膜müller细胞诱导, 在NSCs选择性培养基中筛选培养扩增7d, 观察形态变化, 采用RT-PCR法检测nestin、glutaminase、Brn-3基因表达及免疫细胞化学法检测nestin等NSCs特异性标志物, 并对其扩增及分化能力进行观察。 结果:ESCs经初级诱导, NSCs选择性培养基筛选培养7d后, 形成大量神经球样结构, 可扩增传代。绝大部分神经球样结构呈nestin抗原阳性, 整合BrdU, 表达nestin、glutaminase、Brn-3基因, 且可分化为神经元及神经胶质样细胞。结论:视黄酸及müller细胞诱导的ESCs, 经选择性培养基筛选培养可获得NSCs, 有望为青光眼等神经变性疾病提供新的治疗途径。     

永生化神经前体细胞及其应用

神经前体细胞是在一定环境下可向神经元或神经胶质细胞分化的多潜能细胞 ,永生化神经前体细胞 ( imm ortalizedneural progenitor cells)则具有无限增殖分裂能力。基因修饰的永生化神经前体细胞的回体移植 ( ex vivo)治疗中枢神经系统 ( CNS)疾病已成为近年来神经生物学的研究热点之一 [1 ] 。将这些神经前体细胞株移植到受损的脑或脊髓组织中之后不仅可存活 ,再增殖、整合 ,并分化为神经元和神经胶质细胞 ,而且能合成神经营养因子、相关的神经递质和代谢酶。因此 ,永生化神经前体细胞为神经再生和神经行为缺陷的逆转提供了新的潜在治疗途…     

巢蛋白在垂体和垂体腺瘤中表达的研究进展

巢蛋白(nestin)是第Ⅵ类中间丝蛋白,主要在胚胎期神经前体细胞和神经干细胞一过性表达。在正常细胞演变成肿瘤细胞过程中,巢蛋白又呈现返祖性表达。近年来研究发现nestin阳性细胞散在的分布于垂体的前叶、中间部和神经部。但这些nestin阳性细胞是否包括了垂体前体细胞还不清楚。在垂体腺瘤的部分毛细血管内皮细胞中也检测到nestin的表达,推测它可作为垂体血管发生的一种检测指标。     

成年大鼠眼睫状体缘色素上皮组织的神经前体细胞的培养和鉴定

目的　探讨成年大鼠眼睫状体缘色素上皮产生神经前体细胞的潜力及其生物学特征。方法　取成年SD大鼠睫状体缘处的色素上皮组织块 ,置于含bFGF和B2 7的DMEM/F12 无血清培养液中进行神经前体细胞培养 ,免疫组化反应染色鉴定细胞的表型。结果　培养 5～ 8d ,组织块长出由众多无色素和色素细胞构成的细胞集落 ,集落的大多数细胞处于增殖状态(BrdU反应阳性 ) ,并表达神经前体细胞的标志物 (nestin)。撤掉bFGF和B2 7,加入胎牛血清培养 3～ 5d ,集落的细胞发生分化 ,分别表达神经元和星形胶质细胞的标志物 (NSE、GFAP) ,但不表达少突胶质细胞的标志物 (O4 )。结论　由成年大鼠睫状体缘色素上皮长出的细胞集落不仅含有增殖能力和多分化潜能的神经前体细胞 ,而且尚含有色素细胞 ,该部位可能是视网膜神经感觉层和色素上皮共同保守的细胞生发带     

成年小鼠室管膜下区神经干细胞分离及培养方法改良

目的:改良成鼠神经干细胞(NSCs)分离培养方法,优化培养条件,为系统研究成体干细胞增殖与分化特性以及利用成体干细胞进行细胞治疗奠定基础。方法:视交叉前1.5 mm处离段脑组织,分离前脑室管膜下区(SVZ),通过机械性消化与化学性消化相结合的操作方法制备细胞悬液,应用改良无血清培养基悬浮培养NSCs。nestin免疫荧光染色鉴定NSCs,1%胎牛血清诱导分化后免疫荧光染色鉴定NSCs多向分化潜能。系列稀释实验和5-溴脱氧尿核苷(BrdU)掺入实验比较改良培养与常规培养NSCs自我更新能力和增殖潜能。结果:改良培养条件,NSCs 7～9 d可形成nestin阳性神经球。应用1%FBS诱导后,NSCs分化为形态各异的细胞,包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,分化比例分别是(18.6±3.5)%、(73.2±5.2)%和(3.6±0.4)%。系列稀释实验结果显示当细胞接种数量为500、1000和2000个,改良培养NSCs形成次代神经球数量较常规培养对照组明显增多(P<0.05),并且8 h BrdU掺入率也显著增高达(42.4±6.2)%(P<0.05),表明改良培养条件下NSCs自我更新能力和增殖活力良好。结论:本研究建立了一种简便、操作性强、重复性高的成鼠NSCs分离培养方法。     

