载体介导的siRNA对SGC-7901胃癌细胞中hPOT1表达的抑制作用

目的构建人端粒保护蛋白（hPOT1）基因的短链干扰核糖核酸（siRNA）表达载体，观察其在胃癌细胞中抑制hPOT1基因表达的作用，为进一步研究hPOT1在胃癌细胞生长增殖中的作用打下基础。方法设计并化学合成64nt编码hPOT1 siRNA基因片段的寡核苷酸，退火成双链后将其连接到pSUPER质粒的H1 RNA启动子下游，构建psiRNA-hPOT1重组质粒。经酶切、测序鉴定后，用脂质体介导的基因转染方法，转人SGC-7901胃癌细胞，用半定量RT-PCR检测hPOT1表达水平的变化。结果测序结果表明重组质粒psiRNA-hPOT1 64个碱基成功插人到预定位置，并且序列完全一致。hPOT1 siRNA表达载体psiRNA-hPOT1转入胃癌细胞后，可明显抑制SGC-7901细胞hPOT1的表达。结论构建的hPOT1基因的siRNA表达载体psiRNA-hPOT1重组质粒能显著抑制hPOT1基因在SGC-7901胃癌细胞中的表达。     

EMMPRIN基因表达对胶质瘤U251细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨特异性小分子干扰（small interference,siRNA）抑制人脑胶质瘤U251细胞株内细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN）基因的表达后,对U251细胞株增殖、凋亡的影响。方法构建EMMPRIN基因小干扰RNA,转染人胶质瘤U251细胞株,运用半定量RT-PCR及Western blot的方法验证转染组及对照组的胶质瘤细胞EMMPRIN基因mRNA及蛋白的表达水平,通过MTT法观察转染48 h后对U251细胞增殖的变化,流式细胞术观察转染48 h后U251细胞周期及凋亡的改变。结果 EMMPRIN基因的特异性siRNA转染U251细胞后,EMM-PRIN基因的mRNA和蛋白表达水平明显降低,细胞增殖明显受到抑制,细胞凋亡增加。结论 EMMPRIN基因的特异性siR-NA能抑制胶质瘤U251细胞株的增殖,促进细胞凋亡。     

siRNA表达载体对MCF-7细胞生长及其hTERT基因表达抑制的研究

目的构建人端粒酶反转录酶(hTERT)基因的RNA干扰(RNAi)表达载体,探讨该载体对人乳腺癌MCF-7细胞生长及hTERT基因表达的影响。方法设计针对hTERT基因的干扰靶序列,构建siRNA重组表达质粒pGenesil-hTERT,将该质粒酶切测序鉴定后,以脂质体转染MCF-7细胞,RT-PCR和Western blot技术分别检测hTERT基因及其蛋白的表达,MTT法观察转染后MCF-7细胞生长情况。结果酶切电泳和测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功。该质粒转染MCF-7细胞后,hTERT基因mRNA和蛋白质的表达水平均显著降低,MCF-7细胞生长抑制。结论内源性短发夹状siRNA能有效抑制hTERT基因的表达,进而抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖生长,这也为肿瘤的基因治疗提供了实验依据。     

