Erk信号传导通路调控乙醛刺激的肝星状细胞Ⅰ型胶原分泌的研究

目的　探讨Erk信号传导通路调控乙醛刺激的肝星状细胞Ⅰ型胶原分泌的影响。方法　用链霉蛋白酶和胶原酶原位灌流 ,Metrizamide密度梯度离心分离大鼠肝星状细胞 ,采用PD980 5 9阻断乙醛激活的肝星状细胞Erk活性 ,以ELISA法定量测定细胞上清Ⅰ型胶原。结果　PD980 5 9在 2 0 μmol/L时可影响HSCⅠ型胶原分泌 ,但无统计学意义 (P >0 0 5 ) ,5 0、10 0 μmol/L抑制作用明显 (P <0 0 5或P <0 0 1) ,呈剂量 效应关系。 结论　PD980 5 9对乙醛刺激的HSCⅠ型胶原分泌具有抑制作用 ,提示Erk信号传导通路是调控乙醛刺激的HSCⅠ型胶原分泌重要通道。     

红景天甙对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞中Wnt信号通路的影响及其意义探讨

目的:通过观察经红景天甙、乙醛处理后的大鼠肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)增殖速度的变化以及细胞内Wnt信号通路中主要下游分子及目的基因mRNA表达和蛋白水平的改变,探讨Wnt信号通路在HSCs中的作用,以及红景天甙对大鼠HSCs Wnt通路和细胞增殖的影响.方法:用红景天甙及乙醛处理体外培养传代的大鼠HSCs [1],MTT法绘制细胞生长曲线,采用RT-PCR和Western blot的方法分别观察Wnt信号通路中β-catenin和细胞周期蛋白DI(Cell cycle protein D1,CyclinD1)及相关指标的变化.结果:从各组细胞生长曲线的对比发现:红景天甙处理组细胞的增殖速度相对于单用乙醛组明显降低.单用乙醛刺激的大鼠HSCs中,Ⅰ型胶原(Collagen α1) [2]、β-catenin和CyclinD1的mRNA表达和蛋白合成均明显增强(P＜0.05),红景天组中Cyclin D1和β-catenin的mRNA表达和蛋白合成均出现不同程度的下降(P＜0.05).结论:Wnt信号通路参与了乙醛刺激的大鼠HSCs活化,红景天甙可能是通过降低大鼠HSCs中Wnt信号通路的活性,从而抑制乙醛刺激的大鼠HSCs的增殖.     

高糖对人肝星状细胞的激活作用及机制

目的 探讨高糖是否可以激活人肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）及其机制.方法 实验分为正常对照组（NG组）、高糖组（HG组）和渗透压对照组（OC组）;体外培养的人HSCs高糖处理后,应用western-blot方法检测TGF-β1、α-SMA、I型胶原和MMP-2的蛋白表达量;酶联免疫吸附试验（ELISA）测定TGF-β1的分泌水平.结果 应用30 μmol/L D-葡萄糖处理人HSCs细胞48 h,可以激活HSCs,表现为：α-SMA、I型胶原和MMP-2的蛋白表达增加,TGF-β1的分泌水平升高.结论 高糖可以激活人HSCs,进而促进肝纤维化的发生,此激活过程可能是通过TGF-β1通路.     

瘦素诱导人肝星状细胞活化及其作用机制

目的探讨瘦素通过何种机制诱导人肝星状细胞(HSCs)活化及其机制。方法采用瘦素处理体外培养HSCs细胞的方法,模拟高瘦素血症对肝纤维化影响的研究模型,经过不同时间和不同浓度的瘦素处理后,Western-blot方法检测TGF-β1、SREBP-1c、α-SMA和Ⅰ型胶原的蛋白表达量。结果瘦素可以促进HSCs表达α-SMA、Ⅰ型胶原和TGF-β1的表达,而抑制SREBP-1c的蛋白表达。结论瘦素活化人肝星状细胞参与肝纤维化过程,其中机制可能与激活TGF-β1通路和抑制SREBP-1c表达有关。     

SB203580对大鼠肝星状细胞凋亡及bcl-2蛋白表达影响

目的:通过观察P38MAPK信号传导通路特异抑制剂SB203580对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)凋亡和bcl-2蛋白表达的影响,探讨P38MAPK信号传导通路与bcl-2蛋白在HSCs中的作用,为肝纤维化的治疗提供理论依据.方法:不同浓度SB203580处理乙醛刺激...     