永久性脑缺血神经干细胞迁移和细胞分裂、增殖的研究

目的　探讨永久性脑缺血神经干细胞 (NSC)迁移是否伴随自身的分裂与增殖。方法　以永久性脑缺血大鼠为模型 ,采用免疫组化染色方法 ,观察脑缺血 1,3,7,14和 2 8dNSC迁移及增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果　室管膜下区 (SEZ)NSC和PCNA+ 细胞在缺血后沿胼胝体腹侧向缺血区方向发生了时空一致性的迁移模式 ;缺血梗死灶周围均有较多巢蛋白和PCNA阳性细胞的表达。结论　永久性脑缺血后NSC可能通过自身分裂和增殖向外迁移 ,巢蛋白和PCNA在缺血区周围表达可作为NSC迁移和增殖的标志物。     

Ependymal stem cells divide asymmetrically and transfer progeny into the subventricular zone when activated by injury

Evidence is presented to show that cells of the ependymal layer surrounding the ventricles of the mammalian (rat) forebrain act as neural stem cells (NSCs), and that these cells can be activated to divide by a combination of injury and growth factor stimulation. Several markers of asymmetric cell division (ACD), a characteristic of true stem cells, are expressed asymmetrically in the ependymal layer but not in the underlying subventricular zone (SVZ), and when the brain is treated with a combination of local 6-hydroxydopamine (6-OHDA) with systemic delivery of transforming growth factor-alpha (TGFalpha), ependymal cells divide asymmetrically and transfer progeny into the SVZ. The SVZ cells then divide as transit amplifying cells (TACs) and their progeny enter a differentiation pathway. The stem cells in the ependymal layer may have been missed in many previous studies because they are usually quiescent and divide only in response to strong stimuli.     

不同鼠龄生后大鼠海马神经干细胞的传代和分化

目的研究不同鼠龄大鼠海马神经干细胞(NSCs)的传代增殖和分化情况。方法将生后SD大鼠分为3d、10d、20d 3组,应用胰酶消化法将海马组织制成单细胞悬液,用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、B27的无血清细胞培养技术进行体外培养,单克隆培养后通过Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞、神经元、星形胶质细胞;细胞传3代后,在各组培养基中加入终浓度为10%的血清诱导分化,1周后进行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例,进行统计学分析。结果3组SD大鼠海马组织细胞,单克隆培养后表达Nestin,诱导分化后分别表达NSE和GFAP。生后3d大鼠神经干细胞在传1-6代时每代均快于生后10d和20d大鼠,传6代后,3组细胞传代时间间隔几近一致;生后3d组大鼠海马神经干细胞分化为神经元的比例较其它2组高(P<0.05)。结论生后3d大鼠神经干细胞增殖速度和分化为神经元的数量都高于10d和20d大鼠。     

自然衰老小鼠室管膜下区神经干细胞增龄性改变

目的 探讨自然衰老小鼠室管膜下区（SVZ）神经干细胞（NSCs）在衰老过程中生物学特点的改变。 方法 2月龄、28月龄小鼠,各10只,体外分离、培养、鉴定NSCs,5-溴-2-脱氧尿苷（BrdU）染色比较两组细胞的增殖水平;β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色检测细胞衰老水平;细胞内活性氧（ROS）试剂盒检测细胞ROS表达水平;Western blotting 检测细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、p16及p19蛋白表达水平;体内用巢蛋白（Nestin）/性别决定基因高迁移率组蛋白-2（Sox2）检测两组小鼠SVZ区厚度的差异。 结果 年轻、年老小鼠的神经干细胞能表达Nestin及Sox2,符合神经干细胞的表达特性。与年轻小鼠相比,年老小鼠神经干细胞的BrdU阳性细胞比例显著下降,SA-β-Gal阳性细胞百分比显著升高,细胞活性氧水平显著升高,SVZ区厚度明显变薄,差异具有统计学意义（P<0.05）。在分子水平上表现为cyclin D1蛋白表达水平明显下降,p16、p19蛋白表达水平显著升高。 结论 年老小鼠NSCs出现增龄性变化,这些变化可能在大脑衰老中起重要作用。     

