丹参类贝壳杉烯氧化酶(SmKOL)基因全长克隆及其生物信息学分析

根据丹参转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用RACE方法克隆类贝壳杉烯氧化酶(Sm KOL)全长c DNA,并进行生物信息学分析;采用实时定量PCR检测茉莉酸甲酯(Me JA)诱导丹参毛状根不同时期的Sm KOL表达水平。克隆得到的Sm KOL全长c DNA由1 884个核苷酸组成,具有完整编码框,编码519个氨基酸,蛋白相对分子质量约为58.88 k Da,等电点p I 7.62;实时定量PCR结果表明该基因受Me JA诱导后,表达水平在36 h时达到最大值。从丹参毛状根中克隆得到1条Sm KOL全长c DNA,为进一步研究该基因的功能和丹参次生代谢调控机制提供了靶基因。     

丹参蛋白激酶SmSnRK2.4的克隆及表达分析

蔗糖非酵解型蛋白激酶家族2(SnRK2)在逆境植物信号转导途径中起着重要作用。该研究根据丹参转录组数据从丹参c DNA中克隆得到一个SnRK2家族基因,命名为Sm SnRK2.4,属于Ⅰ类SnRK2。Sm SnRK2.4基因包含8个内含子,9个外显子,其开放阅读框1 068 bp,编码355个氨基酸,推测其蛋白相对分子质量为40.63 k Da,将其构建到原核表达载体p MAL-c2X上,原核诱导表达出与预测蛋白大小一致的目的蛋白。依据丹参基因组序列,Plant CARE分析Sm SnRK2.4起始密码子ATG上游3 0 0 0 bp的启动子系列,结果显示该序列包含I-box,GA-m otif,H SE,LTR,TC-rich repeats等逆境胁迫响应元件,以及GARE-m otif,P-box,ABRE,CGTCA-m otif等激素响应元件。实时荧光定量PCR分析表明Sm SnRK2.4在丹参根中的含量较高,在茎中和叶中含量相当,ABA和PEG胁迫响应分析表明,Sm SnRK2.4对PEG渗透胁迫响应显著,对ABA胁迫响应微弱。该研究为进一步探讨Sm SnRK2.4基因在丹参干旱胁迫下次生代谢产物积累机制中的作用奠定了基础。     

丹参中转录因子SmMYB87基因的克隆、亚细胞定位和表达分析

目的克隆丹参Salvia miltiorrhiza中第14亚群R2R3 MYB转录因子基因SmMYB87的全长序列,并对其进行生物信息学和表达分析。方法以丹参总RNA为模板,利用同源克隆和c DNA快速扩增(RACE)技术获得SmMYB87 cDNA全长序列。运用生物信息学软件对该基因及其编码蛋白进行结构和理化性质分析,利用q RT-PCR测定SmMYB87在各器官中的表达并构建融合表达载体pTF-486-SmMYB87分析SmMYB87蛋白的亚细胞定位。结果 SmMYB87基因含有2个内含子和1个732 bp的开放阅读框(ORF),编码243个氨基酸。该基因在根、茎、叶和花中均有表达,且4个器官中的表达量没有显著差异。SmMYB87蛋白在细胞核和细胞膜上均有分布。结论 SmMYB87的序列结构和表达分析为进一步研究其在丹参中的生物学作用奠定了理论基础。     

红花2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶基因的克隆及表达分析

目的克隆红花维生素E合成相关关键酶2-甲基-6-叶绿基-1,4-苯醌甲基转移酶(MPBQ MT)基因,并进行生物信息学及表达分析,为红花维生素E生物合成及调控机制研究奠定基础。方法根据红花种子转录组数据库中得到的中间序列,采用RT-PCR和RACE方法从红花种子中克隆MPBQ MT基因序列,通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,构建MPBQ MT与相关物种MPBQ MT的系统进化树,利用RT-PCR方法分析在红花种子不同发育时期MPBQ MT基因的表达量。结果MPBQ MT基因全长1 392 bp,命名为Ct MPBQ MT,具有完整的开放阅读框(ORF),共1 038 bp,编码345个氨基酸。生物信息学分析显示,该基因编码的蛋白理论相对分子质量约为38 900。保守结构域预测表明,该基因编码的蛋白具有典型的SAM蛋白功能结构域。结合其他物种的MPBQ MT基因构建系统树表明,红花MPBQ MT基因与其他物种氨基酸具有一定的同源性,其中与向日葵和生菜同源性高达89%和86%。实时荧光定量PCR分析表明,MPBQ MT基因在红花开花后50 d的种子中表达量最高。结论成功地对MPBQ MT基因进行克隆及表达分析,为红花维生素E合成及调控机制研究奠定基础。     

