RNA干扰技术在肿瘤基因治疗方面的研究进展

RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)在哺乳动物细胞中是利用小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)诱导特异性基因表达抑制。其具有基因抑制效果确切、抑制具有严格的序列特异性、作用迅速等特点,故与基因替代、反义寡核苷酸治疗、细胞因子基因治疗等传统的肿瘤基因治疗方法相比,RNAi技术有着无可比拟的优势。本文对RNAi技术的作用机制及在肿瘤基因治疗方面的实验研究进展作一综述。     

化学修饰小干扰RNA研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指转录双链的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)能够高效、特异地抑制同源基因的表达。近年来,RNAi以其快速、简便、特异、高效等优势被广泛应用于基因功能研究,肿瘤治疗和抗病毒感染等领域。而采用胆固醇、锁核酸、二硝基苯酚等化学基团对双链小干扰RNA(siRNA)的正义或反义链进行化学修饰,可增强siRNA的稳定性,提高其干扰活性,克服siRNA传统载体(病毒、质粒等)对机体潜在的风险性,避免脱靶、利于被细胞摄取等,在基础研究和临床治疗方面具有非常广阔的应用前景。     

RNA干扰技术及其在前列腺癌基因治疗研究中的应用

RNA干扰(RNA i)是指生物体内由双链RNA(dsRNA)介导同源序列mRNA的特异性降解,从而导致基因沉默的现象。近年来,随着对RNA i研究的不断深入,其作用机制正逐步阐明;同时作为阻断基因表达的新手段,RNA i技术也日趋完善和成熟。它具有高效性和特异性,为RNA i在肿瘤的基因治疗方面的应用提供了有力的工具。本文综述RNA i技术的有关研究进展及其在前列腺癌基因治疗研究中的应用。     

小干扰RNA对LNcap细胞CXCR4基因表达的影响

目的:研究小干扰RNA(siRNA)对LNcap细胞中CXC趋化因子4(CXCR4)基因表达的影响。方法:用针对CXCR4基因的siRNA表达质粒pSilencer-CXCR4转染人前列腺癌细胞株LNcap细胞,用RT-PCR方法检测其CXCR4基因表达水平的变化。结果:重组体pSilencer-CXCR4转染LNcap细胞后,能明显抑制CXCR4基因的表达;转染48 h后,其表达水平下降75%,与空白对照组和阴性对照组比较,其差异有统计学意义(P<0.01)。结论:利用RNA干扰技术能有效抑制靶基因的表达,为下一步有关CXCR4的研究奠定一定的基础。     

兔骨髓间充质干细胞Runx2基因特异siRNA的设计和 沉默作用

目的探讨应用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)特异性抑制兔骨髓间充质干细胞内Runx2基因表达,筛选高效特异性siRNA。方法根据siRNA设计原则,针对Runx2基因序列特征设计Runx2特异siRNA(1-3),转染兔骨髓间充质干细胞,用QPCR和Western blot方法检测siRNA对Runx2基因的抑制效果。结果 Runx2 siRNA-2可有效抑制骨髓间充质干细胞中Runx2基因的表达。随siRNA-2终浓度由50 nmol/L增加到100 nmol/L及200 nmol/L,抑制效率逐渐增强(P0.05);siRNA-2以终浓度200 nmol/L转染后48 h抑制效果最强,72 h逐渐减弱,但仍明显抑制(P0.05)。结论应用RNA干扰技术可抑制骨髓间充质干细胞中Runx2基因的表达,其抑制作用具有明显的时间、浓度依赖性。     

RNA激活研究进展

近年的研究发现非编码RNA(ncRNA)分子能在多个水平参与基因表达的调控机制,其中小分子双链RNA(dsRNA)对相关蛋白表达的特异性抑制作用已经进行了广泛而深入的研究,如小干扰RNA(siRNA)能够诱导与其分子核糖核苷酸排列序列相一致的mRNA降解,或可使相应基因启动子区域DNA的同源序列段CpG岛发生甲基化[1,2],并导致相应的基因失去转录活性,造成特定基因沉默.细胞内源性的microRNA(miRNA)也可在基因转录和翻译水平抑制基因的表达[3-5],体现出ncRNA分子在基因表达调控中的多样性.     

