N-myc在大鼠急性痫性发作模型中的表达及其意义

目的 探讨在氯化锂-匹罗卡品诱导大鼠急性痫性发作模型中N-myc表达及其意义。方法健康Wistar雄性大鼠45只，随机分为生理盐水对照组、地西泮干预组和致痫1h～9d组(根据致痫后的不同时点分7个组)，共9组，每组5只。采用氯化锂-匹罗卡品联合腹腔注射急性致痫大鼠模型，常规脏染色观察实验大鼠脑组织的形态学改变，免疫组化染色法观察脑内N—myc表达产物分布及其含量变化。结果 致痫1d～9d组尤其致痫6d和9d两组可见到脑组织损伤性改变，海马区重于皮质区。生理盐水对照组N—myc几乎无表达，地西泮干预组低表达，致痫组表达增多，尤其以致痫1d组和致痫3d组最为明显。结论 急性痫性发作或癫痫持续状态可导致脑组织损伤性改变，以海马结构等易损区为明显。N—myc表达及其表达量可能与急性痫性发作后脑损伤及其受累部位有关。     

氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠海马EphA5及ephrinA3的表达及意义

目的探讨颞叶癫痫发作后海马EphA5及ephrinA3基因的表达变化和轴突出芽的关系。方法建立氯化锂-匹罗卡品颞叶癫痫大鼠模型,利用原位杂交方法检测致痫后12h、24h、7d、15d、30d、60d海马CA3区、CA1区EphA5及ephrinA3 mRNA的表达,快速Golgi染色观察CA1区的轴突出芽。结果致痫后,EphA5 mRNA在CA3区表达下调,ephrinA3 mRNA在CA1区表达下调,均在7d降至最低点,与对照组相比差异有显著意义(P<0.01),此后逐渐回升,但15d时仍低于对照组(P<0.05),在30d和60d与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。快速Golgi染色显示,对照组大鼠CA1区轴突走行正常,匹罗卡品致大鼠SE后7dCA1区锥体细胞层出现显著增多的轴突染色。结论CA3区的EphA5和CA1区的ephrinA3的表达下调可能与CA1区的轴突出芽、突触重建有关。     

癫痫持续发作时间与大鼠海马苔藓纤维发芽程度及自发性痫性发作的关系

目的探讨癫痫持续状态(SE)发作时间与致痫大鼠海马苔藓纤维发芽(MFS)程度及自发性痫性发作的关系。方法 104只雄性成年SD大鼠,随机分为对照组和3个SE实验组,建立氯化锂-重复低剂量匹罗卡品致痫大鼠模型;诱发SE30min(A组)、60min(B组)、90min(C组)后注射水合氯醛终止发作。各组大鼠自SE终止发作后于相同实验条件下普通饲养45d,观察大鼠行为及脑电图(EEG)的变化,记录自发性痫性发作的发生率。通过苏木精-伊红染色、Nissl染色和Timm硫化银组织化学染色方法观察各实验组海马MFS情况。结果氯化锂-重复低剂量匹罗卡品成功诱导大鼠SE的发生,发作程度均达Ⅳ级以上,EEG类似人类颞叶癫痫。80%的大鼠癫痫持续状态均发展为自发痫性发作,与SE时间无关。与对照组相比,实验A、B、C三组双侧海马CA3区均表现MFS(P0.05)。实验B组与A、C组相比,CA3区MFS明显增加(P0.05)。结论氯化锂-重复低剂量匹罗卡品可诱导SE,癫痫持续发作60min后终止的大鼠海马CA3区MFS明显增加,SE发作时间与海马MFS程度并不一定呈正相关。     

