HSP70反义寡脱氧核苷酸促进MRC-5细胞衰老的研究

目的 采用反义寡核苷酸技术了解HSP70与细胞衰老之间的关系.方法 设正义组、反义组,在转染后12,24 h,3,5 d,分别用流式细胞技术和免疫荧光技术检测HSP70蛋白水平、凋亡细胞比例和细胞周期.在转染后第2、4、6天,分别收集正义组、反义组和空白对照组细胞爬片进行SA-β-Gal染色.结果 各时间点反义组蛋白表达均低于正义组（P＜0.05）,凋亡细胞比例均高于正义组（P＜0.05）.随观察期延长,处于G1期的细胞数逐渐增多,但反义组均高于正义组（P＜0.05）.相同时间点反义组SA-β-Gal染色阳性细胞（蓝染细胞）数均较正义组和空白对照组多,随观察期延长,各组蓝染细胞均增多.结论 HSP70反义寡脱氧核苷酸下调MRC-5细胞HSP70的表达,使细胞出现G1期阻滞,促进细胞衰老.     

人端粒酶反义寡脱氧核苷酸对胃癌细胞系SGC-7901的生长抑制和诱导凋亡的研究

背景端粒酶活性在胃癌组织中表达率很高,在正常胃黏膜组织中则基本不表达.因此,以端粒酶为靶点的反义治疗有望成为胃癌治疗的有效途径之一.目的检测特定的人端粒酶反义寡脱氧核苷酸(AS-ODN)对胃癌细胞系SGC-7901生长的抑制作用,并证明其主要机制为抑制端粒酶活性和诱导细胞凋亡.方法用改良的聚合酶链反应(PCR)-端粒重复扩增协议(TRAP)法定量检测端粒酶AS-ODN作用前后SGC-7901细胞的端粒酶活性;台盼蓝染色法观察SGC-7901细胞活力;光镜和电镜观察凋亡细胞形态,流式细胞仪检测细胞凋亡.结果SGC-7901细胞有端粒酶活性表达.不同浓度的端粒酶AS-ODN作用于SGC-7901细胞48～96 h后,细胞端粒酶活性和生长受到明显抑制,光镜、电镜观察和流式细胞仪检测均证实有细胞凋亡存在.错义AS-ODN(N-ODN)处理组SGC-7901细胞则无显著变化(P＜0.05).结论端粒酶AS-ODN通过抑制胃癌细胞的端粒酶活性和诱导细胞凋亡,最终抑制胃癌细胞生长,其抑制作用呈剂量、时间依赖性和序列特异性.端粒酶AS-ODN对端粒酶活性的抑制比对细胞生长的抑制更敏感,两种抑制作用并不完全平行.     

类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡研究进展

类风湿关节炎（rheumatiod arthritis,RA）成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes,FLS）是关节滑膜细胞中主要的一种,可以释放多种细胞因子,并可因环境变化发生演变,存在异常凋亡与增殖.RA FLS凋亡不足与RA的发病有关.本文就RA FLS凋亡信号传导途径以及凋亡调控作一综述.     

生存素反义寡脱氧核苷酸对人胃癌细胞株凋亡的影响

背景：生存素（survivin）是凋亡抑制蛋白（IAP）基因家族成员之一，在多数肿瘤组织中高表达。目的：观察生存素反义寡脱氧核苷酸（ASODN）对人胃癌细胞株凋亡的影响。方法：将体外培养的人胃癌细胞株SGC-7901分为不同浓度生存素ASODN组、无关寡脱氧核苷酸（N-ODN）组和对照组。以四甲基偶氮唑蓝（MTT）试验检测生存素ASODN对SGC-7901细胞生长的影响；通过形态学观察、DNA电泳和流式细胞仪分析反映细胞凋亡情况；以端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附测定（TRAP-ELISA）方法检测端粒酶活性。结果：生存素ASODN能抑制SGC-7901细胞生长，诱导细胞凋亡，抑制端粒酶活性。凋亡细胞形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成；DNA电泳呈现凋亡特征性阶梯状条带；流式细胞仪分析显示G1期前出现亚二倍体凋亡峰。结论：生存素ASODN能诱导人胃癌细胞株SGC-7901凋亡，抑制细胞生长及其端粒酶活性。     