铁皮石斛中性/碱性转化酶(DoNI2)基因的克隆和表达分析

目的克隆珍稀濒危兰科药用植物铁皮石斛中性/碱性转化酶(alkaline/neutral invertase,NI)家族基因成员,并对其进行定量表达以及生物信息学分析。方法采用转录组测序和RACE技术相结合克隆NI基因的cDNA序列,利用生物信息学工具对其进行分析,并采用实时荧光定量PCR方法检测NI基因在铁皮石斛根、茎和叶中的表达情况。结果克隆获得1个新的铁皮石斛NI基因,命名为DoNI2(Gen Bank登录号KY794404),全长2 397 bp,开放阅读框(ORF)为1 836 bp,编码611个氨基酸。DoNI2蛋白预测的理论相对分子质量和等电点分别为69 050和6.38,不稳定系数为42.95,疏水性系数为-0.232。DoNI2基因在铁皮石斛根、茎和叶中均有表达,其中在茎中表达量最高,根中最低。不同生长年限茎中DoNI2基因表达量与NI酶活性呈显著正相关。结论克隆了线粒体型的DoNI2基因的全长c DNA序列,为进一步阐明该基因在铁皮石斛蔗糖代谢途径中的重要作用奠定基础。     

滇龙胆3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因克隆、表达及分析

目的:从药用植物滇龙胆中克隆得到3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase,HMGR)基因的c DNA全长,构建原核表达载体使其在大肠埃希菌中表达,对其进行定量表达并进行生物信息学分析。方法:利用PCR扩增克隆得到滇龙胆HMGR基因c DNA全长。构建p EASY-E1-HMGR表达载体,IPTG诱导表达。利用生物信息学方法分析克隆到的c DNA序列并预测结构和功能。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)分析滇龙胆根、茎、叶在4个不同发育时期的HMGR表达情况。结果:克隆出两组HMGR基因,其中一组HMGR c DNA全长1 747 bp,开放阅读框长1 697 bp,编码565个氨基酸,定名为GRHMGR-1;另一组HMGR c DNA全长1 731 bp,开放阅读框长1 572 bp,编码523个氨基酸,定名为GRHMGR-2。SDS-PAGE显示重组质粒成功表达目的蛋白。Blastp发现,GRHMGR-1,GRHMGR-2与同属植物黄龙胆、秦艽的亲缘关系最为相近。结构分析显示都含有2个HMG-CoA结合位点,2个NADPH结合位点,预测都定位于内质网上。HMGR在滇龙胆根、茎、叶这4个不同发育期均有表达,表达量最高的是叶。结论:首次从滇龙胆中克隆到可能编码HMGR酶的基因,可为深入探讨滇龙胆龙胆苦苷生物合成奠定基础。     

丹参转录因子SmbHLH93的克隆及表达模式分析

目的 克隆丹参碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)类转录因子SmbHLH93,并初步探究该基因的功能.方法 采用PCR和RT-PCR技术分别从DNA和cDNA水平克隆得到了SmbHLH93基因,进一步通过BD Walking获得了该基因的5'启动子区.生物信息学分析SmbHLH93蛋白的理化性质、结构特点和系统进化关系.结合启动子区分析软件和qPCR,研究SmbHLH93在丹参不同部位和环境诱导下的表达模式.结果 获得SmbHLH93基因序列954 bp和5'启动子区1 583 bp,其中开放阅读框(ORF)657 bp,有3个内含子和4个外显子,编码218个氨基酸,含有bHLH和ACT_UUR-ACR-like结构域,无跨膜区域,可能定位于细胞核.表达模式分析结果显示该基因的表达量在根中最高,茎中最低,且随着花的形成逐渐降低.光和低温诱导SmbHLH93的高表达,而水杨酸(SA)抑制其表达.结论 克隆得到丹参bHLH类转录因子新成员SmbHLH93,初步预测其参与了丹参花的发育过程和丹参次生代谢途径的调控.     

