自体嗅黏膜移植修复大鼠脊髓损伤的实验研究

目的　观察自体嗅黏膜植入大鼠脊髓后的变化及其对轴突再生的修复作用。探索临床自体嗅黏膜移植修复脊髓损伤的可能性。　方法　成年雄性Wistar大鼠随机分为嗅黏膜移植组和对照组各 2 0只。嗅黏膜移植组取鼻中隔后部的嗅黏膜组织 (1mm2 )植入自体大鼠脊髓颈 1节段后索内的皮质脊髓束缺损处 (2mm× 1 5mm) ;对照组取鼻腔呼吸区黏膜植入脊髓同样的损伤处。 4～ 6周处死动物 ,移植区冰冻水平切面 ,免疫荧光双标神经丝蛋白 (NF)和神经生长因子受体蛋白 (NGFRp75 ) ,Confocal显微镜下观察 ,另行免疫组织化学染色观察移植嗅黏膜与周围组织的生长情况。　结果　对照组大鼠的损伤处有明显空洞 ,呼吸区黏膜内未见p75染色 ;嗅黏膜移植组可见p75标记的植入的嗅黏膜与周围组织愈合良好 ,空洞明显减少 ,被标记的嗅成鞘细胞向神经组织浸润生长 ,在移植物内有大量被标记的纤细的不分叉的NF纤维穿过。　结论　自体嗅黏膜有可能成为临床嗅成鞘细胞修复脊髓损伤的供体     

OECs移植联合IN-1抗体修复急性脊髓损伤的实验研究

目的研究嗅鞘细胞移植联合轴突生长抑制蛋白抗体IN-1局部持续注射对大鼠横断性脊髓损伤的修复作用.方法成年雄性SD大鼠40只,建立胸脊髓全横断损伤模型,随机分成单纯对照组(10只)、嗅鞘细胞移植组(10只)、IN-1抗体微泵注射组(10只)和嗅鞘细胞移植联合IN-1抗体组(10只).应用NF200免疫组化染色和免疫荧光染色对脊髓损伤区神经纤维再生进行形态学观察.采用BBB评分评估大鼠后肢功能恢复情况.结果横断损伤共有9只大鼠死亡.术后8周可观察到Hoeehet标记的嗅鞘细胞在体内存活并在脊髓内迁移;联合治疗(OECs IN-1)组和OECs组可见脊髓损伤区杂乱无序的再生轴突,但无连续性神经纤维通过损伤区;IN-1组和对照组脊髓残端萎缩,未见轴突再生.后肢功能运动平均BBB评分对照组、IN-1抗体组、细胞移植组和联合治疗组分别为7.70±0.24、7.89±0.15、10.50±0.25、11.33±0.24.结论OECs移植联合IN-1抗体可促进损伤的脊髓神经轴突的存活和再生,较单纯应用OECs或IN-1能更好的促进脊髓损伤修复和大鼠后肢功能恢复.     

人骨髓间质干细胞和嗅鞘细胞移植对大鼠急性脊髓损伤功能修复的比较研究

目的对比人骨髓基质细胞(BMSCs)与人胚嗅鞘细胞(OECs)移植对大鼠脊髓损伤功能修复的影响。方法将45只SD大鼠分成脊髓损伤后BMSCs移植组(BMSCs组)、OECs移植组(OECs组)和PBS对照组(PBS组),通过BBB评分、运动诱发电位(MEP)评估脊髓传导功能的改善状况,免疫组织化学方法检测移植细胞存活和分化情况,病理形态学方法观察组织结构修复情况。结果BMSCs组BBB评分高于OECs组(P<0.05);两细胞治疗组MEP潜伏期明显缩短(P<0.05);BMSCs组嗜银染色可见脊髓损伤近端有较多再生纤维向远端延伸,形成神经纤维束,而OECs组再生纤维较少;两种移植细胞均可在损伤处部分存活,BMSCs组可见BMSCs来源的细胞Nestin、NF、GFAP的阳性表达。结论BMSCs移植比OECs移植能更有效促进大鼠急性脊髓损伤修复。     