三氧化二砷诱导类风湿关节炎滑膜细胞凋亡的作用及机制

目的研究三氧化二砷(ATO)对人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(HFLS-RA)凋亡的作用及机制。方法将HFLS-RA分为单纯培养基空白对照组和0．5、2、8μ,mol/L ATO实验组．分别观察ATO作用72 h电镜下细胞的病理改变以及TUNEL法检测细胞的凋亡；四唑盐(MTT)法检测ATO对HFLS-RA生长的影响；反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测ATO作用24 h对核转录因子(NF)-κB的mRNA表达影响。结果电镜下,ATO可以诱导HFLS-RA的凋亡,TUNEL法检测ATO组凋亡指数呈剂量依赖性增加,与对照组相比,2、8μ,mol/L ATO组凋亡指数明显增加(P＜0．05)；ATO呈现时间和剂量依赖性抑制HFLS-RA生长的作用；RT-PCR法表明ATO组NF-κB的mRNA表达剂量依赖性减少,2μmol/L以上ATO可以明显下调NF-KB的mRNA表达(P＜0．05),结论ATO可以抑制HFLS-RA的生长,并且可能通过抑制NF-KB的mRNA表达促进HFLS-RA的凋亡。     

甲氨蝶呤对类风湿关节炎滑膜细胞增生及细胞周期的影响

目的研究甲氨蝶呤(MTX)对类风湿关节炎(RA)滑膜细胞增生及细胞周期的影响,揭示MTX治疗RA的机制。方法应用四唑氮化合物(MTS)/黄嘌呤氧化酶(PMS)比色法和流式细胞术分别测定MTX处理和未处理RA患者滑膜细胞的细胞增生水平和细胞周期。结果加入不同浓度MTX(0.2~2滋mol/L),RA患者滑膜细胞接种后第4天起增生水平均显著低于未处理的RA患者滑膜细胞(P<0.05);细胞周期分析显示加入不同浓度MTX(0.2~2滋mol/L)后第5、8天,RA患者滑膜细胞停留在G1期的比例要比未处理的RA患者滑膜细胞明显增加(P<0.05),而S、G2期的细胞比例比未处理的RA患者滑膜细胞则明显减少(P<0.05);MTX能以剂量依赖性明显抑制滑膜细胞的增生水平。结论MTX在治疗RA时,主要起到对RA患者滑膜细胞的增生及增生相关病理过程的抑制。     

三氧化二砷对类风湿关节炎滑膜细胞凋亡影响的体外研究

目的 探讨类风湿关节炎(RA)患者滑膜细胞的凋亡异常,以及三氧化二砷(As_2O_3)对体外培养RA的滑膜细胞凋亡的诱导作用.方法 用光镜、电镜、流式细胞仪检测As_2O_3对体外培养的RA滑膜细胞凋亡的诱导作用,As_2O_3,作用于RA滑膜后酶联免疫吸附试验(ELISA)检测凋亡过程中细胞色素C的变化,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Caspase-3.Bel-2 mRNA表达,采用单因素方差分析和LSD-t检验、Dunnet-t检验进行统计学处理.结果 流式细胞仪检测发现不同浓度的As_2O_3作用后,滑膜细胞的凋亡较空白对照组(NC)增加[NC(0.95±0.87)%,RA(0.21±0.12)%,P<0.05],呈一定的剂量依赖性,尤其以80 μmol/L药物浓度最为明显.凋亡早期(6 h)细胞色素C水平升高80 μmol/L组升高明显[NC(0.34±0.27),80 μmol/L组(32.04±1.62),P<0.05];不同浓度的As_2O_3作用后细胞中Caspase-3 mRNA表达显著增强[NC(0.144±0.022),RA(0.323±0.047),(0.824±0.109),(1.213±0.196),P<0.05],Bcl-2的mRNA表达显著减弱[NC(1.08±0.23),RA(0.94±0.15),(0.46±0.08),(0.22±0.06),P<0.05].结论 RA患者滑膜细胞凋亡较健康埘照减少,As_2O_3通过升高细胞色素c及Caspase-3,抑制Bcl-2诱导RA滑膜细胞凋亡.     

