抗登革Ⅱ型病毒单克隆抗体杂交瘤细胞的建立及应用

登革热是东南亚地区由虫媒病毒引起的重要传染病之一。我国在1985年～1987年间曾连续发生登革热Ⅱ型病毒的暴发流行。由于登革病毒具有型间和组间的共同抗原,所以用一般的动物免疫血清或免疫腹水抗体鉴定分型时,有相当的交叉反应。为了提高登革热病毒型诊断的特异性,克服型间交叉反应,我们于1987年开展了登革热Ⅱ型病毒单克隆抗体的研究。并建立了对登革     

抗登革Ⅱ型病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立与鉴定

采用登革Ⅱ型病毒免疫BALB/C小鼠,取脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞,在40％PEG1000的作用下进行融合,获得6株分泌抗登革Ⅱ型病毒单克隆抗体的杂交瘤,用间接免疫荧光法鉴定其单克隆抗体(McAb)对登革Ⅱ型病毒均有特异性。HIA和CF试验有5株McAb为CF型特异的。5株具有HIA抑制活性。     

登革Ⅱ型病毒基因组RNA的制备及其生物学活性的测定

登革热是发病最多,分布最广的虫媒病毒病,已遍及世界热带、亚热带60多个国家和地区。据估计,世界上平均每年受其感染不少于1亿例,已成为人们普遍关注的一个公共卫生问题。我国自从1978年发生登革热流行之后,十几年来相继发生了4个型别登革热流行,波及海南、广     

登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重复序列具有干扰病毒复制的作用

目的构建含有登革Ⅱ型病毒（DENV-2）前膜蛋白（prM）基因反向重复序列（irRNA）的重组质粒,评价其抑制病毒复制的
效果。方法DENV-2接种乳鼠,提取总RNA,在正义和反义引物两端分别加上XhoⅠ和EcoRⅠ的识别位点,将经RT-PCR 扩增
的prM全长基因片段插入pcDNA3.1(+)中,形成含有prM反向序列的重组质粒pcDNA-asprM;于另一对正义和反义引物两端引
入酶切位点NheⅠ和BglⅡ,经RT-PCR 扩增prM 全长基因片段插入pMD18-T-vector 中,形成含有正向序列的重组质粒
pMD18-T-prM。限制性内切酶NheⅠ和KpnⅠ分别酶切重组质粒pMD18-T-prM和重组质粒pcDNA-asprM,得到片段prM和线
性化载体pcDNA-asprM,连接构建成含有prM反向重复序列的重组质粒pcDNA-irRNA。筛选的阳性重组质粒pcDNA-irRNA
用脂质体法转染至BHK-21细胞中,半定量PCR和实时荧光定量PCR分析评估该质粒抑制登革病毒复制的效果。结果成功构
建具有prM反向重复序列的重组质粒pcDNA-irRNA。经转染pcDNA-irRNA的实验组与未转染质粒阳性对照组相比,半定量
PCR结果显示DENV-2攻击96 h后NS3的mRNA表达水平下降28%;实时定量PCR分析显示,DENV-2攻击72 h后实验组病毒
拷贝数比阳性对照组少1.44倍,攻击96 h后实验组的NS1表达量明显低于阳性对照组（P<0.05）。结论DENV-2 prM反向重复
序列具有干扰病毒复制的效果,为登革病毒基因疫苗的研究提供理论依据。
     

登革2型病毒E蛋白的生物信息学研究

目的 探讨登革病毒包膜糖蛋白E的结构与功能,为阐明登革病毒感染的分子机制提供科学数据.方法 综合利用生物信息学软件(Protean和TMHMM)、数据库(Prosite和PDB)和网络服务器(http://www.expasy.org;http://www.cbs.dtu.dk;http://immune-epitope.org)对E蛋白各级结构及亲水性等多项参数进行分析.结果 E蛋白的氨基酸分布情况,二级结构中形成螺旋、折叠、转角、卷曲的氨基酸区段以及包膜糖蛋白E的跨膜区段均得以展示;同时用于预测B细胞表位的柔韧性、表面可及性和亲水性参数得到综合阐释,另外E蛋白的3个结构域和空间结构也在相关数据库中获得.结论 生物信息学预测和分析结果可为研究在登革病毒致病及机体免疫应答中E蛋白的结构与功能的关系提供丰富资料.     

