人羊膜上皮细胞培养液抑制角膜新生血管的实验研究

背景 角膜新生血管(CNV)是一种常见的眼部病变,研究其发病机制及其抑制剂是眼科研究的热点和难点. 目的 研究人羊膜上皮细胞(AECs)培养液对CNV的抑制作用及机制. 方法 消化法培养及鉴定人AECs,并收集培养液,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测色素上皮衍生因子(PEDF)和白细胞介素1受体拮抗剂( IL-1Ra)在培养液中的质量浓度.兔角膜上皮细胞分离后分别用无血清DMEM培养基、人AECs培养液、混合培养液(DMEM+人AECs培养液)培养48 h,采用实时定量聚合酶链反应(QRT-PCR)法检测不同培养液培养的角膜上皮细胞中血管内皮生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达.用含质量分数10％胎牛血清的DMEM培养基培养人脐静脉血管内皮细胞(UVECs),并分别加入无血清DMEM、混合培养液和人AECs培养液,划痕法和细胞计数试剂盒8(CCK8)法检测各组培养液对人UVECs迁移的影响.分别在上述3种培养基中加入终质量浓度为50 μg/L的bFGF,CCK8法检测各培养液中人UVECs的增牛情况.在原子力显微镜(AFM)下观察人AECs培养液对人UVECs超微结构的影响. 结果 人羊膜培养和传代细胞角蛋白免疫组织化学染色阳性证实为人AECs.与无血清DMEM组相比,人AECs培养液组的兔角膜上皮细胞VEGF mRNA(1.00±0.22 vs.2.98±0.46)及bFGF mRNA( 1.00±0.36vs.2.55±0.48)的表达均明显下降,差异均有统计学意义(P=0.001、0.002);培养后不同时间人AECs培养液组人UVECs的增生吸光度(A)值明显下降,差异均有统计学意义(P＜0.05),人UVECs的迁移率下降,差异有统计学意义(P＜0.05).AFM观察见人AECs培养液组的血管内皮细胞膜粗糙、表面颗粒紊乱,细胞间连接及伪足减少.ELISA法检测人AECs培养液中PEDF的质量浓度为(70.41 ±0.68) μg/L,IL-1Ra的质量浓度为(153.56±0.36) ng/L,无血清DMEM组中未检出.结论 人AECs培养液可抑制角膜上皮VEGF及bFGF的表达,抑制血管内皮细胞的增生和迁移,细胞结构和功能改变,这可能是其抑制CNV的机制之一.     

软骨源抑制因子抑制角膜新生血管的实验研究

目的 观察软骨源抑制因子（ＣＤＩ）在活体状态下对角膜新生血管的抑制效果。方法 制备高纯度的ＣＤＩ和４组（６４只眼）的兔角膜新生血管模型,采用角膜微袋分析技术和病理方法定量检测,观察在不同情况下ＣＤＩ对角膜新生血管的抑制作用。结果 纯化的ＣＤＩ对角膜新生血管的生长速度和生长面积均有显著的抑制作用（Ｐ〈０．００１）。结论 纯化的ＣＤＩ在一定条件下能特异性地抑制机体组织中的角膜新生血管生长,抑制效果呈剂     

抑制角膜新生血管的研究

角膜的透明特性是其发挥正常生理功能的基础,但在感染、机械及化学损伤等病理情况下可以导致角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)生成,使其失去原有的透明性,严重损害视力。近年来,随着免疫学、分子生物学、生物化学等学科发展,对CNV的认识更加深入,临床上CNV的治疗也不断取得新的突破。本文将主要对抑制角膜新生血管研究方面进行综述。     

抑制角膜新生血管形成的实验研究

各种病理条件可导致角膜新生血管(CNV)形成,常加重角膜昆浊,也是角膜移植手术失败的重要原因.近年来,随着分子生物学的发展和新技术的提高,对角膜新生血管的研究取得了突飞猛进的进展.在研究角膜新生血管形成机制的同时,更多的是探索抑制角膜新生血管形成的有效途径.概括地说,主要有从减少刺激角膜新生血管生成的刺激因子和增强有抑制角膜新生血管形成作用的抑制因子两个途径.     