类风湿关节炎滑膜中促凋亡基因PDCD5的表达

目的 探讨类风湿关节炎(RA)发病机制中促凋亡基因PDCD5的表达与作用.方法 采用实时定量聚合酶链反应(PCR)和Western blot方法来检测RA滑膜组织中PDCD5在mRNA和蛋白水平的表达,免疫组织化学检测PDCD5在滑膜内的表达特征,用骨关节炎(OA)患者滑膜标本作对照.结果 RA滑膜组织中PDCD5 mRNA的表达为1.3±0.9,与OA滑膜组织(4.3±2.7)相比低了约4倍(P＜0.05),二者之间的差异有统计学意义.Western blot检测结果表明与OA滑膜组织相比较,RA滑膜组织中PD-CD5蛋白水平的表达较低.免疫组织化学染色显示在RA滑膜组织与OA滑膜组织之间PDCD5蛋白有不同的表达特征,RA滑膜组织阳性染色强度明显弱于OA滑膜组织,其增生滑膜表现为分散的PDCD5阳性染色,主要集中在衬下层而不是衬里层,衬下层主要分布为成纤维样滑膜细胞,而在OA滑膜中PDCD5阳性染色主要集中在衬里层,衬下层PDCD5表达的细胞较少.结论 在RA滑膜细胞凋亡过程中PDCD5表现为下调,至少部分地减少了RA滑膜组织凋亡.     

预防血管成形术后再狭窄的C-sis反义寡脱氧核苷酸在血清中的稳定性

目的 探讨自行设计合成的C-sis癌基因反义寡脱氧核苷酸(AODN)和C-sis癌基因反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(PS-AODN)血清稳定性。方法 用小牛血清模拟体内条件于不同时相点进行稳定性试验,用高效液相色谱法测定血清中AODN和FS-ODN。结果 AODN在血清中1小时内降解43.3％,1天降解53.1％。PS-ODN 1 h降解23.7％,第6天降解59.6％。PS-AODN血清中的稳定性明显高于AODN。结论 PS-AODN在血清中有较好的稳定性,提示其具有潜在的临床应用价值。     

C-sis反义寡脱氧核苷酸抑制兔主动脉平滑肌细胞增殖的时效关系

为观察局部处理C-sis反义寡脱氧核苷酸对平滑肌细胞增殖及新生内膜肥厚的抑制作用、球囊导管损伤60只新西兰白兔胸主动脉后。经导管局部处理每只兔1mg（2mL）C-sis反义或正义寡脱氧核苷酸或2mL生理盐水,于损伤后第3、7、14天和第28天，用免疫组织化学方法结合图象分析，评价损伤动脉内膜平滑肌细胞增殖及新生内膜改变。结果发现．C-sis反义寡脱氧核苷酸明显抑制内膜平滑肌细胞增殖，最高抑制作用出现于损伤后第3天；抑制百分率达69．8％，第7、14天和第28天的抑制率依次降低，分别为59％、51.9％和47.8％；而新生内膜面积的抑制百分率分别是48．9％、77．8％、72．6％和70．8％，与生理盐水处理组相比，平滑肌细胞数及新生内膜面积均有明显降低。研究结果表明，局部处理C-sis反义寡脱氧核苷酸，通过反义途径，可明显抑制球囊损伤主动脉内膜平滑肌细胞增殖，其抑制作用随时间而降低，同时，对新生内膜面积肥厚的最大抑制出现于第7天，随后降低，提示局部处理C-sis反义寡脱氧核苷醚，有可能降低再狭窄的发生。     