Ephrin-B3在癫痫大鼠海马中的动态表达变化

目的检测癫痫大鼠模型Ephrin-B3的动态表达,探讨其在颞叶癫痫中致痫作用。方法 SD雄性大鼠随机分成对照组和实验组,构建氯化锂-匹罗卡品癫痫大鼠模型,在癫痫持续状态(SE)诱导成功后7 d(急性期)、14 d(静止期)、60 d(慢性期)分别采用Real-time qPCR、Western blot及免疫组化方法检测大鼠海马齿状回Ephrin-B3 mRNA及蛋白的表达及分布。结果在SE后的急性期和静止期,实验组大鼠均未见自发痫性发作;慢性期实验组大鼠有节律性点头、咀嚼、单侧或双侧前肢阵挛发作。荧光定量PCR结果显示:与对照组比较,急性期癫痫大鼠海马的Ephrin-B3 mRNA表达水平下降,静止期下降最为明显,慢性期有所回升,但仍低于对照组(P 0.001)。Western blot检测Ephrin-B3蛋白的表达水平与mRNA表达趋势相一致:与对照组比较,致痫后7 d、14 d、60 d的Ephrin-B3蛋白表达均下调,差异有统计学意义(P 0.001)。免疫组化结果显示,Ephrin-B3蛋白主要分布于海马齿状回的颗粒细胞胞膜上,其光密度值与mRNA的变化趋势相一致(P 0.001)。结论 Ephrin-B3在海马组织的动态变化可能与慢性自发痫性发作密切相关。     

锂-匹罗卡品致癫大鼠早期大脑皮质MyT1 mRNA表达变化

目的 探讨氟化锂-匹罗卡品致癫大鼠脑髓鞘转录因子1基因表达变化及其意义。方法 以氯化锂、匹罗卡品对雄性成年SD大鼠先后腹腔注射，制成癫痫持续状态动物模型；采用5′末端标记地高辛的寡核苷酸探针荧光原位核酸分子杂交检测癫性发作后早期大鼠大脑皮质MyT1 mRNA阳性细胞数量。结果 与对照组相比，癫痫后1d组大鼠脑皮质MyT1 mRNA阳性细胞数减少（P＜0.05）；其他各组大鼠脑皮质MyT1 mRNA阳性细胞数都有明显的增加，其中癫痫后7d和14d组MyT1mRNA阳性细胞数都有非常显著的增加（P＜0.05，P＜0.01）。结论 氯化锂-匹罗卡品致癫大鼠早期大脑MyT1 mRNA表达增加，并有时程性变化，提示与早期脑损伤修复有关。     

TLR4、MRP8在内侧颞叶癫痫幼大鼠海马中表达的动态变化

目的观察氯化锂-匹罗卡品致痫幼大鼠各期海马中Toll-样受体4(TLR4)、髓样相关蛋白8(MRP8)表达的变化,探讨其是否与内侧颞叶癫痫(MTLE)发生有关。方法 21d SD雄性大鼠90只,随机分对照组(30只)和模型组(60只),腹腔注射氯化锂。17～18h后模型组腹腔注射匹罗卡品诱导癫痫持续状态(SE);对照组予等量生理盐水取代匹罗卡品腹腔注射。按自发发作出现和稳定时间(自发痫性发作在致痫后约3w出现,8w趋稳定),对照组和模型组随机分6个亚组:急性模型组(SE后2h)、潜伏模型组(SE后3w)、慢性自发发作组(SE后8w)及相对应时间点对照组。每亚组动物10只。免疫组化、免疫印迹、RT-PCR技术测定各亚组幼大鼠海马内TLR4、MRP8的表达。结果 TLR4、MRP8在模型组海马内表达明显增多,以CA3、CA1、DG区显著;与对照组相比,差异有显著性(P0.05)。模型亚组内,TLR4、MRP8在急性期和慢性期表达明显增高,而潜伏期无明显表达变化;3组比较差异有显著性(P0.05)。结论大鼠海马内TLR4、MRP8表达增多可能与MTLE发生有关。探讨其机制可能为MTLE的治疗提供新的靶点。     