siRNA特异性抑制骨肉瘤细胞株HER-2基因的表达

[目的]观察RNA干扰技术对骨肉瘤细胞株（OS-732细胞）HER-2（表皮生长因子受体-2）表达的抑制效应。[方法]体外化学合成HER-2序列特异性双链RNA（siRNA），转染入OS-732骨肉瘤细胞株中，分别用RT-PCR、Western Blot和免疫细胞化学法检测转染前后HER-2基因的mRNA和蛋白的表达情况，用MTT（四甲基偶氮唑盐比色法）检测细胞的增殖和化疗敏感性，观察细胞生物学特性的改变。[结果]HER-2 siRNA对OS-732细胞HER-2 mRNA表达明显抑制，作用约持续10d；干涉第9d，干涉组细胞蛋白表达减弱；细胞对顺铂的敏感性提高约10倍。[结论]体外合成的siRNA能有效抑制骨肉瘤OS-732细胞中HER-2基因的表达，抑制细胞的增殖，并提高了细胞对顺铂的敏感性。     

长链非编码RNA在前列腺癌诊断中的研究进展

在人类30多亿个碱基对的基因序列中仅有不到2%的核酸序列用于编码蛋白,大部分基因不表达蛋白质,这一类基因称之为非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)。其中转录长度>200个核苷酸的RNA又被称为长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)。大量基因研究表明,lncRNA的表达调控和突变与泌尿系统的肿瘤的发生密切相关。学者们通过研究其在PCa中的表达发现,lncRNA在PCa的发生、发展中起着重要的作用。本文结合国内外最新研究成果,将lncRNA在前列腺癌诊断中的研究进展作一综述。     

小鼠骨髓间充质干细胞Osterix基因特异siRNA的设计和沉默作用

目的 探讨应用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)特异性抑制骨髓间充质干细胞内Osterix基因表达,筛选高效特异性siRNA。方法 根据siRNA设计原则,针对Osterix基因序列特征设计Osterix特异siRNA( 1-3 ),转染骨髓间充质干细胞,用QPCR和Western blot方法检测siRNA对Oslerix基因的抑制效果。结果 Osterix siRNA-2可有效抑制骨髓间充质干细胞中Osterix基因的表达。随siRNA-2终浓度由50 nmol/L增加到100 nmol/L及200 nmol/L,抑制效率逐渐增强（P < 0. 05);siHNA-2以终浓度200 rnnol/L转染后48 h抑制效果最强,72 h逐渐减弱,但仍明显抑制（P< 0. 05 )。结论 应用RNA干扰技术可抑制骨髓间充质干细胞中Osterix基因的表达,其抑制作用具有明显的时间、浓度依赖性。     

RNA干扰对兔血管平滑肌细胞bcl-2基因表达的影响

目的研究RNA干扰(RNAi)对兔血管平滑肌细胞(VSMCs)bcl-2基因表达的干扰效应。方法用脂质体法将构建的装载靶向bcl-2基因小干扰性RNA(siRNA)的表达载体(pshRNA-bcl-2质粒)转染VSMCs(基因组),以转染空载体的细胞和加DMEM的空白细胞作为对照,采用半定量RT-PCR和Westernblot法检测bcl-2基因的表达,用MTT法检测VSMCs生长情况。结果转染siRNA的表达载体可以抑制内源性bcl-2基因在转录和转译水平上的表达,基因组bcl-2的mRNA和蛋白表达较空载体组和空白对照组明显减少(P<0.01);基因组的VSMCs生长也较空载体组和空白对照组明显受到抑制(P<0.01)。结论载体介导的RNAi技术可明显抑制内源性bcl-2基因的表达和VSMCs生长。     

小分子干扰RNA诱导HTB-94软骨肉瘤细胞凋亡的研究

目的 利用小分子干扰RNA(siRNA)表达质粒转染HTB-94软骨肉瘤细胞,观察其在人体软骨肉瘤细胞HTB-94中对肿瘤细胞生长的影响.方法 设计并合成高泳动家族性别决定基因9(Sox9)siRNA,将其转染HTB-94肿瘤细胞,观察肿瘤细胞的Sox9基因的mRNA和蛋白表达、生长曲线和细胞凋亡情况.结果 Sox9 siRNA的插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致,Sox9基因的mRNA和蛋白表达降低,HTB-94肿瘤细胞的生长繁殖受到抑制,细胞凋亡增加.结论 Sox9 siRNA表达质粒可以通过稳定转染HTB-94肿瘤细胞,抑制Sox9基因的mRNA和蛋白的表达,抑制肿瘤细胞的生长繁殖,同时使肿瘤细胞凋亡.     