抑制角膜新生血管生长的研究进展

角膜新生血管(CNV)多见于感染、炎症、外伤或角膜手术后。CNV是眼表疾病的显著特征之一,血管化的角膜不但严重影响视力,而且是角膜移植失败的主要原因。近年来,随着对CNV的深入研究,在血管的形成机制和治疗方面取得了一些成果,主要就CNV治疗的新进展作一综述。     

血管抑素抑制大鼠角膜新生血管的研究

目的研究血管抑素（AS）对大鼠角膜碱烧伤后新生血管的抑制作用。方法120只Wistar大鼠制作碱烧伤角膜新生血管（CNV）模型,随机分为4组,分别为2.5μgAS组、5μgAS组、地塞米松组、生理盐水组,每组30只。分别给予2.5μg/0.1mLAS、5μg/0.1mLAS、0.1mg/0.1mL地塞米松、生理盐水各0.1mL,球结膜下注射,隔日1次,共4次。在大鼠角膜碱烧伤后不同时间裂隙灯下观察大鼠角膜混浊度,计算新生血管面积,分析角膜组织病理切片。结果2.5μgAS组、5μgAS组及地塞米松组在第7、10、14天较生理盐水组角膜混浊程度轻,差异均有统计学意义（P〈0.05）;2.5μgAS组、5μgAS组及地塞米松组在碱烧伤后第3天起各时间点新生血管面积小于生理盐水组,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论AS能有效抑制大鼠角膜碱烧伤后CNV的形成。     

人Kringle1-5蛋白滴眼液抑制兔角膜新生血管的研究

目的:观察人Kringle1-5(K1-5)蛋白滴眼液来观察其抑制角膜新生血管的效果。方法:随机将缝线法诱导单侧角膜新生血管的28只新西兰白兔分为两组。K1-5组给予人K1-5蛋白滴眼液点眼,PBS组给予PBS液点眼。观察两组角膜新生血管形成时间、最长新生血管、新生血管面积并进行统计学分析。随机选择处死实验兔,取下角膜组织进行病理检查。结果:K1-5组最早于3d,平均3.50±0.52d可见新生血管芽进入角膜缘,9～15d新生血管生长最为旺盛;20d时最长新生血管为4.38±0.27mm,新生血管面积27.51±4.19mm2。而对照组最早于2d,平均2.28±0.47d可见新生血管芽进入角膜缘,4～10d时新生血管生长最为旺盛;至20d时新生血管最长为7.33±0.46mm,新生血管面积为38.96±4.11mm2。两组角膜新生血管出现时间、最长新生血管、新生血管面积方面均具有统计学差异(P<0.01)。在不同时段里K1-5组角膜基质层缝线周围新生血管较少,局部有少量浆细胞及成纤维细胞;PBS组新生血管较多,局部有较多浆细胞、淋巴细胞、成纤维细胞。K1-5组在不同时段里角膜组织中VEGF121阳性表达少于PBS组。结论:人K1-5蛋白点眼能够抑制缝线法诱导的角膜新生血管形成和生长。     

抑制角膜新生血管形成的实验研究

各种病理条件可导致角膜新生血管(CNV)形成,常加重角膜昆浊,也是角膜移植手术失败的重要原因.近年来,随着分子生物学的发展和新技术的提高,对角膜新生血管的研究取得了突飞猛进的进展.在研究角膜新生血管形成机制的同时,更多的是探索抑制角膜新生血管形成的有效途径.概括地说,主要有从减少刺激角膜新生血管生成的刺激因子和增强有抑制角膜新生血管形成作用的抑制因子两个途径.     

