腺病毒介导神经营养素-3基因转染施万细胞

[目的]构建神经营养素 3(NT 3)基因转染的施万细胞.[方法] NT 3基因重组腺病毒(AdvNT 3)扩增、纯化和测定后,转染体外培养的施万细胞(SCs).用免疫细胞化学和 ELISA方法分别检测 NT 3基因转染 SCs的 NT 3表达及培养液中 NT 3的含量. [结果]实验中获得的 AdvNT 3中外源基因序列与大鼠 NT 3的 DNA序列完全一致,与未基因转染 SCs相比,NT 3基因转染 SCs的 NT 3阳性增强,培养液中 NT 3含量增高.[结论]通过腺病毒介导可以获得 NT 3过量表达的基因转染 SCs.     

神经营养素-3基因转染神经干细胞的实验研究

目的：用神经营养素-3（NT-3）基因修饰神经干细胞,并观察在转染后的神经干细胞内的表达情况,为进一步的研究奠定基础。方法：采用阳离子脂质体介入法,将含绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组腺病毒表达载体pAd—NT—3转染原代培养的神经干细胞,观察GFP及NT-3两种蛋白的表达,镜下测定转染率,采用免疫组化和逆转录酶-多聚酶链反应（RT-PCR）方法进行鉴定。转染后的神经干细胞经G418筛选,获得成功转染NT-3基因的NSCs克隆。结果：镜下观察到绿色荧光蛋白长期表达在转染后的神经干细胞,转染率可达40％。免疫组化和RT-PCR结果显示NT-3在转染后的神经干细胞可以长期表达。结论：NT-3基因,通过腺病毒的介导,以阳离子脂质体为载体,可有效的转染培养的神经干细胞并长期表达。     

神经营养因子3基因转染的施万细胞在脊髓损伤大鼠中的实验研究

目的探讨神经营养因子3基因转染的施万细胞在脊髓损伤大鼠中的作用,以进一步了解其在脊髓损伤治疗中的应用价值。方法将90只健康Wistar大鼠采用Allen打击法建立脊髓损伤模型,将其随机分为A组（空白对照组）30只、B组（神经干细胞移植组）30只和C组（神经干细胞联合神经营养因子3基因转染的施万细胞移植组）30只。三组大鼠分别于移植前、移植后1、3个月进行BBB评分、皮质诱发电位及神经功能相关指标评估及比较。结果移植后1、3个月B组和C组的BBB评分中0～7分比例（B组：70％、60％,C组：50％、30％）、皮质诱发体感和运动电位[B组皮质诱发体感电位：（201．37±23．06）、（227．63±26．48）μV,C组皮质诱发体感电位：（241．36±27．34）、（278．53±31．46）μV;B组皮质诱发运动电位：（150．23±22．67）、（193．57±27．18）μV,C组皮质诱发运动电位：（186．72±26．83）、（242．57±30．56）μV],均优于A组[90％、90％,皮质诱发体感电位：（53．86±6．75）、（56．96±7．35）μV,皮质诱发运动电位：（32．64±4．07）、（34．15土4．12）μV]。另外,B、C组神经功能相关指标也均明显优于A组,而C组则优于B组,且C组移植后3个月神经功能指标水平明显优于移植后1个月。差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论神经营养因子3基因转染的施万细胞在脊髓损伤大鼠中的作用较佳．有利于脊髓损伤的改善,对改善患者的感觉、运动等指标均发挥着积极作用。     

腺病毒介导慢病毒载体的细胞转染

目的 尝试利用腺病毒介导慢病毒载体的细胞感染以提高转染效率。方法 以多聚赖氨酸粘合腺病毒和慢病毒载体形成复合体后感染Hela细胞，测定慢病毒载体目的基因表达的变化并用激光共聚焦扫描显微镜观察慢病毒载体的细胞摄人情况，进一步了解抗腺病毒衣壳球部的抗体能否干扰这种变化以证明腺病毒是否参与此介导作用。结果携带大肠埃希菌半乳糖苷酶(pgalactosidase，pgal)基因的慢病毒载体Lenti^-VSVG对Hela细胞的感染率非常低，通过多聚赖氨酸与腺病毒(AdenoPL)形成复合体后感染率显著上升并呈剂量依赖性。激光共聚焦扫描显微镜显示Lenti^-VSVG被细胞摄取的数量在和腺病毒粘合后显著增加。抗腺病毒衣壳球部抗体能抑制直至阻断Lenti^-VSVG／AdenoPI。复合体两者各自携带基因(分别是β-gal和荧光素酶／绿色荧光蛋白融合蛋白)的表达。结论 通过多聚赖氨酸的物理连接，腺病毒能介导慢病毒载体的细胞摄入从而提高转染效率。     