金铁锁鲨烯环氧酶基因的克隆与表达北大核心CSCD

目的:从金铁锁Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu中克隆三萜皂苷合成途径中的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因,并进行生物信息学和表达分析。方法:在转录组数据分析的基础上,利用RTPCR方法获得金铁锁SE基因的两个克隆的全长c DNA序列及进行生物信息学分析;并进行Real-time PCR实验,测定SE在不同组织中的表达量。结果:得到2条SE c DNA,SE-1全长1 642 bp,开放阅读框1 578 bp,编码525个氨基酸;SE-2全长1 552 bp,开放阅读框1 446 bp,编码481个氨基酸;构建了p EASY-E1-SE-1及p EASY-E1-SE-2重组质粒,获得稳定的原核表达体系,SDS-PAGE结果表明所表达的蛋白与预测的蛋白大小一致。Real-time PCR结果表明SE-1、SE-2基因在根中的表达量均高于茎和叶。结论:从金铁锁中成功克隆了SE基因,可为进一步研究金铁锁中三萜皂苷合成代谢途径及其关建酶表达模式奠定基础。     

红花天冬氨酸激酶基因片段的分离及表达分析

目的克隆红花种子中的天冬氨酸激酶(aspartokinase,AK)基因并研究其在种子不同发育时期的表达量。方法根据红花转录组文库注释信息筛选与红花天冬氨酸激酶(Ct AK)基因相关的Unigenes,设计引物,以红花种子总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增Ct AK基因片段并连接到克隆载体上,经PCR及酶切鉴定,筛选阳性克隆进行测序。同时利用荧光定量PCR技术对其进行基因表达量的分析。结果克隆了红花Ct AK基因的核心片段,分离到486 bp的基因序列。根据Ct AK基因片段设计引物,对不同品种不同发育时期红花种子进行荧光定量PCR分析,Ct AK基因在红花品种川红1号初花后13 d表达量最高。结论系统发育树分析表明,该基因与其他物种的AK基因具有较高的同源性。     

金铁锁鲨烯环氧酶基因的克隆与表达

目的:从金铁锁Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu中克隆三萜皂苷合成途径中的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因,并进行生物信息学和表达分析。方法:在转录组数据分析的基础上,利用RTPCR方法获得金铁锁SE基因的两个克隆的全长c DNA序列及进行生物信息学分析;并进行Real-time PCR实验,测定SE在不同组织中的表达量。结果:得到2条SE c DNA,SE-1全长1 642 bp,开放阅读框1 578 bp,编码525个氨基酸;SE-2全长1 552 bp,开放阅读框1 446 bp,编码481个氨基酸;构建了p EASY-E1-SE-1及p EASY-E1-SE-2重组质粒,获得稳定的原核表达体系,SDS-PAGE结果表明所表达的蛋白与预测的蛋白大小一致。Real-time PCR结果表明SE-1、SE-2基因在根中的表达量均高于茎和叶。结论:从金铁锁中成功克隆了SE基因,可为进一步研究金铁锁中三萜皂苷合成代谢途径及其关建酶表达模式奠定基础。     