抑制角膜新生血管形成的实验研究

各种病理条件可导致角膜新生血管(CNV)形成,常加重角膜昆浊,也是角膜移植手术失败的重要原因.近年来,随着分子生物学的发展和新技术的提高,对角膜新生血管的研究取得了突飞猛进的进展.在研究角膜新生血管形成机制的同时,更多的是探索抑制角膜新生血管形成的有效途径.概括地说,主要有从减少刺激角膜新生血管生成的刺激因子和增强有抑制角膜新生血管形成作用的抑制因子两个途径.     

氨氯吡脒抑制碱性成纤维细胞生长因子诱导的角膜新生血管

目的 探讨氨氯吡脒是否能抑制碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）诱导的角膜新生血管形成（ＣＮＶ）。方法 每只兔眼角膜基质层内植入ｂＦＧＦ１０００ｎｇ缓释小丸,诱发ＣＮＶ。实验组兔每天腹膜下注射氨吡脒３０ｍｇ,共５天;对照组不用该药,定量分析ＣＮＶ的面积,结果 实验组ＣＮＶ较对照组减少６９．３２％（Ｐ〈０．００１）。结论 尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活物的抑制剂氨氯吡脒可显著抑制ｂＦＧＦ诱导的ＣＮＶ。     

Inhibitory effects of bevacizumab on angiogenesis and corneal neovascularization

Background

To evaluate the inhibitory effects of bevacizumab (Avastin®) on angiogenesis using cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) in vitro and on corneal neovascularization by subconjunctival injection of bevacizumab in vivo.

Methods

After the HUVECs were exposed to different concentrations of bevacizumab stimulated with VEGF (10 ng/ml) for 2, 6, and 24 hours, cellular-activity-like proliferation, migration and tube formation were assessed. Subconjunctival injection of bevacizumab (2.5 mg/0.1 ml) was performed after corneal chemical burn injury. Then the cornea was evaluated by biomicroscopy, fluorescein angiography, and light microscopy.

Results

The inhibitory effects of bevacizumab on VEGF-induced HUVECs proliferation showed a dose-dependent response for 2 and 6 hours, but all groups were effectively inhibited regardless of the concentration of bevacizumab for 24 hours. The inhibitory effects of bevacizumab on the migration of VEGF-induced HUVECs showed a time- and dose-dependent response. The inhibitory effects of bevacizumab on VEGF-induced HUVECs tube formation showed a dose-dependent response only for 24 hours. On days 3 and 8 after the subconjunctival injection, bevacizumab-treated eyes showed less neovascular growth than BSS-treated eyes in biomicroscopic, fluorescein angiographic, and light microscopic findings in vivo.

Conclusions

Bevacizumab effectively inhibits angiogenesis and corneal neovascularization, and could be used as a inhibitor of corneal neovascularization in the future.

     

人脐静脉内皮细胞移植治疗角膜内皮功能衰竭的动物实验研究

目的：探讨异种脱细胞角膜基质为载体培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行后板层角膜移植（PLEK）治疗角膜内皮衰竭的可行性。方法：新西兰白兔30只,随机分为3组,实验组、基质组和对照组,每组10只,术中去除角膜内皮细胞,建立角膜内皮衰竭动物模型,实验组和基质组行后板层角膜移植术,对照组仅去除角膜后板层组织,不进行移植。术后观察3mo,对三组角膜的水肿混浊程度和中央角膜厚度进行统计学分析。结果：术后7d,实验组角膜水肿程度较基质组和对照组明显减轻,透明度增加。术后3mo时,实验组内皮细胞密度为2 026.4±129.3个/mm2,中央角膜厚度平均为505.2±25.4μm,基质组中央角膜厚度平均为1 535.6±114.5μm,而对照组为1 493.5±70.2μm。结论：实验以异种脱细胞角膜基质为载体培养人脐静脉内皮细胞,行后板层角膜移植术,治疗角膜内皮衰竭取得了初步成功。移植的人脐静脉内皮细胞能够在活体上成活,并具有一定的角膜内皮细胞的生物学功能,维持角膜透明,为临床上治疗角膜内皮疾病提供了新的思路和方法。     