神经营养素-3重组腺病毒Ad-NT-3的培养和鉴定

目的 培养和鉴定重组腺病毒载体Ａｄ－ＮＴ－３。方法 在２９３细胞中培养扩增Ａｄ－ＮＴ－３，用组织培养半数感染量测测定其滴度。从病毒培养上清中提取ＤＮＡ，用聚合酶链反应技术扩增ＮＴ－３部分基因片段，将扩增产物克隆并进行序列分析以测定Ａｄ－ＮＴ－３中ＮＴ－３的存在及种属。结果 Ａｄ－ＮＴ－３扩增后获得了较高滴度的病毒。从形态学证实Ａｄ－ＮＴ－３扩增后获得了较高滴度的病毒。从形态学证实Ａｄ－ＮＴ－３含有     

腺病毒介导的TIMP-4基因转染抑制血管损伤后新生内膜形成

目的 :应用腺病毒介导的转基因方式转染人组织型金属蛋白酶抑制剂 4 (TIMP 4 )基因 ,以观察TIMP 4对球囊损伤后新生内膜形成的影响。方法 :体外培养血管平滑肌细胞 (VSMC)并转染含有TIMP 4基因的重组复制缺陷型腺病毒载体 (AdTIMP 4 ) ,采用单层培养细胞刮片法 ,观察TIMP 4对细胞迁移的影响 ;以大鼠颈总动脉球囊损伤模型为研究对象 ,损伤后即刻经血管外膜分别转入盐水、空载腺病毒载体和含有TIMP 4基因的腺病毒载体 ,观察细胞迁移和新生内膜形成情况。结果 :培养的VSMC转染AdTIMP 4后 ,细胞迁移明显受到抑制 ,与对照组相比抑制率为 6 3.9% (P <0 .0 1) ;在大鼠颈总动脉球囊损伤模型中 ,转基因后 4d时生理盐水组、空载腺病毒组和转染AdTIMP 4组内弹力板内的细胞数依次为 (32 .5± 4 .8)个细胞、(33.8± 7.0 )个细胞和 (8.2± 2 .4 )个细胞 ,转染TIMP 4可以显著抑制血管损伤后细胞向内膜的迁移 ;血管损伤后 2 8d时 ,转染TIMP 4组新生内膜面积与中膜面积比值与对照组相比降低了 6 6 .5 % (P <0 .0 1) ,空载腺病毒组与生理盐水组之间差异无显著性。结论 :TIMP 4可以抑制培养的VSMC的迁移 ,局部干预可以明显抑制大鼠颈总动脉球囊损伤后细胞的迁移和血管新生内膜的形成。     

腺病毒介导EGFP基因转染神经干细胞的实验研究

目的探讨腺病毒（adenovirus）介导的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因在神经干细胞（NSCS）的表达规律及转染对神经干细胞增殖、分化的影响。方法用不同感染复数的携带EGFP基因的腺病毒（Ad/EGFP）转染NSCS,在荧光倒置相差显微镜下观察EGFP的表达情况,同时用台盼蓝染色、细胞球计数、免疫细胞化学方法分别检测对照组和转染组细胞的活力、增殖、分化情况。结果Ad/EGFP转染16 h后NSCS发出绿色荧光,在第7天左右荧光强度达高峰并可持续稳定表达20天左右,Nestin表达阳性。在分化后细胞的胞体与突起均可见绿色荧光,部分细胞β-Ⅲtubu lin、GFAP表达阳性。同时观察到对照组和转染组的NSCS在第7天、14天、21天时细胞活力、增殖、分化情况均无统计学差异（P〉0.05）。结论Ad/EGFP可以高效转染新生大鼠海马NSCS,且不影响NSCS的存活、生长和分化。EGFP基因是神经干细胞的理想的报告基因。     