丹参转录因子SmWRKY14基因的克隆及表达分析

目的 克隆丹参Salvia miltiorrhiza转录因子基因SmWRKY14,分析其在不同组织及应答环境因子和植物激素过程中的表达特征。方法 以丹参转录组数据中Unigene（c50007_g1）序列为参考,利用PCR扩增获得SmWRKY14基因序列。通过生物信息软件及在线工具预测基因编码蛋白的理化性质、蛋白质结构等分子特征,采用DNAMAN和MEGA 6.0分别进行氨基酸多序列比对和进化树构建,运用实时荧光定量PCR检测该基因的表达模式。结果 克隆得到SmWRKY14基因cDNA全长1 103 bp,编码244个氨基酸,相对分子质量27 600,等电点8.19。该蛋白含有WRKY特征基序,不含信号肽及跨膜结构域,其高级结构主要由无规卷曲构成。进化树分析表明SmWRKY14蛋白与柿WRKY14蛋白的亲缘关系最近。SmWRKY14基因在丹参中各器官中为组成型表达,且该基因与丹参酮合成关键酶基因DXS、GGPPS、CPS的表达模式相似,且受茉莉酸甲酯、脱落酸、赤霉素等植物激素及机械损伤的强烈诱导。结论 获得丹参SmWRKY14基因序列、生物信息及表达特征,为研究WRKY家族成员调控丹参酮类化合物的合成、应答植物激素及参与防御反应的分子机制提供理论依据。     

白花丹参丙酮酸脱羧酶基因的克隆和表达分析

目的 获得白花丹参丙酮酸脱羧酶(SmPDC)全长基因,分析该基因在白花丹参不同组织部位,以及缺氧胁迫处理后的该基因表达差异.方法 利用cDNA文库筛选获得SmPDC基因全长,利用半定量RT-PCR,分析SmPDC基因在白花丹参不同部位的表达情况,及缺氧处理条件下的表达情况.结果 获得的SmPDC基因由2 190个核苷酸组成,编码605个氨基酸,蛋白相对分子质量药6.485×104,等电点pI 5.49;半定量RT-PCR检测,该基因在丹参的根中表达量最高,其次是茎和叶;缺氧胁迫处理会诱导该基因的表达,随胁迫时间延长表达量逐渐增加.结论 白花丹参SmPDC基因是PDC家族新成员,其功能与植物耐缺氧代谢途径有关.     

接骨草HMGR基因cDNA克隆、不同器官中的差异表达及生物信息学分析

目的克隆接骨草Sambucus chinensis 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因并分析其差异表达。方法采用RT-PCR方法获得HMGR基因c DNA序列,并对HMGR蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三级结构预测分析,并预测该蛋白功能;利用实时荧光定量PCR方法检测HMGR基因在接骨草的根状茎、地上茎、叶、花中的表达情况。结果克隆获得的HMGR基因c DNA全长为1 626 bp,编码593个氨基酸。生物信息学预测HMGR蛋白含2个跨膜区,不含信号肽。HMGR基因主要在接骨草的花和地上茎中表达较高,其他器官表达相对较低。结论首次从接骨草中克隆了HMGR基因,为进一步阐明该基因在接骨草萜类化合物代谢途径中的重要作用奠定基础。     

2个丹参鲨烯合酶基因的克隆和鉴定

目的 克隆与鉴定丹参Salvia miltiorrhiza鲨烯合酶基因。方法 基于丹参基因组的基因预测结果设计引物,通过RT-PCR方法,克隆丹参鲨烯合酶基因。利用生物信息软件对基因序列进行了结构分析,对基因编码多肽进行了序列同源性比较和保守结构域分析,利用实时定量RT-PCR方法对基因进行表达模式研究。结果 通过RT-PCR方法扩增得到2个丹参鲨烯合酶基因（SmSQS1和SmSQS2）,它们编码的多肽具有鲨烯合酶相关结构域和保守基序。这2个基因具有不同的外显子/内含子结构特征,具有不同的组织特异性表达模式和时间表达模式。结论 丹参基因组中存在2个鲨烯合酶基因,它们具有不同的基因结构特征和表达模式,可能在丹参甾体类和三萜类化合物生物合成中起不同作用。     