死亡相关蛋白激酶C末端对谷氨酸诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的抑制作用研究

目的 观察死亡相关蛋白激酶(DAPK)蛋白C-末端多肽(DCTP)对谷氨酸诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的作用,探讨DCTP抑制DAPK功能的机制.方法 采用PCR法扩增DCTP核酸片段,定向连接至质粒pEGFPN1、pIRES2-EGFP和pcDNA3.1(-),将重组质粒[pEGFPN1-DCTP、pIRES2-DCTP-EGFP和pcDNA3.1(-)-DCTP]转染至SH-SY5Y细胞中,筛选稳定细胞株.分析pEGFPN1-DCTP的表达产物在细胞中的定位.建立稳定表达DCTP的SH-SY5Y细胞.用MTT法、Hoechst33258染色法和流式细胞仪检测SH-SY5Y细胞对谷氨酸的敏感性,用Western blotting检测细胞内DAPK的表达量以及磷酸化DAPK(p-DAPK)水平的变化.结果 谷氨酸对SH-SY5Y细胞生长的抑制作用具有浓度依赖性,40mmol/L的谷氨酸对细胞的抑制率为51.7%.流式细胞仪检测结果显示,40mmol/L谷氨酸处理后细胞的凋亡率和坏死率分别为26.1%和27.7%,而正常培养细胞分别为0.08%和0%.谷氨酸诱导细胞凋亡时,p-DAPK表达下降.荧光显微镜观察可见DCTP定位于细胞质.用40mmol/L谷氨酸分别诱导转染pcDNA3.1(-)-DCTP和pcDNA3.1(-)质粒(对照质粒)的SH-SY5Y细胞,流式细胞仪检测结果显示,前者凋亡率为43.7%,而后者凋亡率为62.2%.Western blotting检测结果显示,在谷氨酸诱导下,与转染pIRES2-EGFP质粒(对照质粒)的SH-SY5Y细胞相比,转染pIRES2-DCTP-EGFP质粒的细胞内DAPK和p-DAPK水平均无明显变化.结论 DCTP基因的表达产物定位于SH-SY5Y胞质.DCTP可以抵抗谷氨酸诱导的SH-SY5Y细胞的凋亡,但并不影响DAPK的磷酸化及其表达水平.     

多效生长因子基因沉默抑制PTEN基因敲除细胞的增殖

目的：在肿瘤抑制基因PTEN缺失的小鼠胚胎成纤维细胞Pten-/-MEF241细胞中,研究多效生长因子（pleiotrophin,Ptn）对细胞增殖的影响.方法：设计并合成可编码针对小鼠Ptn基因的小干扰RNA （siRNA）寡核苷酸,构建至pSilencerTM3.1-H1载体,将载体转染进Pten^-/-MEF241细胞中,获得稳定表达细胞克隆株,通过Northern印迹检测Ptn基因表达被抑制的情况,根据细胞生长曲线检测沉默Ptn基因对Pten^-/-MEF241细胞生长的影响.结果：获得的稳定克隆株中,与对照细胞相比,Ptn基因的表达在转染Ptn siRNA-B的3株细胞中均得到了有效的抑制,而在转染Ptn siRNA-C的2株细胞中抑制效果较差.生长曲线结果显示,在Pten^-/-MEF241细胞中,沉默Ptn基因能够减缓Pten^-/-MEF241细胞的生长速度.结论：本研究获得了可有效抑制Ptn基因的小干扰RNA,证明沉默Ptn基因可抑制PTEN 基因缺失细胞的增殖,提示Ptn可作为治疗具有PTEN基因突变的肿瘤的药物靶标.     

PPARγ依赖和非依赖途径参与吡格列酮对人肝癌细胞的增殖抑制作用

目的观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）特异性外源配体吡格列酮（Pio）对体外培养的HepG2细胞增殖作用的影响,并探讨其是否通过PPARγ依赖途径发挥作用。方法将不同浓度的Pio作用于体外培养HepG2细胞,MTT比色法检测HepG2细胞增殖情况,3H-TdR掺入实验检测细胞DNA合成速率,采用RT-PCR和Western印迹检测PPARγmRNA和蛋白的表达,流式细胞术检测细胞周期;同时观察PPARγ特异性拮抗剂GW9662和（或）瞬时转染pSG5-PPARγ真核表达质粒、PPARγ小干扰RNA（pGCsi-PPARγ）表达质粒稳定转染对Pio细胞增殖作用的影响。结果 Pio作用于HepG2细胞后,导致HepG2细胞的增殖受到抑制、DNA合成速率减慢,呈一定的剂量依赖关系;在此过程中,G0/G1期细胞比例明显增加,S期细胞比例明显减少,但PPARγmRNA和蛋白的表达没有显著变化;GW9662可以部分拮抗Pio的增殖抑制效应,但转染pSG5-PPARγ真核表达质粒可以逆转GW9662的作用;利用pGCsi-PPARγ表达质粒将PPARγ基因沉默后,Pio在高浓度（20μmol/L）时亦表现出细胞增殖抑制作用。结论 Pio能够抑制HepG2细胞的增殖,该作用与其诱导细胞G0/Gl期的停滞有关,PPARγ依赖和非依赖途径参与上述过程。     