人神经营养素3基因重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建携带人神经营养素3(hNT3)基因的重组慢病毒表达载体。方法:通过双限制性内切酶消化和连接的方法构建pGC-E1-hNT3-EGFP质粒,将该质粒转化大肠杆菌DH5α,通过PCR、酶切、测序和对比验证hNT3,通过Lipofectamine 2000将pGC-E1-hNT3-EGFP、pHelper 1.0和pHelper 2.0三质粒系统共转染293T细胞包装病毒,经大量扩增后,应用实时定量PCR法鉴定和测定滴度。结果:克隆得到512 bp目的hNT3全长基因,经过PCR扩增、酶切鉴定、序列测定证实,hNT3基因成功克隆到慢病毒载体中,可实现hNT3基因的表达,且病毒滴度为5×107TU/L。结论:成功构建表达人hNT3基因的慢病毒载体并能在293T细胞中扩增获得足够高的病毒滴度,可作为基因转染的有效工具在将来神经损伤修复实验研究中得到应用。     

腺病毒介导脑源性神经营养因子基因转染在大鼠视网膜中的表达

目的 :研究腺病毒介导脑源性神经营养因子 (brain derivedneurotrophicfactor,BDNF)基因转染在活体大鼠视网膜的表达 .方法 :将BDNF腺病毒注入大鼠玻璃体内 ,于不同时间点免疫荧光染色检测表达 ;酶联免疫吸附实验 (enzymelinkedimmunosorbentassay ,ELISA)检测转染因素、损伤因素对视网膜表达BDNF的影响 .结果 :免疫荧光染色显示 3d节细胞即出现绿色荧光 ,可持续 4wk ,对照组荧光着色细胞数、荧光强度均低于各时间点转染组 ;ELISA显示经BDNF转染各组在各时间点表达均显著高于非转染组 (P <0 .0 1 ) ,损伤非转染组在 3d和 1wk时高于正常组 (P <0 .0 1 ) .结论 :腺病毒介导BDNF基因转染可在大鼠视网膜有效表达 ,损伤可以导致早期的BDNF表达升高     

神经营养素-3重组腺病毒促进脊髓背根神经节的存活

目的：观察神经营养素－3（neruotrophin3,NT－3)重组腺病毒（adorsal root ganglia ,DRG）细胞存活的促进作用,方法：原代培养DRG,加入不同感染增殖率（multiplicity of infection,MOI)的Ad-NT-3,观察DRG细胞的形态,MTT法测定DRG细胞的增殖活性,结果：当加入MOI为10和50的Ad-NT－3时,形态学发现,DRG细胞数目增加,突起变长,尤其以3d后表现更为明显,DRG细胞的增殖活性显增加（P＜0．01）,当MOI为100时1d和3d,DRG细胞数目明显减少,无突起或变短,部分细胞死亡,MTT法测定DRG细胞的增殖活性均显降低（P＜0．01）,结论：NT－3基因能通过腺病毒介导表达NT－3蛋白,促进体外培养DRG细胞的生活。     

腺病毒介导基因转染活体眼组织的研究

目的 :了解活体内不同途径应用腺病毒转染外源基因在眼组织的分布情况 .方法 :将含有 β 半乳糖苷酶 (beta galactosidase,β gal)报告基因的腺病毒 ,在 1× 10 9～ 1× 10 11nfu·L-1的滴度下 ,分别采用玻璃体腔内注射、前房注射、表面点药及球旁注射到大鼠眼内 ,3d ,1,2 ,3和 4wk后用 β gal染色法观察 β gal基因在眼组织内的分布情况 .结果 :各病毒滴度组均可有效地转染外源基因 ,且未观察到细胞病理改变 .玻璃体腔内注射的大鼠眼球组织包括角膜、虹膜、睫状体、视网膜均有β gal基因表达 ,前房注射组角膜、虹膜、睫状体有表达 ,表面点药组仅有角膜上皮细胞表达 ,球旁注射组眼外肌有表达 .注射 3d后开始出现 β gal基因阳性表达 ,持续达 4wk以上 .结论 :腺病毒能有效、稳定地转染外源基因到活体眼组织的角膜、虹膜、睫状体、视网膜     