登革Ⅱ型病毒（D2V）空斑的快速滴定法

病毒空斑滴定法,是了解病毒含量的一种重要方法。过去的传统滴定法费时,耽误结果观察。目前,一些实验室致力于快速法而加以改进。益继鸿等报道,采用HeIa等细胞株对脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型等病毒进行了速成空斑测定,认为结果满意。登革Ⅲ型病毒(D_2V)空斑的滴定,通常亦需于24小时前预先制备C_6/36白纹伊蚊细胞板,误时较     

西双版纳州2016年登革1型和2型病毒疫情的流行病学调查

目的 了解云南省西双版纳州2016年登革热流行特征和登革病毒血清型、基因型及其传播来源.方法 收集登革热病例资料,采集患者急性期血清标本,用RT-PCR法检测登革病毒核酸,并进行登革病毒C/PrM区核苷酸序列测定和进化分析.结果 2016年西双版纳州共确诊登革热病例53例,其中本地感染病例24例(勐腊县21例和景洪市3例),输入性病例29例(来自缅甸24例和老挝5例).流行月份为7-11月.病例年龄以20～49岁组为主,男女性别比为1.9∶1.蚊媒监测景洪5-10月布雷图指数(Breteau index,BI)为8.4～21,勐腊6-10月BI为7.6～18.2,勐海县9-10月BI为8.4～8.8,其它月份BI均小于5.从患者血清中获得13株登革病毒的C/PrM区基因核苷酸序列,进化分析表明,10株为登革病毒血清型1型(DENV-1)中的基因Ⅰ型(Genotype-Ⅰ,G-Ⅰ),3株为登革病毒血清型2型(DENV-2)的亚洲基因Ⅰ型(Asian genotypeⅠ,AG-Ⅰ),均为东南亚地区的优势基因型.无论DENV-1或DENV-2均与近几年云南省瑞丽市、临沧市和东南亚地区的同型流行株具有较近的亲缘关系.结论 西双版纳州2016年发生了包括本地和输入性病例并存的DENV-1 G-Ⅰ和DENV-2 AG-Ⅰ流行,并证实相邻的缅甸和老挝边境地区存在这两种血清型登革病毒流行,来自缅甸和老挝的输入性病例是引起西双版纳本地流行的主要原因.此为西双版纳首次发生DENV-1和DENV-2 AG-Ⅰ的本地流行.     

海南岛登革热和登革出血热控制工作分析报告

1980年海南岛首次发生登革热流行,波及全区18个市县208个公社、农场,其中13个市县造成流行。患者437468例,发病率8096.75/10万,死亡64例,病死率1.46/万。从患者急性期血液标本和埃及伊蚊中分离得Ⅲ型登革病毒。时隔5年,于1986年又在全岛爆发登革热第二次流行,波及18个市县     

深圳市登革1型病毒株全基因组特征及系统进化分析

目的对深圳市2014年登革病毒1型(DENV-1)流行株进行全基因序列测定,分析其分子病毒学特征,探讨其可能来源。方法采集2例登革热患者急性期血清标本,用BHK-21细胞培养分离病毒,RT-PCR进行病毒血清型别鉴定,并用RT-PCR进一步扩增全基因组序列,测序后进行同源性比较、系统进化树分析和遗传变异分析。结果 2例深圳DENV-1分离株进行全基因组测序结果显示同源性为100.0%,其基因组全长均为10 735 bp,编码3 329个氨基酸,与新加坡DENV-1流行株核苷酸和氨基酸同源性最高,分别为99.3%和99.7%。全基因组序列系统进化分析显示,深圳DENV-1株为基因Ⅰ型,与Fujian2004、Zhuhai2007和Singpore2008的亲缘关系较近,均在同一进化分支上。与广州DENV-1株GZ/80相比,深圳2014年DENV-1分离株发生了碱基变异430个,氨基酸变异42个,5’UTR存在1处点突变,3’UTR序列共有8处位点发生变异。结论 2014年深圳市DENV-1株可能来源于东南亚一带。病毒在进化过程中出现一些位点变异,这些变异的生物学意义有待进一步研究。     