hper1干扰质粒的构建及hper1功能的初步研究

目的构建高效的针对hper1（人类period1基因）的干扰质粒，并对hper1的功能进行初步研究。方法选择4个hper1的干扰位点，根据位点序列合成构建4个pTER-hper1干扰质粒，并通过测序验证。将4种干扰质粒分别转染至SH—SY5Y细胞，经马血清休克诱导后，提取细胞总RNA，RT—PCR检测hper1 mRNA的表达，鉴定干扰效果。提取细胞总蛋白，Western Blot检测P—p44／42丝裂原活化蛋白激酶（mitagen—actinated pratein kinase，MAPK）表达。结果RT-PCR鉴定显示pTER-hper1-11干扰质粒干扰效率最高，hper1表达量降低84．9％。Western Blot显示hper1表达受抑制后，P—p44／42MAPK水平升高。结论成功构建并筛选到具有显著干扰效率的pTER—hper1干扰质粒，为进一步研究hper1的功能奠定了基础，并发现hper1对MAPK通路具有负相调控作用。     

1504-siRNA对EphA3表达肿瘤细胞HCT116的抑制作用研究

目的研究原癌基因EphA3的小干扰RNA（small interfering RNA）1504-siRNA对高表达结肠癌细胞HCT116的增殖抑制作用。方法将1504-siRNA质粒用Vigofect转染试剂瞬时转染HCT116细胞,36～48 h后,收集蛋白,用Western印迹检测EphA3及AKT信号通路中的蛋白分子表达,收集细胞,进行噻唑蓝（MTT）实验、平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。结果 1504-siRNA能抑制HCT116细胞的EphA3蛋白水平,抑制其增殖、平板克隆和软琼脂克隆的形成,抑制pmTOR、p-c-Raf、pAKT、p-4ebp1等信号分子的表达。结论 1504-siRNA抑制HCT116细胞的增殖、存活能力和恶性程度,这可能是通过抑制AKT信号通路来实现,它有望作为肿瘤治疗的候选药物。     

RNA干扰抑制胆囊癌血管内皮细胞生长因子的实验研究

目的：构建编码胆囊癌VEGF基因的短发夹状RNA（shRNA）,观察shRNA干扰对胆囊癌血管内皮细胞表达的影响。方法：根据人VEGF基因的序列选择了4个位点设计shRNA,制备VEGF-shRNA质粒表达载体,并进行测序分析。将重组质粒转染到胆囊癌细胞GBC-SD中,采用荧光PCR检测VEGF-mRNA表达情况,ELISA法及Western-blot法检测VEGF蛋白含量。结果：成功构建了靶向VEGF基因的shRNA质粒表达载体,并经测序验证。实时荧光PC分析shRNA2抑制VEGF基因的mRNA表达,抑制率可达86%.由ELISA法及Western-blot法看出ShVEGF-1、ShVEGF-2、ShVEGF-3、ShVEGF-4中VEGF的表达得到明显的抑制,且Sh-VEGF-4效果最显著（P〈0.05）,而NC细胞（阴性对照）则基本没有抑制VEGF的表达（P〉0.05）。结论：成功构建靶向VEGF的shRNA表达质粒,其对胆囊癌血管内皮细胞表达具有明显抑制作用。     