反应停对大鼠碱烧伤诱导角膜新生血管的影响

目的:研究反应停(thalidomide)对碱烧伤诱导角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)的影响。方法:建立大鼠角膜碱烧伤诱导CNV模型,SD大鼠36只随机分成角膜新生血管对照组(A组)、反应停灌胃组(B组)和反应停球结膜下注射组(C组)。采用裂隙灯照相、免疫组化和RT-PCR等方法,检测碱烧伤后各时间点不同处理方法大鼠CNV的生长情况及VEGF的表达情况。结果:B组和C组的角膜新生血管面积和VEGF的表达均显著少于A组(P均(0.05);C组的角膜新生血管面积和VEGF的表达少于B组(P均<0.05)。结论:反应停可有效抑制大鼠角膜碱烧伤诱发CNV的生长,降低角膜新生血管VEGF的表达。球结膜下注射较全身应用更有效。     

DATS对缝线诱导的大鼠角膜新生血管的影响及机制研究

目的：探讨二烯丙基三硫化物(diallyl trisulfide,DATS)抑制缝线诱导的大鼠角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)的生长情况,检测大鼠新生血管化角膜中VEGF、p-AKT 的表达量,初步探讨其抑制CNV的可能机制。

方法：缝线法诱导大鼠CNV模型,随机分为A组：含DMSO的生理盐水对照组(10只); B组：25μmol/L DATS治疗组(10只); C组：50μmol/L DATS治疗组(10只); D组：100μmol/L DATS治疗组(10只); E组：200μmol/L DATS治疗组(10只)。缝线后第7d裂隙灯下观察各组CNV的生长情况并计算面积。缝线后第14d取各组大鼠角膜组织行HE 染色,光镜下观察各组角膜病理组织形态,并采用RT-PCR 法检测VEGF mRNA 的表达情况,Western-blot 法检测VEGF、p-AKT蛋白表达情况。

结果：C、D、E组的CNV面积分别与A组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。HE切片显示,与A组相比,B、C、D组角膜水肿、新生血管、炎症细胞浸润情况逐渐减轻。与A组相比,B、C、D、E组的VEGF mRNA 的表达水平均降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与A组相比,C、D、E组的VEGF、p-AKT蛋白的表达逐渐下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。

结论：DATS 能够抑制缝线诱导的大鼠CNV的形成,其机制可能与抑制VEGF的表达及使得p-AKT的失活有关。     

Bevacizumab (Avastin)抑制角膜新生血管的应用新进展

诱发角膜新生血管的因素涉及各种生长因子。研究表明:在角膜新生血管中广泛存在的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)起着主要作用。一种可行的治疗角膜新生血管策略是:通过特异性的中和抗VEGF抗体竞争性的结合VEGF,从而抑制VEGF活性。近年来,利用抗VEGF治疗策略,抑制脉络膜新生血管获得了很好的效果。靶向VEGF治疗药物的疗效和安全性已经证明。因此我们设想,局部应用新的抗VEGF药物,如贝伐单抗、兰尼单抗等可以有效地抑制角膜新生血管,恢复角膜透明和视力。     

Bevacizumab inhibits corneal neovascularization in an alkali burn induced model of corneal angiogenesis