TLR9、MyD88在颞叶癫痫大鼠海马组织中表达的动态变化

目的观察氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠各期海马中Toll-样受体9(TLR9)、髓样分化因子(MyD88)表达的变化,探讨其是否与颞叶癫痫发生有关。方法 SD雄性大鼠120只,随机分为对照组(30只)和模型组(90只),腹腔注射氯化锂。18 h~20 h后模型组腹腔注射匹罗卡品诱导癫痫持续状态(SE);对照组予等量生理盐水取代匹罗卡品腹腔注射。对照组和造模成功的模型组依据腹腔注射后时间随机分为10个亚组:急性模型组(SE后3 h、6 h、9 h、12 h、1 d、3 d、7 d);潜伏模型组(SE后14 d、28 d);慢自发发作组(SE后56 d)。每亚组动物模型组9只,对照组3只。免疫组化、蛋白印迹、RT-PCR技术测定各亚组癫痫大鼠海马内TLR9、MyD88的表达。结果TLR9、MyD88在模型组海马内表达明显增多,与对照组相比,差异有显著性(P0.05)。模型亚组内,TLR9、MyD88在急性期和慢性期表达明显增高,而潜伏期无明显表达变化。其中急性期内的增高多集中在癫痫发作后6 h;3组比较差异有显著性(P0.05)。结论大鼠海马内TLR9、MyD88表达增多可能与颞叶癫痫发病有关,探讨其机制可能为颞叶癫痫的治疗提供新的靶点。     

miR-33、miR-211、miR-34a、miR-19a在癫痫大鼠海马区脑组织中的表达

目的检测miR-33、miR-211、miR-34a和miR-19a在氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠海马区脑组织不同研究时点的表达水平,探讨其在癫痫发生发展过程中的作用。方法建立氯化锂-匹罗卡品癫痫大鼠模型,应用实时荧光定量PCR技术检测癫痫大鼠海马区脑组织不同研究时点miR-33、miR-211、miR-34a和miR-19a的表达量,并和对照组比较,对其差异进行分析。结果与对照组相比,miRNA-33在SE后1 h的表达水平明显降低(P<0.05),在SE后1 d和21 d表达水平明显升高(P<0.05),且SE后1 d表达量增高5.32倍;miRNA-211在SE后1 h的表达水平明显增高(P<0.05),且表达量增高3.56倍;在SE后1 d和60 d表达水平明显降低(P<0.05),在SE后60 d表达量降至0.17倍;miR-34a在SE后1 d和21 d的表达水平明显增高(P<0.05),在SE后21 d表达量增高3.12倍;miR-19a在SE后1 d的表达水平明显增高(P<0.05),且表达量增高4.32倍;在SE后60 d表达量明显下降(P<0.05),表达量降至0.39倍。结论 miR-33、miR-21、miR-34a、miR-19a在癫痫大鼠同一研究时点海马区脑组织中表达量存在差异,同一miRNA在不同研究时点海马区脑组织中的表达水平也有不同,提示各miRNA可能参与癫痫不同时期的调控。     

经皮三叉神经慢性电刺激对癫痫大鼠的癫痫行为和海马炎性反应抑制作用

目的观察经皮三叉神经电刺激(TNS)处理对匹罗卡品诱发的癫痫大鼠的行为、海马区细胞因子IL-1β和TNF-α及小胶质细胞活化的影响,探讨经皮三叉神经电刺激对实验性癫痫的治疗作用及其可能炎性机制。方法选择健康雄性大鼠,设正常对照组和实验组,实验组建立匹罗卡品癫痫持续状态模型6 h后,再分成单纯匹罗卡品模型组(pilo组)和经皮三叉神经电刺激组(TNS组),分别给予假刺激和电刺激4 w后,再次进行匹罗卡品致痫,观察大鼠癫痫行为,用酶联免疫吸附(Elisa)的方法检测大鼠海马组织IL-1β、TNF-α的蛋白含量,免疫组化的方法观察小胶质细胞活化情况。结果 (1)经皮三叉神经电刺激后再次匹罗卡品致痫TNS组大鼠较pilo组发作严重程度减轻,持续时间较短,死亡率降低(P<0.05,P<0.01);(2)TNS组大鼠海马IL-1β和TNF-α含量较pilo组显著降低(P<0.05);(3)TNS组活性小胶质细胞的数量较pilo组在各时间点均明显减少(P<0.05)。结论在实验性癫痫中,经皮三叉神经电刺激有显著的抗癫痫作用,提高了癫痫发作的阈值,其机制可能与其下调炎性因子IL-1β和TNF-α及减轻小胶质细胞的活化有关。     