血管紧张素Ⅱ对大鼠HSCs分泌ECM影响机制的研究

目的探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激大鼠肝脏星状细胞(HSCs)分泌细胞外基质(ECM)的可能机制。方法采用胶原酶原位循环灌流法分离大鼠肝星状细胞(HSCs)。①用不同浓度AngⅡ(10-9~10-5mol/L)处理HSCs,酶联免疫吸附法检测各组HSCs层黏蛋白(LN)、透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(PcⅢ)和Ⅳ型胶原(CⅣ)水平。以未经AngⅡ处理的HSCs作为对照组。②选择使ECM分泌显著增加的AngⅡ处理组HSCs,抽提RNA后采用RT-PCR技术测定转化生长因子-β1(TGF-β1)和结缔组织生长因子(CTGF)mRNA表达,并与新鲜分离的大鼠HSCs和对照组HSCs进行比较。结果与对照组比较,AngⅡ各浓度处理组HSCs的LN和HA分泌水平均明显增加(P<0.01),且呈剂量依赖关系;AngⅡ10-7~10-5mol/L处理组HSCs的PCⅢ和CⅣ分泌水平也显著增加(P<0.01)。RT-PCR检测结果显示,与新鲜分离大鼠和对照组HSCs比较,有较高ECM分泌水平的10-6mol/L AngⅡ处理组HSCs的TGF-β1和CTGF mRNA表达水平明显升高。结论AngⅡ能刺激大鼠HSCs分泌ECM,其通过促进TGF-β1表达经CTGF介导而参与肝脏纤维化的发生。     

血管紧张素Ⅱ对大鼠HSCs分泌ECM影响机制的研究

目的 探讨血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)刺激大鼠肝脏星状细胞(HSCs)分泌细胞外基质(ECM)的可能机制.方法 采用胶原酶原位循环灌流法分离大鼠肝星状细胞(HSCs).①用不同浓度Ang Ⅱ(10-9～10-5moL/L)处理HSCs,酶联免疫吸附法检测各组HSCs层黏蛋白(LN)、透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(PcⅢ)和Ⅳ型胶原(CⅣ)水平.以未经AngⅡ处理的HSCs作为对照组.②选择使ECM分泌显著增加的AngⅡ处理组HSCs,抽提RNA后采用RT-PCR技术测定转化生长因子-β1(TGF-β1)和结缔组织生长因子(CTGF)mRNA表达,并与新鲜分离的大鼠HSCs和对照组HSCs进行比较.结果 与对照组比较,AngⅡ各浓度处理组HSCs的LN和HA分泌水平均明显增加(P<0.01),且呈剂量依赖关系;AngⅡ10-7～10-3mol/L处理组HSCs的PCⅢ和CⅣ分泌水平也显著增加(P<0.01).RT-PCR检测结果显示,与新鲜分离大鼠和对照组HSCs比较,有较高ECM分泌水平的10-6moL/L AngⅡ处理组HSCs的TGF-β1和CTGF mRNA表达水平明显升高.结论 Ang Ⅱ能刺激大鼠HSCs分泌ECM,其通过促进TGF-β1表达经CTGF介导而参与肝脏纤维化的发生.     

乙醛及其刺激的Kupffer细胞对肝星状细胞活化的影响

目的 探讨乙醛及其刺激的Kupffer细胞对大鼠肝星状细胞(HSCs)活化的影响.方法 用链酶蛋白酶和胶原酶原位灌流,Nycodenz密度梯度法离心分离大鼠肝脏HSCs和Kupffer细胞,制备乙醛刺激的Kupffer细胞培养上清液(KCCM),并以MTT法观察乙醛及乙醛与Kupffer共同培养的KCCM对HSCs的增殖效应,以放射免疫法检测HSCs培养上清液中Ⅳ型胶原的含量.结果 乙醛直接作用于HSCs后HSCs明显增殖,并能合成分泌Ⅳ型胶原;未用乙醛处理和经乙醛处理后的KCCM均能使HSCs增殖并生成Ⅳ型胶原,两组之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 乙醛可促进HSCs活化,与酒精性肝病时肝纤维化的发生有关.乙醛不能直接作用于Kupffer细胞引起HSCs活化.     