应用基因表达谱芯片筛选丙型肝炎病毒核心蛋白反式调节基因

应用基因表达谱芯片技术对HCV核心蛋白表达质粒pcDNA3.1(－）-core转染的HepG2细胞和空载体处理的相同细胞差异表达的mRNA进行检测。基因表达谱芯片所检测的1152条目的基因均与GenBank中登录的基因，HCV核心表达质粒转染的细胞有95条差异表达基因，其中45条基因表达增强，50条基因表达降低。这些核心蛋白反式调节基因与细胞增殖、分化、凋亡、信号转导及免疫调节密切相关。本实验结果为进一步阐明HCV核心蛋白致病（癌）的分子生物学机制提供了理论依据。     

存活蛋白对胶质瘤细胞替莫唑胺敏感性的影响

目的 探讨存活蛋白(survivin)对人脑胶质瘤细胞替莫唑胺(TMZ)敏感性的影响及其可能机制.方法 构建过表达survivin的U87/sur胶质瘤细胞,以及抑制survivin表达的U87/sur si胶质瘤细胞,经100μmol/L TMZ处理后,采用MTT法检测细胞增殖情况,克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力,异硫氰酸荧光素标记的膜联素V/碘化丙啶(annexin V-FITC/PI)双标记联合流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blotting检测活化caspase-3表达水平.结果 经TMZ处理后,与亲代细胞相比,U87/sur si细胞的增殖活性明显下降,克隆形成率明显降低,凋亡率明显增加,而U87/sur细胞的增殖活性明显增强,克隆形成率明显增高,凋亡率明显下降.经TMZ处理后,与亲代细胞相比,U87/sur si细胞中活化的caspase-3蛋白水平升高,而U87/sur细胞中活化的caspase-3蛋白水平下降.结论 抑制survivin可明显提高胶质瘤细胞对TMZ的敏感性,其机制可能与survivin促进细胞凋亡有关.     

siRNA沉默EPAS1基因对低氧条件下大鼠PASMCs增殖的影响

目的 探讨应用siRNA技术沉默EPAS1 (HIF-2α)基因表达对低氧条件下培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的影响.方法 原代培养大鼠PASMCs共采用免疫荧光法进行鉴定.构建特异性EPAS1 siRNA脂质体,转染PASMCs,从3个干扰靶点中选取效果最好的靶点进行干扰;在常氧(37℃、5％CO2、20％O2)和低氧(37℃、5％CO2、2％O2)条件下分别培养24、48、72h,采用Western blotting检测PASMCs中EPAS1、VEGF蛋白的表达水平,CCK-8法检测细胞增殖情况.结果 成功分离培养原代大鼠PASMCs并经免疫荧光鉴定证实.将特异性的EPAS1 siRNA脂质体转染到PASMCs,选择干扰效果最好的靶点2进行干扰.与常氧条件比较,低氧条件下PASMCs中VEGF蛋白的表达及细胞增殖水平均明显升高;沉默EPAS1后,无论低氧还是常氧条件下,PASMCs中VEGF蛋白的表达及细胞增殖水平均明显降低.结论 EPAS1基因参与了低氧条件下大鼠PASMCs增殖的调控,其调节可能是通过VEGF介导完成的.     