纤维蛋白胶包裹嗅神经鞘细胞促进脊髓轴突再生的实验研究

目的 观察纤维蛋白胶(FG)包裹嗅神经鞘细胞(OECs)植于成年大鼠脊髓全横断断端间隙内对损伤轴突再生的促进作用。方法 成年雄性SD大鼠16只，行脊髓T11节段全横断术。FG-OECs组于间隙内移植FG包裹的OECs，FG对照组移植等量的FG，OECs对照组移植等量DF12-OECs悬液，单纯全切对照组未做任何移植，每组动物4只。术后2周处死动物，脊髓损伤区冰冻水平切片，荧光显微镜下观察OECs的存活及迁移，并行抗神经丝(NF)和生长相关蛋白-43(GAP-43)抗体免疫组织化学染色。结果 OECs及单纯全切对照组脊髓两断端连接较差，而FG对照组及FG-OECs组两断端连接良好。FG、OECs及单纯全切对照组损伤区可见少量NF及GAP-43免疫反应纤维；FG-OECs组间隙内OECs大量存活，并迁移至两侧脊髓实质内，大量NF及GAP-43免疫反应纤维通过间隙。结论 FG包裹的OECs可在成年大鼠脊髓全横断断端间隙内存活并迁移至脊髓实质内，促进损伤轴突的再生。     

自组装肽包裹嗅神经鞘细胞抑制脊髓损伤后胶质瘢痕形成并促进轴突再生

目的研究自组装肽包裹嗅神经鞘细胞(OECs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后轴突再生的影响。方法成年雄性SD大鼠40只,行脊髓T_(10)节段背侧横断术,动物随机分为4组,每组10只。SAP-OECs组于间隙内移植SAP包裹的OECs悬液,SAp、OECs对照组同法分别移植等量SAP及DF12-OECs悬液;单纯全切对照组不做处理。术后2或4周过量麻醉处死动物,脊髓损伤节段连续冰冻矢状切片。行抗GAP-43和GFAP免疫组织化学和免疫荧光双标染色。结果SAP-0ECs组损伤区内有大量GAP-43免疫反应纤维,SAP组相较OECs及单纯半切对照组则可见相当数量GAP-43免疫反应纤维。OECs及单纯半切对照组损伤区周围可见一条致密度的GFAP阳性的反应性星形胶质细胞条带,而SAP组GFAP免疫反应纤维比对照组少,且多于SAP-OECs组。此外激光共聚焦显微镜下观察SAP-OECs组在损伤后4周GAP-43免疫反应纤维能通过位于脊髓损伤区尾端的GFAP阳性区域。结论自组装肽包裹嗅鞘细胞可以抑制脊髓损伤后胶质疤痕形成并促进轴突再生。     

微囊化兔嗅球细胞悬液移植对脊髓损伤大鼠GFAP及NF200表达的影响

目的:探讨微囊化兔嗅球组织细胞移植对脊髓损伤大鼠胶质原纤维酸性蛋n(GFAP)及神经丝蛋白200(NF200)表达的影响.方法:SD大鼠分为正常组、损伤对照组、细胞悬液组、微囊化移植组.用免疫组织化学染色方法观察损伤脊髓内GFAP及NF200表达,变化.结果:脊髓损伤后NF200及GFAP表达均呈进行性增高,二者有显著的相关性;微囊组术后7、14、21 d胶质原纤维酸性蛋白的表达显著低于损伤对照组;但微囊组脊髓内NF200表达显著升高.结论:微囊化兔嗅球细胞悬液移植可促进损伤脊髓内的NF200表达并抑制GFAP表达,有可能有助于脊髓功能的恢复.     

嗅鞘细胞与氯化锂联合修复成年大鼠急性脊髓损伤的实验研究

为观察联合应用氯化锂(LiCl)后,嗅鞘细胞(OECs)移植对大鼠急性脊髓损伤修复效果,并探讨二者之间可能的相互作用,本研究利用多中心急性脊髓损伤打击器(MASCIS impactor)制作大鼠脊髓打击伤模型,然后随机分为OECs组、LiCl组、OECs+LiCl组及空白对照组。分期用实验性脊髓损伤运动功能BBB评分法对后肢运动功能评分,并进行组织学检查,评价及比较各组修复效果。结果显示:OECs组与OECs+LiCl组BBB评分较LiCl组与对照组在2周后各时段有显著性差异(P<0.01);OECs+LiCl组BBB评分在4周后显著高于OECs组(P<0.01);组织学检查观察到OECs组与OECs+LiCl组的组织学改变与LiCl组和对照组有显著性差异,而且OECs+LiCl组相对于OECs组表现出更明显的促神经纤维再生。以上结果提示OECs对脊髓损伤的修复作用在联合LiCl后更加显著,表明二者具有良好的协同作用关系。     