丹参素对大鼠肝星状细胞增殖、凋亡及NF-κB活性的影响

目的 观察丹参素对IL-1β刺激的肝星状细胞增殖、凋亡及NF-κB活性的影响,探讨丹参素抗肝纤维化的分子机制.方法 用原位-密度梯度离心法提取肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSCs),以不同浓度的丹参素作用于IL-1β刺激的HSCs,MTT法、AO/EB免疫荧光和Annexin V-FITC/P1分别检测HSCs的增殖和凋亡;免疫细胞化学、ELISA法、Western blot分别检测Ⅲ型胶原的生成、NF-κB核转位及细胞质p-IκBet、细胞核NF-κB p65的表达.结果 与对照组相比,IL-1β刺激组HSCs增殖明显增加(P<0.01),凋亡率明显减低(P<0.05),Ⅲ型胶原的合成和分泌明显增加(P<0.01);不同浓度丹参素作用24 h后HSCs增殖明显减低(P<0.01),凋亡明显增加(P<0.01),以早期凋亡为主,Ⅲ型胶原的合成和分泌亦明显减少(P<0.05,P<0.01);Western blot结果显示IL-1β作用30 min时细胞质p-IκBα、细胞核NF-κB p65蛋白表达明显增加(P<0.01),出现核转位;免疫细胞化学显示细胞核内p65阳性染色细胞增多浓染,提示IL-1β可以诱导HSCs的NF-kB活性;丹参素组细胞质p-h相似文献   

红景天甙对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞激活后功能的影响

目的:观察红景天甙对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)增殖、细胞周期、Ⅰ型胶原蛋白分泌及TGFβ1 mRNA表达的影响.方法:常规细胞培养,红景天甙对乙醛刺激的HSC进行处理;以MTT比色法检测细胞增殖变化,流式细胞仪检测细胞周期,ELISA法检测HSC内Ⅰ型胶原蛋白的分泌,RT-PCR方法检测HSC内TGFβ1 mRNA表达.结果:红景天甙可明显抑制乙醛刺激的HSC增殖;抑制乙醛刺激的HSC由G1→S期转化;抑制HSC内Ⅰ型胶原蛋白分泌和TGFβ1 mRNA表达.结论:红景天甙抗肝纤维化与抑制HSC增殖,Ⅰ型胶原蛋白分泌和TGFβ1 mRNA表达有关.     

肝纤维化中丹参素对TGFβ1/Smads/ERK信号通路的影响及其相互关系

目的探讨肝纤维化过程中转化生长因子β1(transforming growth factorβ,TGFβ1)/Smads/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路的相互作用。方法体外分离培养大鼠肝星状细胞(hepatic stellatecell,HSC),MTT法筛选丹参素最适浓度;以最适浓度丹参素及ERK阻断剂(PD98059)作用于经TGFβ1处理的HSC,CCK-8法检测各组HSC增殖;免疫细胞化学染色法检测各组HSC内α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle sctin,α-SMA)及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达;RT-PCR检测各组HSC的Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表达量;Western blot法检测各组Smad2/3、ERK1/2蛋白磷酸化及Smad7蛋白水平。结果 0.062 5～0.25 mmol/L的丹参素可有效抑制HSC增殖,作为最适处理浓度;PD98059(100μmol/L)可抑制TGFβ1诱导的HSC增殖,丹参素剂量依赖性抑制TGFβ1诱导的HSC增殖(P<0.01);TGFβ1促进细胞内α-SMA及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达,PD98059及丹参素降低TGFβ1诱导的α-SMA及Ⅰ、Ⅲ型胶原水平;PD98059可拮抗TGFβ1诱导的Smad2、Smad3、Smad7 mRNA的表达(P<0.05,P<0.01),丹参素下调Smad2、Smad3 mRNA水平,但上调Smad7 mRNA水平(P<0.01);PD98059及丹参素抑制TGFβ1诱导的Smad2/3、ERK1/2蛋白磷酸化(P<0.01),但对TGFβ1诱导的Smad7蛋白表达上调有不同效应(P<0.01)。结论 TGFβ1上调Smad2、Smad3 mRNA表达及蛋白磷酸化,进而诱导HSC增殖、活化及胶原合成,ERK通路可能参与HSC中TGFβ1诱导Smad基因表达及蛋白磷酸化过程。丹参素对TGFβ1/Smad/ERK信号通路具有抑制效应。     

甘参复方对大鼠肝星状细胞增殖和胶原合成的影响

目的:观察甘参复方对大鼠肝星状细胞增殖和胶原合成的影响,并分析甘参复方抗肝纤维化的分子机制。方法:采用体外培养的永生化细胞株大鼠肝星状细胞(hepatic sellate cell-T6,HSC-T6)。将甘参复方稀释成6个不同的浓度梯度,采用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况,筛选出甘参复方对HSC-T6的有效作用浓度。之后将细胞分为阴性对照组,甘参复方低浓度组、中浓度组、高浓度组。采用ELISA法检测各组细胞上清液中的Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ,ColⅠ)水平。然后,应用转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)(1 mg·L~(-1))刺激HSC-T6,观察甘参复方对刺激后细胞的增殖和胶原合成的影响。结果:甘参复方的6个不同浓度对HSC-T6的增殖有明显抑制作用,且浓度为0.5μmol·L~(-1)时抑制作用最明显(P0.01)。ELISA结果显示,甘参复方能够降低细胞上清中的ColⅠ含量,且与CCK-8结果相吻合,在0.5μmol·L~(-1)时ColⅠ分泌最少。甘参复方能够抑制TGF-β1刺激后的HSC-T6增殖和胶原合成。结论:甘参复方能够显著抑制星状细胞的增殖以及ColⅠ的表达,这是甘参复方抗肝纤维化的作用机制之一。     