癫痫大鼠内嗅皮层神经元GABAA受体功能的研究

目的介绍建立氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠模型的方法,并且通过全细胞膜片钳记录,初步研究其内嗅皮层神经元GABAA受体功能。方法将所有SD大鼠随机分为对照组和实验组。实验组大鼠腹腔注射氯化锂以及匹鲁卡品,对照组注射生理盐水,观察其行为学特征,并用全细胞膜片钳记录GABAA受体电流的衰减趋势。结果与对照组相比,实验组癫痫大鼠内嗅皮层神经元的GABAA受体电流的衰减加剧。方差检验进行组间分析,分组的作用是有差异的(P<0.001),;固定时间,对每个时间点上的处理组和对照组进行t检验,分组都有统计学意义(P<0.001)。结论锂-匹罗卡品致痫大鼠内嗅皮层神经元的GABAA受体电流衰减的加剧,说明了锂、匹罗卡品造成大鼠癫痫的可能原因,也提示了GABAA受体参与了癫痫发作以及癫痫发作后的脑损伤。     

Differential paired-pulse responses between the CA1 region and the dentate gyrus are related to altered CLC-2 immunoreactivity in the pilocarpine-induced rat epilepsy model

The epileptic hippocampus shows differential paired-pulse responses between the dentate gyrus and the CA1 region. However, little data are available to explain this phenomenon. In the present study, we identified the relationship between regional differences of paired-pulse response and voltage gated Cl(-) channel 2 (CLC-2)/vesicular GABA transport (VGAT) expression in a pilocarpine-induced rat model. During epileptogenic periods, paired-pulse inhibitions in the dentate gyrus and the CA1 region were markedly reduced. After recurrent seizure onset, paired-pulse inhibition in the dentate gyrus was markedly enhanced, while that in the CA1 region more reduced. Unlike VGAT, CLC-2 immunoreactivity was markedly reduced in the hippocampus during epileptogenic periods and was re-enhanced only in the dentate gyrus after recurrent seizure onset. Linear regression analysis showed an inverse proportional relationship between alterations in CLC-2 immunoreactivity and changes in normalized population spike amplitude ratio within the CA1 region and the dentate gyrus. Therefore, our findings suggest that the regionally specific alterations in CLC-2 immunoreactivity after SE may determine the properties of paired-pulse responses in the hippocampus of the pilocarpine-induced rat epilepsy model.     

慢性癫痫大鼠脑组织中脑源性神经生长因子及其受体的研究

应用免疫组织化学的方法观察了戊四氮诱导的慢性癫痫大鼠脑组织中脑源性神经生长因子（BDNF）及其受体TrkB免疫反映阳性神经元的变化。结果发现慢性癫痫大鼠海马回、齿状回BDNF及TrkB免疫反应阳性神经元数目明显增多。在本次抽搐后3h、72h、7d、10dBDNF阳性神经元均增高,而TrkB阳性神经元仅在末次抽搐后3h升高。24h后恢复到正常水平,结果表明,BDNF及TrkB与癫痫发病有关。     

雌激素调控瞬时外向钾通道对大鼠慢性颞叶癫发作的影响

目的探讨雌激素对大鼠慢性颞叶癫发作的影响及其与瞬时外向钾通道(kv4.2)之间的关系。方法 SD雌性大鼠随机分为正常对照组、去势对照组、正常致组、去势致组。应用毛果芸香碱诱导大鼠癫持续状态(SE),观察大鼠行为学变化。经4周后成为慢性颞叶癫大鼠。Western bolt方法检测大鼠海马瞬时外向钾通道Kv4.2蛋白表达水平。结果与正常致组比较,去势致组达到SE的潜伏期延长、死亡率降低,但差异无统计学意义(P0.05);去势致组的癫发作强度较正常致组轻,差异有统计学意义(P0.05)。去势致组和正常致组在SE 4周后海马Kv4.2均较正常对照组显著升高,均差异有统计学意义(P0.05和P0.01)。去势对照组和去势致组比较,均未见对Kv4.2蛋白表达产生影响,说明Kv4.2蛋白表达升高为癫发作所致。结论大鼠癫发作后Kv4.2表达增加、瞬时外向钾电流增强、神经冲动的发放频率减慢,可能是产生代偿性自我保护反应的结果;虽然去势雌性大鼠未对Kv4.2表达产生影响,但出现潜伏期延长和死亡率降低、发作强度降低的行为学趋势,提示低剂量雌激素可能存在对癫发作的保护作用。     

