亚性疟原虫多价重组疫苗的研制及其免疫活性的初步鉴定

为了探讨Ｔ、Ｂ淋巴细胞双重激活表位的重组复合症疾抗原的免疫原性和保护作用，作者设计合成了编码亚性疟原虫红内期３个保护性抗原位点和２个外源性Ｔ细胞激活位点的复合基因ＨＧＦＣ，并构建了多连体复合基因ＨＧＦＣＡＣ。两种复合基因分别与表达载体ｐＷＲ４５０－１重组，并在大肠杆菌中表现出含外源蛋白和β－半乳糖苷酶部分氨基酸的融俣蛋白，表达量为３５％。     

恶性疟基因工程疫苗的研究Ⅲ．恶性疟原虫保护性抗原复合基因在大肠杆菌中的表达及产物分析

将人工合成的恶性疟原虫保护性抗原复合基因ＨＧＦＣ和ＨＧＦＣＡＣ分别与表达载体ｐＢＶ２２０重组并转化大肠杆菌ＤＨ５χ，挑取工程菌进行发酵试验并用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表达产物。结果显示经温度诱导后的工程菌在相当于分子量１０ｋｄ和２５ｋｄ的位置出现表达产物的条带，扫描测定表达产物的量占菌体蛋白总量的５％左右。免疫印迹分析显示表达产物可与免抗恶性疟原虫多肽抗原的抗体发生特异性免疫反应，提示表达产物为具有恶性疟原虫抗原位点活性的重组复合蛋白。     

恶性疟的两种重组复合抗原的纯化与鉴定

用我们构建的高效表达恶性疟原虫复合抗原融合蛋白的工程菌ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｐＷＲ－Ｃ／ＪＭ１０９和ｐＷＲ－ＣＡＣ／ＪＭ１０９进行发酵培养，收集菌体经超声波破菌、硫酸铵分级沉淀、分子筛层析、离子交换层析等步骤纯化后，纯度可达８２．０％。纯化后的融合蛋白保持β－半乳糖苷酶的活性。用等电聚焦技术测定纯化蛋白等电点分别为８．４０和８．２５．用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法测定纯化蛋白的免疫原性，证实纯化的重组蛋白可与小鼠抗恶性疟原虫抗体及疟区病人血清发生特异性免疫反应。重组蛋白加弗氏佐剂免疫家兔制备的抗血清可与４种工程菌表达产物发生特异免疫反应，并可识别恶性疟原虫海南株和云南株红内期抗原。说明纯化的重组融合蛋白为具有恶性疟原虫抗原活性的重组复会抗原。     

疟疾基因工程疫苗的研究Ⅱ．恶性疟保护性抗原复合基因的串接与克隆

将人工合成的恶性疟原虫４５肽抗原基因ＨＰＦＡ和７５肽抗原基因ＨＧＦＣ分别从克隆载体上切下，经过一系列的串接和克隆，筛选出含有ＨＧＦＣ－ＨＰＦＡ－ＨＧＦＣ三连体基因（ＨＧＦＣＡＣ）的重组克隆，经酶切鉴定和ＤＮＡ序列分析证实基因序列与设计一致。该三连体基因含有起始和终止密码，编码一个１９３肽的复合抗原。多连体基因串接与克隆的成功，在基因水平上实现了复合抗原的多聚，从而为进一步研究疟疾多价疫苗的结构和功能提供了条件。     

PDGF—B基因的膜型表达产物促进血管平滑肌细胞增殖和胶原合成

考察ＰＤＧＦ－Ｂ基因的膜型表达产物对血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ）增生、胶原合成的影响。制备供转导人ＰＤＧＦ－Ｂ基因的重组逆转录病毒，感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，受染ＮＩＨ３Ｔ３细胞经筛选、扩增后，制备细胞膜上表达产物ＰＤＧＦ－ＢＢ以观察其对ＶＳＭＣｓ生长的影响，并以３Ｈ－ＰｒｏＬｉｎｅ掺入率评估该重组蛋白对ＶＳＭＣｓ胶原合成的影响。结果：重组逆转录病毒介导ＰＤＧＦ－Ｂ基因转移并表达出具有生物学活性的重组ＰＤＧＦ－ＢＢ，免疫荧光细胞化学染色证实其表达；该膜型重组蛋白可促进ＶＳＭＣｓ增殖和胶原合成。     

恶性疟原虫多表位重组疫苗在大肠杆菌中的表达及纯化

目的 在体外表达和纯化目的的蛋白,为下一步抗攻击试验提供安全有效的产品。方法 将化学合成的恶生疟原虫保护性抗原复合基因（ＨＧＦＳＰ）与表达载体ｐＲＳＥＴ重组,在大肠杆菌ＧＩ２１进行表达;工程菌经超声破菌、离心、离子交换层析、疏水层析、分子支析等步骤纯化。结果 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示表达产物以非融合、可溶性的形式表达,相对分子质量为２３ｋＤａ,占总菌体蛋白的２３．６５％,纯度可达９５％以上。Ｗｅｓｔｅ     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白—2基因克隆及其在大肠杆菌中 …

目的：克隆恶性疟原虫裂殖子表面蛋白２全基因,并在大肠杆菌中进行表达。方法：采用ＰＣＲ扩增恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ＭＳＰ２基因,克隆插入ｐＵＣ１９,并重组人表达质粒载体中,转化大肠杆菌,诱导重组质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ／ｍｓｐ２表达ＭＳＰ２蛋白抗原,对表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｗｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增出８２４ｂｐＤＮＡ片段,经酶切鉴定和部分序列测定证实为Ｍ     

一种恶性疟原虫保护性抗原重组复合基因表达产物的细胞免疫…

检测一种恶性疟原虫保护性原重组复合基因表达产物诱导小鼠细胞免疫的反应，方法：免疫小鼠的巴细胞，体外分别经ＣｏｎＡ，ＨＲＡ和可溶性裂殖子抗原的刺激。＾３Ｈ－ＴｄＲ参入法检测淋巴细胞的增殖水平。结论：ＨＲＡ上的Ｔ细胞位点发挥了效应。具肝一这一的突破ＭＨＣ限制的能力。     

两种恶性疟原虫复合抗原免疫血清对疟原虫体外抑制作用的比较

为了比较恶性疟原虫复合抗原HBsAg/45肽和β-半乳糖苷酶/45肽的免疫效果,我们将这两种含45肽抗原的融合蛋白免疫家兔后进行体外抑制试验。结果表明颗粒状的HBsAg/45肽免疫血清对原虫的抑制作用明显大于线状的β-半乳糖苷酶/45肽免疫血清。提示:恶性疟原虫杂合45肽连于HBsAg颗粒上有助于提高其免疫保护作用。     

双诱导模式原核表达系统的建立与应用

将ｙＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ片段克隆于Ｔ７噬菌体ＲＮＡ聚合酶启动子系统的表达载体ｐＪＧＷ１中，并与可热诱导Ｔ７ＲＮＡ聚合酶产生的质粒ｐＧＰ１－２共同转化大肠杆菌ＤＨ５α，经化学诱导或温度诱导，ｈＧ－ＣＳＦ重组蛋白表达率〉３０％，并具有特异的生物活性。