嗅鞘细胞移植和左旋硝基精氨酸对大鼠脊髓损伤后背核神经元存活及其轴突再生的影响

目的 探讨嗅鞘细胞(OECs)移植和一氧化氮合酶(NOS)抑制剂左旋硝基精氨酸(LNNA)对大鼠脊髓损伤后,背核神经元存活及其轴突再生的影响.方法 将20只大鼠行脊髓半横断术后分为对照组、OECs组、L-NNA组和OECs L-NNA组.OECs L-NNA组在脊髓损伤处移植嗅鞘细胞,并注射L-NNA.术后30d时,应用NADPH酶组织化学、免疫组织化学、中性红染色、HE染色和荧光金逆行标记等方法,观察4组大鼠L1背核神经元存活及其轴突再生情况.结果 1.0ECs组、L-NNA组L1背核神经元存活数量均高于对照组,且分类计数显示,这两组对脊髓背核大、中、小神经元的存活均有促进作用,而OECs L-NNA组的促存活作用最显著.2.0ECs组和OECs L-NNA组脊髓损伤处可见再生的轴突,且L1背核可观察到被荧光金逆行标记的神经元胞体.3.与对照组比较,OECs组L1背核NOS阳性神经元增加,L-NNA组NOS阳性神经元减少,OECs L-NNA组NOS阳性神经元数量差异不明显.结论 嗅鞘细胞移植和L-NNA均可促进脊髓受损伤背核神经元的存活,两者联合应用可更好地促进受损伤的背核神经元存活及其轴突再生.     

嗅鞘细胞移植对脊髓半横断损伤大鼠后肢运动功能的影响

目的观察嗅鞘细胞移植物对脊髓半横断损伤大鼠后肢运动功能的影响。方法30只雌性成年SD大鼠制成脊髓半横断损伤模型,并随机分成5组立即进行移植,A组移植纯化的嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)悬液,B组移植纯化的OECs培养上清液,C组移植未纯化的OECs,D组移植未纯化的OECs培养上清液,E组移植DMEM/F12培养液,术后6 w内进行BBB评分和IP实验,用单因素方差分析进行统计学分析。结果A组的BBB评分在3w后较其它组高,差异有统计学意义(P<0.05),A组的IP实验结果在4 w后较其它组高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论纯化培养嗅鞘细胞移植能促进脊髓半横断损伤大鼠后肢运动功能恢复。     

成年大鼠嗅球和鼻腔嗅粘膜成鞘细胞的分离、培养与鉴定

目的　在嗅球成鞘细胞 (OECs)移植到脊髓可有助于损伤神经纤维再生的基础上 ,分别对嗅球和嗅粘膜的OECs进行培养 ,探索自体嗅粘膜作为OECs供体的可能性。　方法　根据OECs、成纤维细胞和星形胶质细胞贴壁时间的不同 ,采用差时贴壁方法分离出OECs,培养 14div后进行NGFRp75和GDNF的免疫细胞化学染色。　结果　按形态学和免疫组织化学特性 ,培养的嗅球和嗅粘膜OECs可分为 3类 :双极细胞、三级细胞和扁圆细胞 ,其中以双极细胞最多。嗅粘膜的双极成鞘细胞的突起更加细长。　结论　差时贴壁细胞分离法是一种简单、经济、实用的成鞘细胞分离方法。鼻腔嗅粘膜OECs的形态学和免疫细胞化学特性与嗅球OECs基本相同 ,本实验为临床开展自体嗅粘膜OECs修复脊髓损伤的研究提供参考     