层粘连蛋白受体Ⅰ与hPeriod1相互作用的研究

目的寻找与节律蛋白hPeriod1（hPer1）相互作用的蛋白，并对筛选出的层粘连蛋白受体Ⅰ（Lamr1）在节律系统中的功能作初步研究。方法分别构建pGAD rec／脑cDNA文库和pGBKT7／hPer1bHLH—PAS重组诱饵蛋白质粒，酵母双杂交筛选下丘脑里与hPer1相互作用的蛋白。利用RT—PCR技术检测新蛋白在脑、肺、心、肝、肾组织中的表达及在SH—SY5Y细胞中的节律性质。通过RNA干扰技术研究新蛋白与hPer1的关系。结果通过酵母双杂交筛选，证明Lamr1能与hPer1蛋白发生相互作用。该蛋白在脑、肺、心、肝、肾组织广泛表达，灰度比较显示经马血清诱导后的SH～SY5Y细胞的hPer1表达呈现近日节律，而Lamr1表达无节律变化。RNA干扰显示hPer1表达下调不影响Lamr1的表达。结论Lamr1能与hPer1蛋白发生相互作用，但其表达在RNA水平无节律变化。Lamr1参与细胞的黏附、转移和侵袭。其前体蛋白作为核蛋白参与细胞蛋白的合成。Lamr1可能参与hPer1相关的生物节律系统的信号传出。     

Bcl-2基因特异性小干涉RNA增强食管癌细胞辐射敏感性的实验研究

目的 探讨Bcl-2基因特异性的小干涉RNA (siRNA)对食管癌细胞的辐射增敏作用。方法 构建表达Bcl-2基因特异性siRNA的真核表达载体,并借助脂质体将其转入食管癌细胞EC109。Western blot检测Bcl-2蛋白在食管癌细胞的表达,流式细胞仪检测食管癌细胞的凋亡,克隆形成实验和裸鼠移植瘤生长抑制实验检测Bcl-2基因特异性siRNA真核表达载体联合X射线照射对食管癌的生长抑制作用。结果 Bcl-2基因特异性siRNA真核表达载体可抑制Bcl-2蛋白在EC109细胞中的表达,诱导EC109细胞凋亡,增强X射线照射对EC109细胞克隆形成的抑制能力,增强X射线照射对EC109裸鼠移植瘤生长的抑制作用。结论 Bcl-2基因特异性siRNA真核表达载体可显著增强食管癌细胞对X射线照射的敏感性,具有良好的临床应用前景。     

回转器模拟微重力对神经细胞自噬的影响(英文)

目的探讨回转模拟微重力对人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)自噬的影响。方法利用回转模拟微重力的细胞学效应,回转条件下培养细胞12 h、24 h,相同条件下静置培养细胞作为对照。WesternBlot方法检测LC3蛋白表达变化水平。荧光显微镜观察GFP-LC3点状聚集物,计数含有大于5个GFP-LC3点状聚集物的细胞数量。结果回转组SH-SY5Y细胞LC3-II蛋白表达高于对照组,荧光显微镜检测到GFP-LC3点状聚集物也随之增多。结论回转可以引起SH-SY5Y细胞自噬增多。     

Upregulating DAB2IP expression via EGR-1 inhibition,a new approach for overcoming fractionated-irradiation-induced cross-tolerance to ionizing radiation and mitomycin C in tumor cells

Purpose: To evaluate the effect of fractionated irradiation (FI) on tumor cells’ sensitivity to ionizing radiation (IR) and antineoplastic drugs, and examine the potential of early growth response-1 (EGR-1) inhibition to sensitize tumor cells to IR.

Materials and methods: PC3 and HepG2 cells were subjected 10 times to γ-rays at 2?Gy. The surviving cells were named PC3/R and HepG2/R, respectively. The cells’ sensitivity to irradiation and chemotherapeutic drugs, including cisplatin (PT), doxorubicin (DOX), mitomycin C (MMC) and 5-fluorouracil (5-FU), were identified by colony formation assay and MMT method, respectively. Quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR) analysis was utilized to compare the difference of gene expression between radioresistant cells and parental cells. The small interfering RNA system was implemented to inhibit endogenous EGR-1 expression in radiation-resistant cells. Western blot was employed to identify the possible mechanism by which EGR-1 regulates cells’ radiosensitivity.