癫(癎)大鼠海马齿状回微管相关蛋白2表达规律及地西泮干预的研究

目的研究致癎大鼠神经元树突标记物微管相关蛋白2(MAP2)的表达规律、与癫癎发生的关系及在地西泮干预下的变化。方法建立戊四氮致癎大鼠模型,分为戊四氮生理盐水组、戊四氮地西泮组、地西泮戊四氮组及正常对照组。采用免疫组化方法观察大鼠癎后海马结构MAP2免疫反应性(MAP2-IR),及其在地西泮干预下的动态变化,用平均吸光度值(COD)表示免疫反应性的强度。结果戊四氮生理盐水组及戊四氮地西泮组海马齿状回分子细胞层MAP2-IR的COD值于癎后3d增强(均P<0.05),7d明显增强(均P<0.01),14d达到高峰(均P<0.01),28d降至正常对照组水平;地西泮戊四氮组未能观察到MAP2的明显变化。结论致癎大鼠海马齿状回MAP2-IR变化显著,癎后的地西泮干预不能改变MAP2-IR的变化规律。     

替尼达普对慢性颞叶癫(癎)大鼠海马内向整流钾通道2.3亚单位表达的影响

目的 观察慢性颞叶癫(癎)(TEE)大鼠致(癎)后不同时点海马组织中内向整流钾通道(Kir)2.3亚单位mRNA和蛋白的表达变化规律及通道特异性开放剂替尼达普对其表达的影响,探讨Kir2.3通道与TLE发病机制的关系,并为临床应用钾通道开放剂作为抗癫(癎)药物提供依据.方法 匹罗卡品诱导大鼠产生癫(癎)持续状态(SE),持续观察2周,成模为慢性TLE大鼠.用逆转录PCR(RT-PCR)和Western blot方法检测对照组及致(癎)组大鼠SE终止后0、6、72 h和2周后海马组织中Kit2.3通道mRNA和蛋白表达变化趋势;随后以慢性期2周作为观察时间点,检测替尼达普对大鼠海马Kir2.3通道mRNA及蛋白表达变化的影响.结果 对照组、致(癎)组SE终止后0、6、72 h和2周时Kir2.3 mRNA/β-actin比值分别为0.080±0.030、0.103±0.045、0.164±0.026、0.132±0.024和0.011±0.008(F:23.684,P<0.01);各时间点Kir2.3蛋白/甘油醛-3磷酸脱氢酶(GAPDH)比值分别为0.305±0.030、0.263±0.028、0.767±0.167、0.498±0.077和0.176±0.026(F=44.183,P<0.05),其表达呈现急性期增高、慢性期明显降低的动态变化趋势.在慢性期,替尼达普给药组大鼠Kir2.3 mRNA/β-actin与Kir2.3蛋白/GAPDH比值分别为0.021±0.006和0.636±0.140,与未给药组相比表达增高,差异有统计学意义(F=25.216、47.355,P<0.05、0.01).结论 Kir2.3通道mRNA和蛋白在慢性期表达下调,可能是难治性癫(癎)发病的分子生物学机制之一.替尼达普通过增加Kir2.3通道的表达,最终可能减少(癎)样放电的产生.     

Sodium channel beta1-subunit expression is increased in reactive astrocytes in a rat model for mesial temporal lobe epilepsy

As several epilepsy syndromes are associated with changes in sodium channel subunits we investigated the expression of beta1 sodium channel protein in a rat epilepsy model. In this model a chronic epileptic syndrome develops after electrically induced status epilepticus (SE). Many neuropathological characteristics of mesial temporal lobe epilepsy can be reproduced (cell loss, gliosis and synaptic reorganization). In control hippocampus beta1 subunit protein was moderately expressed in neurons and weakly expressed in resting astrocytes. beta1 sodium channel immunoreactivity increased markedly within 1 week after SE mainly in astrocytes that were colocalized with vimentin (marker for reactive astrocytes). This up-regulation was still present in reactive astrocytes of chronic epileptic rats (> 3 months after SE). Considering the fact that the beta1 subunits may function as cell adhesion molecules interacting with extracellular matrix, the observed increase in reactive astrocytes might subserve a function in cellular and synaptic reorganization during epileptogenesis.     