白纹伊蚊C6/36细胞登革Ⅱ型病毒结合分子的筛选

摘要：目的筛选白纹伊蚊C6/36细胞表达连接登革Ⅱ型病毒分子。方法提取C6/36细胞的总蛋白和膜蛋白,收集和纯化登革
Ⅱ型病毒,用12%SDS-PAGE分析C6/36细胞的总蛋白和膜蛋白,转于硝纤膜上,用病毒覆盖蛋白结合实验（VOPBA）筛选C6/36
细胞表达连接登革Ⅱ型病毒分子。结果C6/36细胞的总蛋白和膜蛋白经12% SDS-PAGE分离后转膜,分别与纯化的病毒液和
阴性对照液孵育,用抗登革病毒Ⅰ~Ⅳ单克隆抗体检测,结果显示病毒孵育组在67 000和30 000的位置有特异性的条带出现,而
阴性对照组无此条带。结论用VOPBA法初步从白纹伊蚊C6/36细胞中筛选67 000和30 000等登革Ⅱ型病毒结合分子,其功
能的鉴定正在进行。
     

登革热和登革出血热的流行病学研究现状

本文报道了登革热和登革出血热的研究简史、病原学、流行病学和防制,给登革热和登革出血热的预防控制提供了参考依据。     

亚洲地区登革1型病毒基因型及蛋白多样性分析

目的了解我国及周边亚洲地区登革1型病毒株(DENV-1)的基因型及蛋白多样性特征,为今后登革1型病毒的流行监测和防控提供理论基础。方法从NCBI Virus Variation登革病毒数据库筛选出亚洲登革病毒1型全基因组序列共85条,利用生物信息学软件MEGA 7构建系统发生树,应用重组检测软件RDP 4.0检测可能存在的重组事件,计算同源计分比值(BSR)进行蛋白多样性分析。结果进化树显示亚洲地区登革1型病毒分为6种基因型(Ⅰ-Ⅵ),其中Ⅰ型为优势流行基因型,Ⅵ型为新出现的基因型。同时,共发现26个重组事件,主要以基因型间的重组为主。各蛋白BSR均为0.95以上,NS2B蛋白同源计分比值最高(0.99)。结论亚洲地区登革1型病毒存在多种基因型共同流行,进化较为保守;NS2B蛋白的高度保守性,可成为抗登革病毒药物研发的理想靶点。     

登革2型病毒特异性抗原片段的筛选及验证

目的筛选、鉴定登革2型病毒特异性抗原,为进一步研究其生物学功能奠定基础,并利用纯化抗原建立检测登革2型病毒
抗体的ELISA方法。方法分别利用DNAStar及ANTHEPROT软件对登革病毒1-4型、流行性乙型脑炎及黄热病毒M、E蛋白
进行分析,分析登革2型病毒型特异性抗原表位,并参考GenBank中的序列信息进行比对,分析其在不同登革2型病毒株中的保
守性。然后选择预测得分值较高的表位,利用pET32a原核表达系统进行原核表达,Western blotting验证其免疫学反应特异性,
特异性片段经亲和层析纯化后,包被ELISA微孔板,并对ELISA反应条件进行系统优化。结果经系统的生物信息学分析,初步
预测获得登革2型病毒特异性抗原表位8个,并对其中得分值较高的6段进行了高效表达,经Western blotting分析,获得登革2
型病毒特异性抗原片段1段。经纯化后作为检测用抗原,建立了检测登革2型病毒抗体的ELISA方法。初步应用表明,所建立
方法具备良好的特异性,可检测1~200倍稀释的患者血清,S/N比值均在10以上。结论获得登革2型病毒特异性抗原片段1段,
并建立检测登革2型病毒抗体的ELISA方法。
     

广东登革3型病毒株的分离培养和鉴定

目的 对2009年发生于广东地区的3例家庭聚集性登革热患者血清进行登革病毒的鉴定和病毒株的培养分离.方法 用胶体金法检测患者血清中登革病毒特异性IgM、IgG抗体;C6/36细胞培养患者血清中登革病毒;RT-PCR扩增C-PrM基因序列的片段以检测患者血清中登革病毒RNA,PCR产物经序列测定后进行生物信息学分析.结果 3例患者血清学检测均为登革病毒特异性IgM阳性、IgG阴性;特异性RT-PCR产物长约290bp,经琼脂糖电泳和测序分析,证实3例患者血清中均存在登革3型病毒;从1例患者血清中培养分离到了登革病毒株,经RT-PCR和测序证实为登革3型病毒.结论 2009年发生于广东地区的3例登革热患者经病毒培养和分子生物学鉴定,证实均为登革3型病毒感染.     