神经营养素-3基因的扩增及序列分析

目的：从人脑基因组DNA获取神经营养素-3（neurotrophic-3,NT-3)基因,并对该项目的基因进行测序。方法：本实验直接从人脑组织中提取人脑基因组DNA,根据人的神经营养素-3基因的cDNA序列,设计一对寡核苷酸引物,采用聚合酶链反应（PCR）,获得人NT-3基因,DNA序列分析NT-3基因。结果：本实验采用PCR方法获得的基因片段长度为377bp,该基因序列为编码神经营养素-3的序列。结论：采用PCR获取NT-3基因序列是正确的,为进一步基因克隆和表达奠定基础。     

腺病毒载体介导人PML基因在人前列腺癌细胞的高效转染和表达

早幼粒细胞白血病基因（Ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａ，ＰＭＬ）编码的蛋白质是一种广谱的细胞生长抑制因子，在多种肿瘤细胞中过度表达能够有效地抑制细胞生长和裸鼠体内致瘤能力。在前列腺癌、乳腺癌及结肠癌中的表达变化可能与肿瘤的分化、局部浸润和...     

3腺病毒介导的LacZ基因在B16小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的　观察腺病毒介导的LacZ基因转移在B1 6细胞的转导效率。方法　腺病毒介导的LacZ基因转导B1 6细胞。结果　当MOI为 50～ 1 0 0 ,即可获得较高的转导效率 ,达 90 %± 1 %。结论　腺病毒介导的基因转移在B1 6细胞能获得较高的转导效率和目的基因的有效表达。提示腺病毒载体作为一种高效的基因转移载体 ,在肿瘤的基因治疗中有着良好的应用前景     

重组腺病毒介导的CTLA-4Ig基因在人源性细胞中的表达

目的：了解CTLA－4Ig重组腺病毒在不同人细胞中的转染能力及表达效率，为其器官转染研究及其治疗应用奠定基础。方法：用所构建的CTLA－4Ig腺病毒感染培养的HeLa细胞，人成纤维细胞，人脐静脉内皮细胞，应用免疫组化检测CTLA－4Ig的表达情况，结果：与重组腺病毒共培养6h使HeLa细胞获得转染，12h开始表达，36h表达达高峰；人成纤维细胞8h获得转染，24h开始表达，60h后达高峰，人脐静脉内皮细胞4h获得转染，12h开始表达，36h后达高峰。结论：CTLA－4Ig重组腺病毒能高效转染HeLa细胞，人成纤维细胞，人脐静脉内皮细胞。     

腺病毒介导gax基因转染对血管平滑肌细胞迁移的影响

目的以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞(VSMC),探讨gax基因表达增强后VSMC迁移的变化.方法以携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(AdCMV-gax)常规转染VSMC后,应用免疫细胞化学染色检测gax基因表达的变化,Boyden's小室观察gax基因表达增强对VSMC迁移的影响.结果①AdCMV-gax转染前,PDGF-BB下调Gax蛋白的表达,接近正常生理浓度的PDGF-BB(2 ng/ml)即可使VSMC的Gax蛋白表达率由36.42%显著降低至22.83%(P＜0.05),随着PDGF-BB浓度的升高,gax基因表达下降程度更加显著;AdCMV-gax转染后,无论有无PDGF-BB刺激,VSMC中gax基因的表达均比转染前显著增高.②AdCMV-gax转染使VSMC表达gax增强后,VSMC迁移数较未转染组显著减少.结论增强gax基因表达,可抑制由有丝分裂原刺激所引起的VSMC迁移.     