自体嗅鞘细胞联合β-七叶皂甙钠修复大鼠脊髓全横断损伤

背景：神经损伤时移植嗅鞘细胞能促进轴突再生,减少星形胶质细胞增生。 目的：探讨自体嗅鞘细胞移植联合中药β-七叶皂甙钠对脊髓继发性损伤的保护作用。 方法：制作SD大鼠脊髓损伤模型,随机分为对照组(注射生理盐水)、自体嗅鞘细胞移植组、自体嗅鞘细胞移植联合β-七叶皂甙钠治疗组。 结果与结论：脊髓损伤后脊髓血管源性水肿、基质金属蛋白酶9表达上调,大鼠运动功能缺失,经自体嗅鞘细胞移植及自体嗅鞘细胞联合β-七叶皂甙钠治疗后脊髓水肿明显减轻、基质金属蛋白酶9表达下调,大鼠运动功能恢复,以自体嗅鞘细胞移植联合β-七叶皂甙钠治疗效果更明显。说明自体嗅鞘细胞移植联合β-七叶皂甙钠可更有效修复损伤脊髓,发挥保护作用。     

嗅鞘细胞移植促进脊髓损伤模型大鼠修复损伤区组织的超微结构特征

文题释义： 嗅鞘细胞：是一种嗅神经的支持细胞,它起源于嗅基底膜,分布在嗅球,嗅神经和嗅中枢。位于中枢和外周神经系统过渡区,具有降解抑制再生分子、分泌不同神经营养因子、促进神经轴突和髓鞘的再生、改善脊髓损伤后的微环境等重要作用。 超微结构：通过透射电子显微镜观察脊髓损伤后损伤部位神经元的细胞膜、细胞器(高尔基复合体,尼氏体,内质网、核糖体、神经微丝、微管)、细胞核(核仁、核周体);髓鞘,轴突,突触,胶质瘢痕等亚细胞水平的变化。 背景：嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤是目前的研究热点,其研究主要探讨脊髓损伤后微环境的影响,嗅鞘细胞移植对脊髓损伤后脊髓超微结构的影响未见报道。 目的：观察脊髓损伤后损伤部位神经细胞、轴突、髓鞘、突触和胶质瘢痕的超微结构以及嗅鞘细胞移植对大鼠损伤脊髓的保护和神经修复再生的影响。 方法：实验方案经西安交通大学医学部生物医学伦理委员会批准(批准号2018-2048)。将成年健康雌性SD大鼠20只随机分成3组：空白组(4只)仅仅切除T₁₀全部椎板及T₉, T₁₁部分椎板,未对脊髓作其他处理;DF12组(8只)切断脊髓,注射DF12培养液;嗅鞘细胞移植组(8只)切断脊髓,进行嗅鞘细胞移植。于脊髓损伤后1,7,28,56 d,对各组大鼠麻醉后取出脊髓,透射电镜观察脊髓损伤区神经细胞超微结构的变化。 结果与结论：①与空白组比较,DF12组大鼠脊髓损伤区神经元胞体内细胞器明显减少,轴突、髓鞘和突触的超微结构发生明显的变化;嗅鞘细胞移植组损伤区的神经元胞体内细胞器明显增加,核仁明显,促进轴突、髓鞘和突触的再生,且胶质瘢痕明显较少;②嗅鞘细胞移植组大鼠星形胶质细胞和毛细血管周细胞的反应比较轻微;③结果说明,脊髓损伤后嗅鞘细胞移植可有效地保护脊髓损伤区的神经组织,促进轴突、髓鞘和突触的再生,抑制神经胶质和周围细胞的增生反应,从而使损伤后微环境有利于神经元、轴突和突触再生。ORCID: 0000-0001-6049-2551(王国毓) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程     