铁皮石斛F-box蛋白基因DoSKP2A的克隆与表达分析

目的克隆珍稀濒危兰科药用铁皮石斛F-box蛋白基因即S期激酶相关蛋白(S phase kinase-associated protein)基因DoSKP2A,并进行生物信息学和表达特征分析。方法采用RACE技术获基因全长;利用生物信息软件预测基因编码蛋白的理化性质、结构域和亚细胞定位等分子特性;用DNASTAR 7.0和MEGA 7.0分别进行氨基酸多序列比对和进化树构建;借助定量PCR检测基因表达模式。结果克隆到DoSKP2A(GenBank注册号KU160472),c DNA全长1 507 bp,开放阅读框(ORF)长1 101 bp,编码蛋白含366个氨基酸,相对分子质量39 590,等电点7.9。DoSKP2A蛋白不含跨膜域和信号肽,包含F-box核心结构域(26～88)、亮氨酸重复序列LRR(202～226)和多个保守基序;Do SKP2A与植物SKP2As蛋白一致性为64.6%～72.4%,所在分支隶属于SKP2As分子进化的单子叶植物分支,与小兰屿蝴蝶兰SKP2A亲缘关系近;DoSKP2A基因转录本在石斛3种器官中为组成型表达,根中相对表达量较高,为叶中的6.16倍,茎中次之,叶中表达量很低。结论获得一个全新的铁皮石斛F-box蛋白基因DoSKP2A全长、生物信息及其表达特征,为研究其在铁皮石斛生长发育、信号传导和抗逆境胁迫的分子机制提供基础。     

黄花蒿MCS基因的克隆及其序列分析与原核表达

目的 从黄花蒿中克隆MEP途径关键酶2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合成酶(MCS)基因,进行序列特征分析、原核表达以及组织表达的研究.方法 根据黄花蒿MCS (AaMCS)基因EST序列,克隆MCS cDNA及基因组序列.将MCS编码区与表达载体pET-21a(+)重组,构建pET-21a (+)-MCS的原核表达载体并转入大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG诱导获得MCS融合蛋白.半定量RT-PCR检测MCS的组织表达情况.结果 AaMCS cDNA全长994 bp,包含681 bp的开放阅读框,编码226个氨基酸,基因全长2 540 bp,包含3个外显子和2个内含子.构建pET-21a (+)-MCS重组质粒,获得稳定的pET-21a (+)-MCS原核表达体系.AaMCS在根、茎、叶、花中均有表达,其中花中表达量较高,根和茎中表达量低.结论 克隆了AaMCS基因,建立pET-2 1a (+)-MCS稳定的原核表达体系,为研究AaMCS蛋白的活性及其功能奠定了基础.     

人参PgWRKY22基因的克隆及在磷胁迫下的表达分析

目的 克隆人参Panax ginseng转录因子基因PgWRKY22,进行生物信息学、亚细胞定位及外源磷胁迫表达分析。方法 根据人参转录组数据库设计特异性引物,PCR扩增PgWRKY22全长cDNA序列,命名为PgWRKY22,并对其进行生物信息分析;构建绿色荧光融合表达载体PgWRKY22-eGFP,利用农杆菌侵染烟草叶片的瞬时表达法分析亚细胞定位;实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测PgWRKY22在人参组织中的表达特异性以及在外源磷作用下的表达模式。结果 人参转录因子基因PgWRKY22的cDNA序列为975 bp,编码324个氨基酸;PgWRKY22蛋白属于WRKY超家族蛋白,具有典型的WRKY结合域,该蛋白不稳定,属于亲水性蛋白,无规则卷曲为主要组成部分;PgWRKY22蛋白与丹参SmWRKY、葡萄VvWRKY22、长春花CrWRKY22、独脚金SaWRKY27蛋白具有较高的同源性,与西洋参PqWRKY1、PqWRKY2,人参PgWRKY1、PgWRKY3、PgWRKY4具有较近的系统发育关系;亚细胞定位显示PgWRKY22定位于细胞核上;qRT-PCR表明PgWRKY22在人参的侧根和主根中表达较高,在叶和茎中次之;在外源磷浓度为2 mmol/L下的表达显著高于其他磷浓度下的表达。结论 克隆获得PgWRKY22的cDNA序列及表达信息,可为后续进行基因功能鉴定和人参栽培的磷营养调控提供参考。