携带神经营养因子-3基因的重组腺病毒的构建和鉴定

目的:构建含人神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)的重组腺病毒载体,为初步研究NT-3的在体功能做准备。方法:酶切法从已构建好的真核表达载体NT-3-pIRES2-DsRed2质粒中切下含有NT-3和DsRed2(包括连接区域pIRES2)的目的片段,将其插入到腺病毒骨架质粒pAdShuttle-CMV的多克隆位点中,电穿孔法将腺病毒骨架载体pAdShuttle-CMV-NT-3-DsRed2和预转入人肠杆菌BJ5183的穿梭载体pAdEasy-1进行细菌内同源重组。PacⅠ酶切线性化鉴定正确的同源重组载体,脂质体法转染293T细胞,包装形成表达NT-3目的蛋白和红色荧光的腺病毒。通过293T细胞3轮扩增病毒,氯化铯密度梯度离心,获得高滴度的纯化腺病毒。Western blot方法检测蛋白表达情况。结果:同源重组质粒载体的DNA测序证实腺病毒载体中含有NT-3的目的片段,Western blot证实感染重组腺病毒的293T细胞中有相应的NT-3蛋白表达;病毒滴度为109PFU/ml。结论:利用细菌内同源重组的方法可以成功构建同时表达NT-3蛋白和红色荧光的重组腺病毒。     

腺病毒载体介导的bFGF基因体外转染大鼠平滑肌细胞的实验研究

目的观察携带bFGF基因的重组腺病毒体外转染平滑肌细胞的效率及转染后目的基因的表达。方法应用磷酸钙共沉淀法分别构建携带bFGF基因和大肠杆菌LacZ报道基因的重组腺病毒载体Ad．bFGF和Ad．LacZ,并以Ad．bFGF（组Ⅰ）、Ad．LacZ（组Ⅱ）、PBS（组Ⅲ,对照组）转染体外培养的大鼠平滑肌细胞（SMCs）。X—gal染色检测腺病毒载体的转染效率,噻唑蓝（MTT）检测各组SMCs的增殖情况,酶联免疫吸附（ELISA）检测各组培养液中bFGF蛋白的浓度。结果当MOI值为100时,X-gal核蓝染细胞比率达95％以上;组ⅠSMCs的增殖水平显著高于组Ⅱ和组Ⅲ（P〈0．01）;ELISA方法检测,在转染后第1天组Ⅰ培养波中即有bFGF蛋白的分泌表达,第3天达峰值后分泌量逐渐下降,第8天仍能检测到少量分泌,而组Ⅱ和组Ⅲ培养液中均未检测到bFGF蛋白。结论成功地将所构建的Ad. bFGF转染体外培养的SMCs,并在培养液中检测到目的基因的蛋白表达。     

大鼠失神经支配表情肌NT-3基因转染的实验研究

目的:观察神经营养素3(neurotrophin-3,NT-3)基因转染大鼠失神经支配表情肌的情况及对其功能恢复的影响.方法:离断大鼠面神经的下颌缘支和颊支后无张力外膜吻合制备面神经损伤模型,以直接注射法将脂质体DC-Chol和重组质粒pcDNA3.1( )-NT-3混匀后注入受损神经处的神经所支配的肌肉内.采用PT-PCR技术检测转基因处肌肉的NT-3表达,并观察NT-3基因转染后大鼠触须活动情况.结果:经脂质体DC-Chol介导NT-3基因可有效地转染组织并得到表达,大鼠转基因实验侧的触须拂动比对照侧提前开始恢复.结论:经脂质体介导的外源性NT-3在损伤局部表达并具有促进和加快面神经功能恢复的作用.     

腺病毒介导CTLA4Ig基因转染骨髓基质细胞及其对CD34+细胞粘附力的影响

目的：通过腺病毒介导CTLA4Ig在骨髓基质细胞）Bone marrow stromal cells,BMSCs）中的表达，探讨CTLA4Ig基因修饰的BMSCs对CD34^ 细胞的粘附力的变化，方法：以CTLA4Ig－重组腺病毒按感染复数（Mutiplicity of infetion,MOI)50转染BMSCs，免疫组的^3H-TdR标记CD34^ 细胞的cpm值观察CTLA4Ig基因修饰的骨髓基质细胞的粘附力变化，结果：免疫细胞化学染色示CTLA4Ig表达阳性率达85％（MOI＝50），弥漫性定位于细胞质，免疫磁体阳性选择获取的骨髓CD34^ 细胞纯度可高达97．8％，转染组与对照组BMSCs对CD34^ 细胞的粘附力无显著差异（P＞0．05）。结论：CTLA4Ig－重组腺病毒能有效介导CTLA4Ig基因在BMSCs中表达，并对其粘附力无显著影响。