自体嗅粘膜联合β-七叶皂甙钠对脊髓损伤后FasL及Caspase-3表达的影响

目的探讨自体嗅粘膜联合β-七叶皂甙钠对Caspase-3及FasL表达与神经再生功能的影响。方法 SD大鼠随机分为损伤对照组(A组),自体嗅粘膜移植组(B组),自体嗅粘膜联合β-七叶皂甙钠组(C组),β-七叶皂甙钠组(D组)。每组分为1、3、7、14 d 4个时间点。制作脊髓半切模型,观察组织病理学改变;对动物后肢功能进行BBB评分;采用免疫组化法检测FasL、Caspase-3的表达。结果脊髓损伤后B、C、D组BBB评分均高于A组,FasL、Caspase-3阳性细胞数均较A组少,C组BBB评分较B、D组高,FasL、Caspase-3阳性细胞数较B、D组少。B、D组间无显著性差异。结论自体嗅粘膜与β-七叶皂甙钠两者之间有协同作用,可明显改善神经运动功能;此种保护作用可能与联合治疗能够抑制FasL、Caspase-3途径的细胞凋亡有关。     

嗅鞘细胞培养上清液促进大鼠周围神经损伤后的修复与再生

文题释义：细胞培养上清：细胞在正常生理过程中会释放一些信息物质,包括可溶性因子、细胞外囊泡、蛋白质、各种RNA等,这些物质能够在细胞间通讯,乃至在多种生理过程中发挥重要作用。在细胞培养过程中,这些物质由细胞分泌至细胞培养液中。这种含有细胞分泌的活性物质并去除了细胞碎片等杂质的培养液,称为细胞培养上清。 神经再生：损伤后的神经再生是一个复杂的生理过程,受多种因素的影响和调节。神经再生过程可归纳为3个方面：受损神经近端轴突的萌芽和伸长,再生轴突的髓鞘化,再生轴突与靶器官之间突触连接的重建。神经再生分为中枢神经再生及周围神经再生。受轴突外部再生微环境的影响,中枢神经再生较外周神经再生更为困难。 背景：既往研究发现嗅鞘细胞培养上清可以促进脊髓损伤后轴突再生及功能恢复,但应用于周围神经损伤治疗方面鲜有报道。 目的：探讨嗅鞘细胞培养上清是否有助于周围神经损伤后的神经修复。 方法：分离纯化嗅鞘细胞并鉴定,制备嗅鞘细胞培养上清。在体外环境将嗅鞘细胞培养上清作用于背根神经节组织块,观察背根神经节轴突生长情况;在体内环境将嗅鞘细胞培养上清应用于大鼠坐骨神经缺损模型,观察坐骨神经轴突再生及髓鞘化情况。 结果与结论：①嗅鞘细胞纯度高达(94.4±3.1)%;②与空白对照组和低剂量嗅鞘细胞上清组对比,高剂量嗅鞘细胞上清组背根神经节组织块的5根最长神经轴突平均长度显著增加(P < 0.05);③免疫荧光显示嗅鞘细胞上清处理组与自体神经移植组类似,再生神经贯通缺损区域,并且再生神经排列有序,神经再生情况显著优于空白对照组;④透射电子显微镜观察显示嗅鞘细胞上清处理组再生神经轴突的数量和髓鞘厚度显著高于空白对照组(P < 0.05);⑤结果表明,嗅鞘细胞培养上清能够促进周围神经损伤后轴突再生及再生轴突的髓鞘化,为周围神经损伤提供了一种新的基于嗅鞘细胞的无细胞疗法。 ORCID: 0000-0002-9558-8585(杨雨洁) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

伸长细胞移植促进成年大鼠脊髓再生修复的研究

目的探讨采用体外培养的伸长细胞(Tanycytes,TAs)移植治疗大鼠脊髓损伤的可行性。方法将体外培养的TAs标记后,移植入全横断脊髓损伤大鼠。实验大鼠共分5组:A.单纯TAs细胞移植组,B.TAs细胞加壳聚糖载体移植组,C.壳聚糖载体移植组,D.单纯损伤组,E.假手术组。移植后通过BBB评分法评价大鼠的运动功能恢复情况,并且通过光学显微镜观察移植细胞的存活、迁移和损伤脊髓的修复情况,以及观察大鼠脑区神经元存活状况。结果与对照组相比,TAs移植促进了脊髓损伤局部结构的修复和大鼠下肢运动功能的恢复;移植组可在脑皮质观察到HRP逆行标记神经元;对照组皮质感觉运动区和红核神经元密度小于移植组,差异有显著意义。结论TAs移植可促进损伤脊髓轴突的再生、促进大鼠后肢运动功能的改善。     