siRNA沉默HER2对人胰腺癌细胞PANC-1侵袭能力的影响

目的:探讨慢病毒介导的siRNA沉默HER2对人胰腺癌细胞株PANC-1侵袭能力的影响。方法:运用HER2基因小干扰RNA(siRNA)的重组慢病毒稳定转染PANC-1细胞,荧光定量RT-PCR和Western blotting观察HER2 mRNA和蛋白表达的改变,体外侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化。结果:HER2基因小干扰RNA的重组慢病毒稳定转染PANC-1细胞可显著抑制HER2 mRNA和蛋白表达;体外侵袭实验显示siRNA沉默HER2后,PANC-1细胞侵袭能力明显下降。结论:HER2基因小干扰RNA的重组慢病毒能有效抑制HER2的表达,抑制胰腺癌细胞体外侵袭能力。siRNA沉默HER2可能为预防和治疗胰腺癌的侵袭转移提供一种新的策略。     

RNAi在大肠癌微转移中的研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)现象是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导细胞内的mRNA发生特异性降解,导致靶基因的表达沉默,产生相应的功能表型缺失。它能够高度特异性、高效性地抑制基因的表达,被广泛运用于肿瘤研究。检测大肠癌微转移的基因标记物也越来越多,RNAi能够在肿瘤浸润和转移的多个步骤中抑制其表达,从而影响大肠癌微转移。     

Ki-67基因siRNA表达质粒的构建、鉴定及功能研究

目的构建肿瘤增殖基因Ki-67小干扰RNA(siRNA)表达质粒，研究其对人肾癌细胞Ki-67基因表达的阻抑作用，探索肾癌基因治疗新的途径。方法设计有小发夹机构的2条Ki-67 siRNA对应模板DNA序列，煺火处理后克隆至pSliencer 3．1质粒，构建重组质粒pSliencer-Ki-67。将pSliencer-Ki-67转染人肾癌786—0细胞，采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测Ki-67表达。结果酶切及测序证实质粒pSliencer-Ki-67构建成功。其可显著抑制786-0细胞Ki-67 mRNA、Ki-67蛋白表达。结论成功构建的Ki-67 siRNA表达质粒pSliencer-Ki-67能抑制人肾癌786-0细胞Ki-67基因表达。     

非对称性小RNA干扰技术介导的USP22基因沉默的研究

目的 观察非对称小干扰RNA(aiRNA)对膀胱癌EJ细胞泛素特异肽酶22(USP22)基因的沉默效率及特异性的影响.方法 设计并合成USP22基因的小干扰RNA(siRNA)及aiRNA,利用脂质体Translipid转染EJ细胞,采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测转染前后EJ细胞USP22 mRNA的表达水平变化,比较USP22 siRNA与USP22 aiRNA对USP22基因沉默效率及特异性的差异.结果 浓度为50 nmol/L的15/21 USP22 aiRNA能明显抑制EJ细胞中USP22基因mRNA的表达,转染48 h后USP22 mRNA的表达水平下降到最低[(8.30±1.68)%,P＜0.05],且其沉默效率和特异性明显优于USP22 siRNA.结论 以非对称小RNA干扰技术为基础设计的USP22aiRNA能够有效沉默USP22基因,并且降低了非特异性的脱靶效应,减少了受RNA干扰中的"饱和机制"及"竞争机制"的影响,弥补了传统siRNA的一些不足.     