Results: FI induced cross-resistant to IR and MMC in tumor cells. Along with the reduction of ovarian cancer-2/disabled homolog 2 (DOC-2/DAB2) interactive protein (DAB2IP) expression, EGR-1 gene was upregulated in FI-treated cells. On the other hand, downregulation of EGR-1 gene expression sensitized radioresistant cells to IR accompanied by DAB2IP overexpression and STAT3 inactivation. In addition, NF-κB inhibitor, BAY11-7082 enhanced resistant cells’ radiosensitivity and chemosensitivity.

Conclusions: Conventionally FI has a higher risk of forming acquired radioresistance (ARR) in vitro. EGR-1 gene-targeted drug design could be an effective strategy to overcome DAB2IP-dysregulation-induced ARR in tumor patients.     

γ射线致旁效应细胞脆性组氨酸三联体的表达

目的 研究⁶⁰Coγ射线照射后人淋巴母细胞(AHH-1)及其旁效应细胞中脆性组氨酸三联体(FHIT)基因的表达情况,探讨FHIT基因在电离辐射旁效应中的作用。方法 旁效应细胞模型的制备:分别用不同剂量(0、2和5 Gy) ⁶⁰Coγ射线照射AHH-1细胞后,立即离心,将直接受照细胞与未受照细胞共同培养于Transwell中,此未受照细胞为旁效应1组;另将直接受照细胞培养液转移至未受照细胞培养瓶中形成旁效应2组。于照后0、6、12和24 h收集细胞,抽提细胞总RNA及总蛋白,分别应用RT-PCR和Western blot方法检测 FHIT mRNA及蛋白表达水平;并在照后即刻和24 h收集细胞,应用流式细胞仪检测细胞周期,并应用细胞计数法观察细胞增殖变化。结果 对照细胞、直接受照细胞、旁效应细胞中FHIT基因 mRNA水平变化不明显,而FHIT蛋白表达在直接受照细胞及旁效应细胞中显著下调(F=102.45.P<0.001)。细胞周期分析结果显示直接受照细胞及旁效应细胞G₂期阻滞明显,且增殖能力明显下降。结论 2、5 Gy⁶⁰Coγ射线照射能导致直接照射AHH-1细胞及其旁效应细胞FHIT蛋白表达明显下调,提示FHIT基因在电离辐射旁效应中发挥一定作用。     

Egr-1调控元件启动的造血因子基因转移对辐射损伤的骨髓基质细胞的保护作用

目的：观察基因修饰的骨髓基质细胞对辐射的耐受作用。方法：通过辐射对CFU－F形成的影响制作细胞存活曲线分析造血因子双顺反子基因修饰的基质细胞（HFCL／FG和HFCL／EFG）的对辐射的耐受，采用3H－TdR掺入法验证上述结果，观察转染细胞对粒系祖细胞生长的影响，结果：HFCL／FG和HFCL／EFG细胞生存曲线的肩明显增宽，D0值增大，N和Dq值增大，3H－TdR掺入实验也验证了该结果，这种细胞对粒系祖细胞的扩增作用明显增强。结论：造血因子基因修饰的骨髓基质细胞具有抗辐射和支持造血作用。     

HIP1基因沉默对人前列腺癌PC-3细胞增殖的影响

目的研究HIP1基因沉默对人前列腺癌PC-3细胞增殖的影响。方法构建靶向HIP1的shRNA表达载体pSilence-shHIP1,应用脂质体转染到PC-3细胞,RT-PCR检测HIP1基因沉默效果,Western blotting确认有效作用靶点。通过细胞划痕实验和细胞生长曲线研究HIP1基因对PC-3细胞增殖的影响。结果转染PC-3细胞后,沉默HIP1基因效率达83%(P<0.01);Western blotting证实该基因片段为抑制HIP1的有效作用靶点。细胞划痕实验和生长曲线显示HIP1基因沉默可抑制PC-3细胞的增殖。结论 pSilence-shHIP1表达载体可特异性地抑制HIP1基因的表达,沉默HIP1基因可抑制PC-3细胞增殖和迁移。