Unique in vivo properties of olfactory ensheathing cells that may contribute to neural repair and protection following spinal cord injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are specialized glial cells that guide olfactory receptor axons from the nasal mucosa into the brain where they make synaptic contacts in the olfactory bulb. While a number of studies have demonstrated that in vivo transplantation of OECs into injured spinal cord results in improved functional outcome, precise cellular mechanisms underlying this improvement are not fully understood. Current thinking is that OECs can encourage axonal regeneration, provide trophic support for injured neurons and for angiogenesis, and remyelinate axons. However, Schwann cell (SC) transplantation also results in significant functional improvement in animal models of spinal cord injury. In culture SCs and OECs share a number of phenotypic properties such as expression of the low affinity NGF receptor (p75). An important area of research has been to distinguish potential differences in the in vivo behavior of OECs and SCs to determine if one cell type may offer greater advantage as a cellular therapeutic candidate. In this review we focus on several unique features of OECs when they are transplanted into the spinal cord.     

Gait analysis of spinal cord injured rats after delivery of chondroitinase ABC and adult olfactory mucosa progenitor cell transplantation

Chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG) is a major component of glial scar to restrict axonal regeneration in the lesion site after spinal cord injury (SCI). Chondroitinase ABC (ChABC), a bacteria enzyme, which has been demonstrated to digest the glycosaminoglycan (GAG) side chain of CSPG to promote axonal re-growth across the injured site. Our previous study suggested that long-term delivery of ChABC (1 U/ml, injection volume 0.6 μl for one animal) via intrathecal catheter could decrease the inhibitory effect of limiting axonal re-growth after SCI. The functional behavior has been shown to improve following ChABC treatment. Little axons re-grow across the lesion site of the spinal cord but not enough to support axon innervations to targets. In this article, we show that ChABC administration combining olfactory mucosa progenitor cell (OMPC) transplantation can promote axonal re-growth across the lesion site and enhance the consistency of stepping in spinally transected rats. These OMPCs generated NG2⁺ cell lineages after transplanting into the spinal cord parenchyma, and OMPCs were found to spread and migrate toward the lesion region of spinal cord. Moreover, the spatial and temporal characteristics of the step cycle in rats that receive a complete spinal cord transaction following continuous ChABC supply and OMPC transplantation. The gait characteristics of treated rats on a treadmill were consistent and approached that of intact rats. In future, the mechanism of restoring the injured spinal cord will be further investigated.     

不同时间点静脉移植嗅鞘细胞修复脊髓损伤

背景:嗅鞘细胞具有促进轴突再生、为受伤的宿主细胞提供营养支持以及调节炎症反应的能力,是修复脊髓损伤具有潜力的细胞。目的:探讨通过静脉移植嗅鞘细胞治疗脊髓损伤的最佳移植时间窗。方法:SPF雄性SD大鼠30只,采用脊髓半横断建立大鼠脊髓损伤模型,并随机分为5组:脊髓损伤后注射嗅鞘细胞1 d移植组、3 d移植组、7 d移植组、10 d移植组及PBS对照组。应用荧光量子点标记嗅鞘细胞;分别于1,3,7,10 d时间点通过尾静脉移植应用量子点标记的嗅鞘细胞;PBS对照组脊髓损伤后注射PBS。注射后1 d取损伤处的脊髓;应用小动物成像仪测定不同时间点转移到损伤处荧光的数值,通过荧光的强度衡量转移到损伤处细胞的量;应用嗅鞘细胞Anti-p75 NGF Receptor抗体做损伤处脊髓的免疫组织化学。实验方案经宁夏医科大学动物实验伦理委员会批准(编号:2017-073)。结果与结论:①荧光量子点可以标记嗅鞘细胞;②荧光测定结果与免疫组织化学染色结果:1,3,7,10 d时间点通过尾静脉移植的嗅鞘细胞均有细胞转移到损伤处,7 d移植的嗅鞘细胞转移到损伤处的最多;③结果说明,脊髓损伤不同时间点注射的嗅鞘细胞均可以转移到脊髓损伤处,损伤后7 d移植的嗅鞘细胞转移到损伤处的细胞数量最多,可以作为移植的最佳时间窗。