siRNA诱导EZH2基因增强子的表观沉默及其对人前列腺癌细胞的增殖抑制

目的 通过小分子RNA(siRNA)介导靶基因沉默技术,干扰前列腺癌细胞中果蝇zeste基因增强子的人类同源物的表达,以探讨靶向EZH2基因的RNAi对前列腺癌细胞增殖抑制的效应.方法 设计靶向EZH2基因的RNA干扰(RNAi)载体,构建重组表达质粒并且转染人前列腺癌细胞22RV1.利用MTT比色法检测靶向沉默EZH2表达对于22RVl的增殖抑制的影响:利用qRealtime-PCR鉴定转染组与空白组细胞中EZH2基因mRNA的表达量;提取各组细胞的总蛋白,利用Western Blotting检测EZH2蛋白的表达情况.结果 在转染了靶向EZH2基因siRNA的细胞株中,可以检测到EZH2表达呈明显的下调趋势:而在空白对照组中其表达很稳定.另外,诱导EZH2基因沉默可以抑制该前列腺肿瘤细胞的增殖和生长.上述结果 在各组细胞间旱现明显的统计学差异(P<0.05).结论 siRNA诱导的RNAi可以有效的抑制其靶基因EZH2的表达,同时可以抑制前列腺癌细胞的增殖和生长,是一种潜在的基因治疗新方法 .     

siRNA下调THBS4对人骨肉瘤MG63增殖的影响

目的探讨小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制血小板反应蛋白4(thrombospondin 4,THBS4)基因的表达对骨肉瘤MG-63细胞增殖的影响及其分子机制。方法将合成的THBS4 siRNA转染到人成骨细胞株MG63,CCK-8法观察对细胞增殖的影响,荧光定量PCR检测THBS4及TGF-beta1的mRNA表达,Western-blotting检测THBS4及TGF-beta1的蛋白表达。结果 Thbs4 siRNA转染后实验组48 h,72 h OD值高于阴性对照组(P0.05),差异具有显著性;Thbs4 mRNA和蛋白的表达水平明显低于阴性对照组和空白对照组(P0.01);Thbs4 siRNA转染后MG63细胞中TGF-beta1 mRNA及蛋白的表达水平提高(P0.01)。结论 THBS4 siRNA转染MG63后能够促进细胞增殖,其机制可能是激活TGF-beta1信号通路。     

RNAi抑制前列腺癌雄激素受体表达的实验研究

目的:利用RNA干扰(RNAi)效应抑制雄激素受体(AR)的表达,观察RNAi在人前列腺癌PC3细胞中的干扰效应,寻找高效率的干扰片断。方法:设计5个针对AR的不同的siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4和siRNA5)为实验组,构建表达载体并瞬时转染PC3细胞,提取总RNA和总蛋白,分别行荧光定量PCR和Western印迹检测AR mRNA和蛋白的表达,另设一无意义RNA表达载体为阴性对照组,比较实验组与对照组间的差异。结果:各实验组的AR mRNA的表达较对照组均不同程度下降,统计学分析差异有显著性(P(0.05),以siRNA1、siRNA4和siRNA5抑制效率最高,对比其余实验组差异有显著性(P(0.05),AR蛋白检测显示相同结果。结论:RNAi技术可有效地抑制前列腺癌细胞AR的表达,找到了具有较高抑制效率的siRNA并合成了其表达载体,为下一步的体内实验和药物研制奠定了基础。     

缺氧及沉默缺氧诱导因子-1α对BxPC-3细胞中RUNX3基因表达的影响

目的 观察缺氧及应用小干扰RNA (siRNA)沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因对胰腺癌细胞株BxPC-3中RUNX3基因表达的影响.方法 构建人RUNX3基因真核表达载体质粒pEGFP-RUNX3,CoC12化学模拟肿瘤缺氧环境,检测缺氧以及siRNA沉默HIF-1α对BxPC-3细胞中RUNX3基因在mRNA和蛋白水平的影响.结果 缺氧能使BxPC-3细胞中RUNX3基因的表达较常氧时显著升高[表达为(9.13±1.55),P＜0.05],siRNA转染BxPC-3细胞后能显著下调HIF-1α蛋白表达(抑制率90％),并导致RUNX3基因的表达也受到明显抑制.结论 缺氧促使BxPC-3细胞中HIF-1α在蛋白水平表达升高,缺氧时HIF-1α能上调RUNX3基因的表达水平.     

RNA干扰技术在肝脏疾病基因治疗中的应用

RNA干扰(RNAi)是同源性双链RNA诱发序列特异的转录后基因沉默现象,它可以通过抑制蛋白表达模拟基因敲除技术。RNAi可以由外源性途径导入,对相应的基因进行表达抑制。在病毒性肝炎、肝纤维化、肝脏肿瘤的治疗和肝移植免疫排斥反应的研究等领域具有广阔的应用前景。