BACKGROUND: New and uncontrolled blood vessel development in the cornea is a pivotal process in the pathogenesis of several corneal diseases. These corneal diseases may finally cause blindness and managing them therapeutically is problematic. The data supporting a causal role for vascular endothelial growth factor in corneal neovascularization are extensive. This study aimed to evaluate the effect of subconjunctival bevacizumab (Avastin) on experimental corneal neovascularization in rabbits. METHODS: Chemical cauterization of the cornea was performed by touching central cornea with a 5-mm-diameter NaOH-soaked cotton applicator for 10 s in 20 eyes of 20 White New Zealand rabbits. The rabbits were then divided randomly into two equal groups. Bevacizumab (2.5 mg) was administered to 10 eyes (group 1) by a subconjunctival injection immediately after chemical cauterization of corneal surface. As a control, 10 eyes (group 2) received an injection of distilled water. Rabbits were examined daily for detection of the first signs of neovascularization. Three weeks later, the extent of corneal neovascularization was evaluated by direct examination and photograph analyses. Total corneal neovascularization area, degree of circumference involved and longest neovascular pedicle length were assessed. RESULTS: Bevacizumab significantly decreased the total neovascularization area (P < 0.009), the circumference involved (P < 0.011) and the longest neovascular pedicle length (P < 0.023). CONCLUSION: Local injection of bevacizumab has a significant effect on inhibition of alkali burn-induced corneal neovascularization. This shows the potential value of bevacizumab in the treatment of corneal neovascularization.     

兔角膜碱烧伤后角膜基质注射脐带间充质干细胞的疗效

目的　观察角膜基质注射脐带间充质干细胞（ｕｍｂｉｌｉｃａｌｃｏｒｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ,ＵＭＳＣｓ）治疗兔角膜碱烧伤的效果。方法　健康新西兰大白兔随机分为３组,每组１２只,每只兔左眼为角膜碱烧伤模型眼。Ａ组兔左眼在碱烧伤２ｄ后角膜基质内注射含有２×１０６个ＵＭＳＣｓ的磷酸盐缓冲液２μＬ,Ｂ组注射相同剂量的磷酸盐缓冲液,Ｃ组为角膜碱烧伤后未进行处理组,在注射后不同时间对角膜混浊程度、新生血管生长情况、角膜上皮缺损情况等进行临床观察并评分,同时进行综合评分。结果　注射后１４ｄＡ组新生血管生长较Ｂ组明显缓慢,Ａ组、Ｂ组注射隧道周围角膜新生血管生长评分分别为０分、２分,差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。注射后２ｄ和６ｄＡ组角膜混浊程度较Ｂ组明显轻,注射后２ｄＡ组、Ｂ组角膜混浊程度评分分别为２分、４分,注射后６ｄ评分与２ｄ相同,差异均具有统计学意义（均为Ｐ＜０．０５）。注射后２ｄ、７ｄ角膜上皮荧光素染色评分各组之间差异均无统学意义（均为Ｐ＞０．０５）。结论　碱烧伤后角膜基质注射ＵＭＳＣｓ可减少新生血管的形成,为抑制碱烧伤后角膜血管化提供参考,碱烧伤后角膜基质注射ＵＭＳＣｓ可在一定程度上恢复角膜透明度。     

洛伐他汀对大鼠角膜新生血管VEGF和TGF-β1表达的影响

目的:探讨洛伐他汀(lovastatin)对大鼠角膜新生血管(cor-neal neovascularization,CNV)血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和转化生长因子-β1(trans-forming growth factor-beta1,TGF-β1)表达的影响。方法:建立碱烧伤诱导的大鼠角膜新生血管的动物模型,治疗组和对照组分别给予10-5mol/L洛伐他汀溶液和生理盐水点眼,采用裂隙灯观察新生血管的生长情况,用免疫组织化学方法检测VEGF及TGF-β1的表达,并在基因水平下采用RT-PCR方法检测大鼠角膜VEGF mRNA的表达水平。结果:各时间点角膜新生血管的面积,治疗组均低于对照组,差异有显著性(P<0.05),免疫组化染色显示,治疗组VEGF及TGF-β1的表达量较对照组明显减少,在造模后4d角膜组织中VEGF mRNA的相对表达量,治疗组低于对照组(0.422±0.083vs0.786±0.126,P<0.05)。结论:洛伐他汀通过下调VEGF及TGF-β1的表达,抑制血管内皮细胞增殖,最终可有效抑制碱烧伤诱导的大鼠角膜新生血管形成。     