Inhibition of synoviocytes proliferation by two types of c‐myc antisense oligodeoxynucleotides

Aim: The c‐myc proto‐oncogene is over‐expressed in synoviocytes from patients with rheumatoid arthritis (RA). For improving the inhibition of c‐myc antisense oligodeoxynucleotides (AS ODN) on RA synoviocytes proliferation, we used two antisense sequences: one (antimyc‐AUG AS ODN) targeting the initiation codon (AUG) and the next four codons on c‐myc mRNA; another (antimyc‐CRD AS ODN) targeting the coding region determinant (CRD) on c‐myc mRNA to investigate if there was a difference on inhibiting synoviocytes proliferation. Methods: Cultured human synoviocytes from patients with RA. The sequences were modified by phosphorothioates. Lipofectin was used as carrier. MTT assay was used to examine the inhibition of cell proliferation. Results: Antimyc‐AUG AS ODN and antimyc‐CRD AS ODN both can inhibit synoviocytes proliferation dose‐dependently. The maximum decrement of cell number was 40% at 2.5 µM and 48 h, 41.4% at 5 µM and 48 h, respectively. The action time of antimyc‐AUG AS ODN inhibiting synoviocytes proliferation was earlier than that of antimyc‐CRD AS ODN. ODN at high levels had non‐sequence‐specific cytotoxicity. Conclusions: Both c‐myc AS ODN are useful in inhibiting synoviocytes proliferation.     

类风湿关节炎滑膜细胞向破骨细胞分化实验研究

目的观察类风湿关节炎(RA)滑膜组织中破骨细胞来源以及核因子κB受体活化子配体(RANKL)在诱导破骨细胞分化过程中的作用。方法取6例RA和6名正常关节的滑膜组织,用胶原酶消化法获得滑膜细胞,通过免疫磁珠法分选获得CD68+/-滑膜细胞。用外源性RANKL16μg/L、巨细胞集落刺激因子(M-CSF)25μg/L及地塞米松醋酸酯1×10-8mol/L诱导各组滑膜细胞分化。通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、降钙素受体(CTR)免疫荧光检测、骨吸收陷窝形成方法鉴定破骨细胞。并在RA滑膜CD68+细胞中加入0~8ng/ml梯度浓度的RANKL,观察不同浓度RANKL对RA滑膜CD68+细胞分化的影响。结果RA滑膜CD68+细胞在RANKL诱导14d后,RA滑膜CD68+细胞组出现CTR阳性、TRAP染色阳性细胞并有骨吸收陷窝形成。RA滑膜CD68+细胞在体外经RANKL诱导后分化形成的破骨细胞功能与RANKL剂量有关。结论RA滑膜组织中前体破骨细胞来源于滑膜CD68+细胞,在体外RANKL诱导下可以分化为成熟破骨细胞。RANKL体外诱导剂量影响RA滑膜CD68+细胞分化功能。     