Increased glial glutamate transporter EAAT2 expression reduces epileptogenic processes following pilocarpine-induced status epilepticus

Several lines of evidence indicate that glutamate plays a crucial role in the initiation of seizures and their propagation; abnormal glutamate release causes synchronous firing of large populations of neurons, leading to seizures. In the present study, we investigated whether enhanced glutamate uptake by increased glial glutamate transporter EAAT2, the major glutamate transporter, could prevent seizure activity and reduce epileptogenic processes. EAAT2 transgenic mice, which have a 1.5-2 fold increase in EAAT2 protein levels as compared to their non-transgenic counterparts, were tested in a pilocarpine-induced status epilepticus (SE) model. Several striking phenomena were observed in EAAT2 transgenic mice compared with their non-transgenic littermates. First, the post-SE mortality rate and chronic seizure frequency were significantly decreased. Second, neuronal degeneration in hippocampal subfields after SE were significantly reduced. Third, the SE-induced neurogenesis and mossy fiber sprouting were significantly decreased. The severity of cell loss in epileptic mice was positively correlated with that of mossy fiber sprouting and chronic seizure frequency. Our results suggest that increased EAAT2 expression can protect mice against SE-induced death, neuropathological changes, and chronic seizure development. This study suggests that enhancing EAAT2 protein expression is a potential therapeutic approach.     

杏仁核点燃癫痫鼠GAD67mRNA的表达

目的 探讨大鼠杏仁核点燃癫痫后脑组织谷氨酸脱羧酶（GAD）mRNA的表达及其在癫痫发作后表达变化的意义。方法 通过建立与人类癫痫发生,形成具有高度相似性的杏仁核点燃大鼠癫痫模型。采用原位杂交技术检测癫痫鼠颞叶及海马组织不同点燃时程GAD67mRNA表达。结果 点燃后1d,GAD67mRNA表达增多并且表达信号增强,至7d时达高峰,以后表达逐渐下降,但在点燃后49d,表达仍高于正常,与对照组及手术对照组相比有统计学差异。结论 在慢性癫痫发作中,GABA能神经元的活性增强,考虑是由于癫痫过程中兴奋性增强,引起GABA能神经元抑制功能代偿性增加的结果,即癫痫发作后GABA能神经元介入的抑制功能代偿性增加的,这可能是机体内源性抗癫痫机制增强的一种反应。     

红藻氨酸致颞叶癫(癎)大鼠脑内Semaphorin3A、Semaphorin4C基因表达的研究

目的研究轴索导向分子Semaphorin3A(Sema3A)、4C(Sema4C)对癫大鼠海马苔藓纤维重建的调控作用及对皮层神经元的保护作用。方法大鼠侧脑室内注射红藻氨酸制备颞叶癫模型,原位杂交法检测致痫间后1d,1、2、3、4周大鼠脑内Sema3A/Sema4C mRNA表达。结果致痫间后1周Sema3A、Sema4CmRNA分别在齿状回(DG),CA3区表达明显下降(P<0.01),持续至3、4周时恢复至正常(P>0.05);致痫间后1d Sema3A mRNA在皮层表达明显下降(P<0.01),持续至1、2周后恢复至正常(P>0.05)。结论红藻氨酸致痫间后DG及CA3区神经元分别下调Sema3A/Sema4C mRNA的表达,促进癫大鼠苔藓纤维重建;皮层神经元通过下调Sema3A mRNA的表达来维持自身存活。     

慢性癫痫大鼠脑组织神经生长因子阳性神经元的变化

应用免疫组织化学的方法观察了戊四氮诱导的慢性癫痫大鼠脑组织神经生长因子(NGF)阳性神经元的变化。结果发现慢性癫痫大鼠海马回、齿状回NGF阳性神经元数目明显增多。在所选取的时间点,即末次抽搐发作后24h、72h、7d均较对照组明显升高。结果提示:NGF参与了癫痫的发病过程,可能通过介导突触的重建面具有促痫作用。也可能作为一种保护因子而防止癫痫后脑损害。