登革2型病毒重组E蛋白的生物学特性分析

【目的】检测重组D2V全长E蛋白纯化后的免疫反应性与抗原性,为其亚单位疫苗研制奠定基础。【方法】酵母表达上清超滤浓缩后用金属螫合亲和层析(MCAC)法过柱,用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术观察蛋白条带。将纯化蛋白与组氨酸抗体、D2V E单抗进行斑点印迹和蛋白印迹,以确定纯化物是否为合组氨酸尾的D2V E融合蛋白,并用ELISA检测纯化E蛋白与不同DV抗体的结合反应。用纯化的重组D2V E蛋白免疫小鼠后测定其产生的抗体类型与滴度,以分析其抗原性。【结果】表达产物经MCAC柱纯化获得单一的相对分子质量为69×10~3的蛋白,组氨酸抗体与D2V E单抗的印迹试验证实该条带就是含多聚组氨酸尾型特异的重组E蛋白(rEgp),ELISA显示纯化的rEgp保留有免疫反应性及型特异性,内糖苷酶H消化证实其含有N联高甘露糖残基。接种rEgp可诱生针对D2V抗原与重组E蛋白的高效抗体。【结论】纯化的D2V全长E蛋白保留其免疫原性和免疫反应性,并具有型特异性。     

登革2型病毒粘附人血小板的体外研究初探

目的:了解登革2型病毒(DEN-2)是否能在体外粘附人血小板并制备抗人血小板抗体.方法:密度梯度离心法分离血小板,DEN-2与血小板体外共孵育2 h,间接免疫荧光法分析DEN-2粘附人血小板情况.采用TritonX-100裂解法制备血小板蛋白并经皮下注射免疫BALB/C小鼠获取抗血小板血清,经Western blot、...     

登革Ⅱ型病毒Tr1751株E蛋白基因的克隆与表达载体的构建

目的从登革Ⅱ病毒Tr1751株中克隆表达E蛋白的基因,构建了真核表达质粒,为其后继的关于结构和功能的研究提供了条件。方法合成DEN2(Tr1751株)的E蛋白基因引物,通过RT-PCR的方法扩增含有信号肽E蛋白的基因片段,并与真核载体p IRES-hr GFP-1α连接,得到重组的质粒p IRES-hr GFP-1α-E,再用PCR、双酶切和测序的方法进行鉴定。结果 RT-PCR得到的为1 527bp的E蛋白基因片段,酶切鉴定和测序显示重组的质粒含有DEN2病毒中的E蛋白的基因。用重组质粒测序后与Gen Bank中的已知Tr1751株进行相似性比对,核苷酸序列和推导的氨基酸序列同源性均为99%。结论成功的构建出含有全长DEN2的E蛋白基因的真核质粒,为登革病毒核酸疫苗的研究奠定了基础。     

C6/36细胞感染登革Ⅱ型病毒前后差异表达蛋白的初步鉴定

目的 了解C6/36细胞感染登革病毒前后相关表达蛋白的变化情况。方法 分别提取C6/36细胞和登革Ⅱ型病毒感染后的C6/36细胞的可溶性蛋白质,SDS-PAGE凝胶电泳对比分析C6/36细胞感染登革病毒前后电泳图谱的差异;分别以正常C6/36细胞总蛋白质、C6/36细胞感染登革病毒后的SDS-PAGE凝胶图谱中的差异条带蛋白免疫Balb/c小鼠的免疫血清、Santa-Cruz公司登革病毒单抗作一抗,Western-blot鉴定C6/36细胞感染登革病毒前后SDS-PAGE凝胶电泳图中的差异条带。结果 SDS-PAGE凝胶电泳图显示约40 000 Mr和70 000 Mr处,C6/36细胞感染登革病毒后的蛋白条带比正常C6/36细胞的蛋白条带明显粗亮;Western-blot鉴定确认差异条带不是登革病毒在细胞表达的蛋白质,而是C6/36细胞本身表达的蛋白质。感染前后的40 000 Mr和70 000 Mr蛋白条带同源。结论 C6/36细胞感染登革病毒前后分子量为40 000 Mr和70 000 Mr蛋白表达有差异。