FasL基因转染诱导类风湿关节炎患者滑膜细胞凋亡的实验研究

目的通过构建FasL重组质粒并转染原代培养的类风湿关节炎(RA)患者滑膜细胞,研究FasL基因对体外培养的RA滑膜细胞的凋亡诱导作用,寻找针对RA关节腔内基因治疗的有效靶基因.方法采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增FasL cDNA全长片段,经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,将FasL基因导入真核表达载体pcDNA3.1-neo;体外原代培养RA患者及正常人的滑膜细胞:脂质体包裹真核表达质粒pcDNA3.1-FasL及空质粒pcDNA3.1-neo,分别转染处于指数生长期的RA患者及正常人的滑膜细胞;经G418筛选,采用形态学、TUNEL法及Annexin Ⅴ/碘化丙啶(PI)染色等方法检测各组滑膜细胞的凋亡情况.结果FasL基因原核及真核重组质粒载体顺利构建,基因序列检测结果与国外报道完全一致;RA患者及正常人的滑膜细胞原代培养、传代顺利完成;RA患者滑膜细胞转染FasL重组质粒(rhFasL)15 h后,光镜下可见大量细胞体积缩小、扭曲、变形,胞核中出现颗粒样物质,少数细胞脱落底壁,G418筛选2周后仅有1～2个/低倍视野细胞存活,且生长相对静止;RA患者滑膜细胞在转染空质粒及正常人滑膜细胞在转染pcDNA3.1-FasL及空质粒后仅有少数细胞变形、反光度下降,很少脱离底壁,G41 8筛选2～4周后细胞再次生长并形成克隆;经TUNEL方法检测可见大量转染rhFasL的RA滑膜细胞的细胞核呈棕黄或棕褐色,胞核浓缩,呈环行、小圆形或颗粒状,而其他3组对照组滑膜细胞的细胞核呈蓝色或浅黄色,未见明显凋亡标记阳性细胞;基因转染后的各组滑膜细胞予Annexin Ⅴ/PI染色、流式细胞仪检测后均查到少量早期的凋亡细胞,但各组间差异无统计学意义.结论pcDNA3.1-FasL基因可诱导体外培养的RA滑膜细胞间的凋亡增加.     

反义寡核苷酸抗乙型肝炎病毒表达诱导凋亡的体外研究

目的：研究反义脱氧寡核苷酸（ASON）抗乙型肝炎病毒（HBV）复制表达的作用。方法：设计合成针对HBV PreS2的ASON并设非互补序列作对照,以人肝癌细胞系2.2.15细胞为细胞模型,应用ELISA观察了ASON对HBV基因表达的抑制作用,流式细胞仪观察了ASON对宿主细胞凋亡和增殖的影响。应用RIA法和MTT法观察ASON对细胞代谢的影响。结果：ASON可有效地抑制HBV基因的表达,对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为66%和91%,而非互补序列对照无抑制作用：ASON可诱导宿主细胞凋亡,用药后第3天和第6天凋亡率分别为6.10%和6.43%,增殖指数分别为37%和36%,RIA和MTT法表明ASON对宿主细胞无细胞毒性作用。结论：ASON不仅以序列特异性方式发挥抗病毒作用,而且可能以凋亡的方式清除HBV。     

雷公藤甲素诱导胶原诱导的关节炎大鼠滑膜细胞凋亡的初步观察

目的 以胶原诱导的关节炎(CIA)为动物模型,探讨雷公藤甲素(triptolide)能否诱导CIA大鼠滑膜细胞凋亡。方法 选用雄性Wistar大鼠造模,将造模成功的大鼠随机分为模型组和雷公藤组。雷公藤甲素按4滋g/100g体重,肌肉注射给药,每3d1次。凋亡检测:给药31d后处死,取膝关节滑膜。作苏木素-伊红染色(HE)、电镜、缺口末端标记法(TUNEL)标记及流式细胞仪检测。结果 电镜下可见早期阶段的滑膜凋亡细胞。流式细胞仪检测结果显示正常组、模型组、雷公藤组的凋亡细胞分别为(0.87±0.24)%、(1.83±0.82)%和(3.98±1.16)%。正常组、模型组、雷公藤组的S期细胞分别为(3.4±0.7)%、(8.0±1.4)%和(3.3±1.2)%。雷公藤组与模型组比较差异均具有显著性(P<0.01)。TUNEL标记结果显示正常组、模型组、雷公藤组的凋亡细胞分别为(1.0±0.4)%、(2.2±1.0)%和(4.5±0.9)%。雷公藤组与模型组比较差异具有显著性(P<0.01)。结论 本次实验首次阐明雷公藤甲素可诱导CIA大鼠滑膜细胞的凋亡。     