FTY720对大鼠角膜移植排斥反应的抑制作用

目的研究FTY720对大鼠角膜移植免疫排斥反应的抑制作用。方法 建立同种异体大鼠穿透性角膜移植动物模型,以Wistar大鼠为供体,SD大鼠为受体,随机分成4组,对照组每天4mg·kg-1生理盐水灌胃,CsA组为每天10mg·kg-1CsA(5g.L-1)灌胃,FTY720组为每天0.2mg·kg-1FTY720(0.1g.L-1)灌胃,联合用药组为每天5mg·kg-1CsA(5g.L-1)和0.1mg·kg-1FTY720(0.1g.L-1)灌胃,术后第1天开始灌胃给药,连续用药14d后停药。对各组大鼠术眼角膜植片进行临床观察,对植片的临床指数:混浊度、水肿、新生血管及排斥反应指数进行评分,并记录角膜植片的存活时间。结果 对照组、CsA组、FTY720组和联合用药组角膜植片的存活时间分别为(10.38±1.92)d、(20.13±2.17)d、(21.38±2.72)d、(29.88±3.04)d,各用药组角膜植片的存活时间与对照组比较显著延长(均为P=0.000);联合用药组优于单独用药组(均为P=0.000);FTY720组与CsA组比较差异无统计学意义(P>0.05)。术后14d各用药组角膜植片的混浊度、水肿、角膜新生血管、排斥反应指数均低于对照组(均为P<0.01);联合用药组均优于单独用药组;FTY720组与CsA组比较差异无统计学意义(均为P>0.05)。结论 口服FTY720能显著延长大鼠角膜植片的存活时间,抑制角膜移植免疫排斥反应。CsA与FTY720联合用药具有协同作用,优于单独用药组。     

Effect of cytokeratin 17 on retinal pigment epithelium degeneration and choroidal neovascularization

AIM: To study the effects of cytokeratin 17 (CK17) on sodium iodate (NaIO3) induced rat retinal pigment epithelium (RPE) degeneration, laser induced rat choroidal neovascularization (CNV), and oxidative stress of human retinal pigment epithelium cells (ARPE-19) and human umbilical vein endothelial cell (HUVEC). METHODS: Thirty 8-week-old male Brown Norway rats were randomly divided into 3 groups, 10 rats in control group treated with solvent alone; 10 rats in NaIO3 group treated with solvent and 35 mg/kg NaIO3 injection through hypoglossal vein and 10 rats in CK17+NaIO3 group treated with 1% CK17 eye drop 3 times a day for 1wk before and 4wk after NaIO3 injection. RPE function was measured with c-wave of electroretinogram (ERG). Another 20 rats were randomly divided into 2 groups. Of them 10 rats in CK17 group were anesthetized to receive Nd:YAG laser and given 1% CK17 eye drop before same as above; 10 rats in control were received Nd:YAG and treated with solvent. The development of choroidal neovascularization (CNV) was determined by fundus fluorescein angiography (FFA) performed on 4wk after laser. Methylthiazoly tetrazolium (MTT) assay was used to study effect of CK17 on various oxidants induced injury in ARPE-19 and HUVEC in vitro. RESULTS: Four weeks after NaIO3 injection, the c-wave amplitude of ERG was 0.393±0.02 V in the control group, 0.184±0.018 V in NaIO3 group and 0.3±0.01 V in CK17+NaIO3 group. There was a significant reversal of the c-wave by CK17 as compared to NaIO3 group (P<0.01). Four weeks after laser, the size of the CNV lesion was 2.57±0.27 mm2 in control group and 1.64±0.08 mm2 in CK17 group. The lesion size significantly diminished in CK17 group (P<0.01). The in vitro results showed CK17 also reversed the various oxidants induced injuries in ARPE-19 at the dose of 100 μg/mL and enhanced the injury in HUVECs at different concentrations. CONCLUSION: CK17 can significantly protect RPE from NaIO3 induced degeneration in vivo and in vitro and also could reverse the various oxidants induced injuries in vitro. It inhibits the development of CNV in rat model, interfered with vascular endothelial cell proliferation in vitro.