联合应用EGF和NGF对成年大鼠海马神经干细胞分化的影响

目的探讨联合应用表皮生长因子(EGF)和神经生长因子(NGF)对成年大鼠海马神经干细胞(NSCs)分化的影响。方法用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子、B27的无血清细胞培养技术体外培养成年大鼠海马神经干细胞,单克隆培养细胞行Nestin免疫细胞化学染色,诱导分化1w后细胞行GFAP和NSE免疫细胞化学染色;根据培养基中所加营养因子的不同将第4代细胞分为4组培养:EGF组、EGF+NGF组、NGF组、对照组,此4组细胞培养1w后行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例后进行统计学分析。结果单克隆培养后克隆球表达Nestin,诱导分化1w后细胞表达NSE、GFAP。与空白对照组相比,EGF组、NGF组和EGF+NGF组细胞分化为神经元的比例较高(P<0.05),其中EGF+NGF组细胞的比例最高。结论单独或联合应用EGF、NGF可以促进成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化。     

条件培养液对Wistar大鼠海马神经干细胞单细胞克隆增殖的影响

目的探讨神经干细胞(NSCs)条件培养液对其单细胞克隆增殖的影响。方法采用无血清培养法体外培养Wistar大鼠海马神经干细胞并进行传代培养,然后收集神经干细胞条件培养液。第四代细胞进行单细胞克隆,并将单细胞克隆细胞分为条件培养液组、无血清培养液对照组。通过MTT法比较两组细胞的增殖情况。单克隆培养细胞行巢蛋白(nestin)免疫细胞化学染色,诱导分化后细胞行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(Galc)免疫细胞化学染色。结果单克隆培养后克隆球表达nestin,诱导分化后细胞表达NSE、GFAP、Galc,条件培养液组细胞增殖速度高于对照组。结论条件培养液能提高Wistar大鼠海马神经干细胞单细胞克隆的增殖速度。     

大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经干细胞

为了观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为神经干细胞(NSCs)的能力,本研究通过贴壁法培养大鼠BMSCs,体外培养扩增纯化后,在细胞传代时用含有表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、N2、B27的DMEM/F12的培养液制成细胞悬液,并进行诱导,观察诱导后细胞的形态及生长情况,用免疫荧光检测形成的细胞球的巢蛋白(nestin)的表达情况;形成的细胞球在含10%血清的培养液中进一步分化。结果显示:BMSCs在含EGF、bFGF、N2、B27的培养液中,逐渐形成nestin表达阳性的细胞球,在含血清的培养液中能分化为神经元样细胞、星形胶质样细胞及少突胶质样细胞。本研究结果提示经纯化的BMSCs能分化为NSCs,并具有进一步分化的能力。     

小鼠胚胎大脑皮质与中脑神经干细胞培养与分化比较的研究

目的比较小鼠胚胎脑皮质与中脑来源的神经干细胞在培养与分化方面的差异，为更好的研究和利用神经干细胞提供实验依据。方法无菌条件下分别分离鼠胚大脑皮质与腹侧中脑，经胰酶消化及机械吹打成单细胞后接种于含有B27、bFGF的DMEM／F12培养基，培养扩增；倒置显微镜观察比较生长状况；机械方法传代；10％血清接种分化；免疫荧光细胞化学方法染色鉴定神经干细胞及其子代细胞的分化方向，并作比较。结果小鼠胚胎脑皮质与中脑均存在神经干细胞，其免疫细胞化学鉴定均呈Nestin阳性，并都能分化为神经元和胶质细胞；但皮质部位所含神经干细胞明显多于中脑，也更宜成球；有血清条件下分化，皮质神经干细胞未见分化为酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元；中脑神经干细胞则可少量分化为TH阳性神经元结论同样条件下皮质神经干细胞比中脑神经干细胞更易增殖与培养，两者在有血清条件下分化为TH阳性神经元能力方面有差异。     

Nestin is required for the proper self-renewal of neural stem cells

The intermediate filament protein, nestin, is a widely employed marker of multipotent neural stem cells (NSCs). Recent in vitro studies have implicated nestin in a number of cellular processes, but there is no data yet on its in vivo function. Here, we report the construction and functional characterization of Nestin knockout mice. We found that these mice show embryonic lethality, with neuroepithelium of the developing neural tube exhibiting significantly fewer NSCs and much higher levels of apoptosis. Consistent with this in vivo observation, NSC cultures derived from knockout embryos show dramatically reduced self-renewal ability that is associated with elevated apoptosis but no overt defects in cell proliferation or differentiation. Unexpectedly, nestin deficiency has no detectable effect on the integrity of the cytoskeleton. Furthermore, the knockout of Vimentin, which abolishes nestin's ability to polymerize into intermediate filaments in NSCs, does not lead to any apoptotic phenotype. These data demonstrate that nestin is important for the proper survival and self-renewal of NSCs, and that this function is surprisingly uncoupled from nestin's structural involvement in the cytoskeleton.