IL-1β和TNF-α诱导RA成纤维样滑膜细胞ICAM-1和VCAM-1表达调控的机制研究

目的探讨酪氨酸激酶在白细胞介素(IL)-1β和肿瘤坏死因子(TNF)-α诱导类风湿关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞(FLS)细胞间黏附分子(ICAM-1)和血管细胞黏附分子(VCAM-1)表达中的作用。方法原代培养RA成纤维样滑膜细胞，用Western blot方法检测IL-1β和TNF-α短时间内引起RA FLS蛋白质酪氨酸磷酸化状态改变，并应用genistein，蛋白质酪氨酸激酶(PTK)抑制剂观察对ICAM-1和VCAM-1表达影响。结果IL-1β和TNF—α可以瞬时引起RA FLS蛋白质酪氨酸磷酸化程度增加：IL-1β和TNF-α在1—100U／ml之间呈浓度依赖性促进ICAM-1和VCAM-1的表达；genistein显著抑制两种炎性因子刺激下的VCAM-1表达，而对。ICAM-1的表达仅起中度抑制作用。结论IL-1β和TNF-α在RAFLS信号转导中，可以瞬时导致蛋白质酪氨酸磷酸化程度增加．在炎性因子诱导ICAM-1和VCAM-1的表达调控中蛋白酪氨酸激酶作用不同。     

类风湿关节炎滑膜巨噬细胞来源的研究

目的　了解类风湿关节炎 (RA)滑膜巨噬细胞的来源。方法　采用免疫组化LSAB法对 2 6例RA滑膜 ,2 0例非RA滑膜及 7例正常滑膜进行连续切片CD6 8和PCNA染色。结果　正常滑膜衬里层细胞几乎全部CD6 8阳性而PCNA阴性 ,衬里下层CD6 8和PCNA阳性细胞极少 ;RA滑膜衬里层和衬里下层PCNA阳性细胞数较非RA滑膜明显增多 (P <0 0 5 ) ,衬里层滑膜细胞大部分CD6 8阳性 ,衬里下层CD6 8阳性细胞数较非RA滑膜明显增多 (P <0 0 5 ) ,并且衬里层和衬里下层部分CD6 8阳性的细胞PCNA也阳性。结论　RA滑膜增多的A型巨噬样滑膜细胞和衬里下层的巨噬细胞都有局部增生 ,表明RA滑膜衬里下层聚集的巨噬细胞除来源于血液中的单核细胞趋化转移外 ,还与巨噬细胞在炎症局部增生有关。     

趋化素样因子1在类风湿关节炎滑膜中的表达研究

目的研究趋化素样因子1(CKLF1)在类风湿关节炎(RA)滑膜中的表达,探讨CKLF1在RA发病过程中的可能的病理作用。方法取35例RA,20例骨关节炎(OA)及20例半月板损伤患者手术切除的膝关节滑膜标本。采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测CKLF1在上述3种病变滑膜中的mRNA水平表达水平。采用免疫组织化学方法检测CKLF1在滑膜组织中的蛋白水平表达特征。结果RA滑膜组织中CKLF1在mRNA水平的表达(0．41±0．17)明显高于OA(0．07±0．06)和半月板损伤患者(0．16±0．10)(P<0．05)。免疫组织化学结果显示,OA病例中仅有2例显示少量滑膜衬里层细胞着色,半月板损伤病例仅有5例显示少量滑膜衬里层细胞着色。在RA滑膜中20例染色强阳性,10例染色阳性,5例染色阴性。阳性染色颗粒位于细胞胞质内,阳性细胞定位在滑膜衬里层的成纤维细胞、滑膜下层大量的浆细胞以及增生的血管上皮细胞。结论CKLF1基因在RA滑膜中有高水平的表达特征,为进一步深入研究RA的发病机制提供新的研究思路。