转录因子ZEB1与乙醛刺激后大鼠肝星状细胞增殖的关系分析

目的:探讨转录因子ZEB1与乙醛刺激后大鼠肝星状细胞增殖的关系.方法:培养大鼠肝星状细胞并将其随机分为实验组(乙醛终浓度200μmol/L)和对照组(加入等量培养基),分别培养6h,12h,24h.利用MTT法检测各时间点的各组细胞增殖情况;ELISA试剂盒检测各组细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白含量变化;Western blotting检测细胞提取蛋白包括ZEB1、α-SMA的表达情况.结果:乙醛刺激大鼠肝星状细胞后,细胞增殖明显;Ⅰ型胶原蛋白、ZEB1及α-SMA等蛋白的表达上调,且细胞增殖程度与Ⅰ型胶原蛋白、ZEB1及α-SMA等蛋白的表达上调呈正相关.结论:乙醛刺激大鼠肝星状细胞后ZEB1通过参与大鼠肝星状细胞EMT过程,从而使细胞增殖,EMT与酒精性肝纤维化的发生发展有一定的关系.     

肝纤维化时骨形态发生蛋白7对肝细胞及肝星状细胞产生胶原的影响

目的 通过体外细胞实验,观察骨形态发生蛋白7(BMP-7)对肝细胞和肝星状细胞产生胶原能力的影响.方法 分离免疫性大鼠肝纤维化模型实验动物的肝细胞和肝星状细胞.收集细胞培养液,用酶联免疫吸附法检测其中的细胞外基质;采用免疫荧光技术检测不同剂量和时间的BMP-7处理后转化生长因子(TGF)-β1受体和磷酸化Smad信号通道蛋白的改变;并运用实时PCR从mRNA的水平上检测TGF-β1的表达.结果 50 mg/L的BMP-7分别处理肝细胞和肝星状细胞后,肝细胞中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原的产生(83%±6%、79%±8%、82%±13%)与对照组(100%)相比,差异均无统计学意义(均P>0.05);肝星状细胞中Ⅳ型胶原的产生(78%±9%)亦与对照组差异无统计学意义(P>0.05),但Ⅰ、Ⅲ型胶原的产生均明显低于对照组(60%±8%、40%±6%,均P<0.01);相同浓度的BMP-7处理组中,未发现TGF-β1结合受体蛋白的表达变化,而Smad2/3通道蛋白的表达减弱;实时荧光定量PCR表明TGF-β1基因在BMP-7处理后表达水平降低了88%(1-0.12).结论 BMP-7具有抑制激活的肝星状细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白产生的作用,其机制为抑制细胞中促纤维化生长因子TGF-B1的信号通道蛋白Smad2/3的活性,并抑制TGF-β1的表达.     

丹参素对肝星状细胞ERK1/2信号转导通路的影响

目的:观察丹参素对血小板衍生生长因子-BB(Platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB)刺激大鼠肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)增殖、Ⅰ型胶原合成、磷酸化细胞外信号调节激酶1,2(Phosphoryhted extracellular signal-regulated kinase 1/2,P-ERK1/2)表达的影响,探讨丹参素抗肝纤维化的分子机制.方法:四甲基偶氮唑盐法检测大鼠HSC增殖活性;免疫细胞化学染色法测定大鼠HSC Ⅰ型胶原合成的表达;Western blot测定大鼠肝星状细胞P-ERK1/2的表达.结果:丹参素有抑制PDGF-BB刺激大鼠HSC增殖,Ⅰ型胶原表达,p-ERK1/2表达的作用.结论:丹参素可抑制PDGF-BB刺激的大鼠HSC增殖,Ⅰ型胶原合成,其机制可能与抑制ERK1/2信号转导通路有关.     

山楂叶悬钩子水提取物对转化生长因子-β刺激的肝星状细胞活化的抑制作用及其机制

[目的]探讨山楂叶悬钩子水提取物（RC—H）对转化生长因子（TGF—β）刺激的肝星状细胞（HSC）活化的影响及其机制．[方法]采用MTT法测定RC-H对大鼠肝星状细胞（tHSC／C1—6）存活率的影响;采用TGF-β促活化tHSC／C1—6细胞,蛋白印迹分析RC-H对TGF-β刺激HSC信号转导的影响．[结果]0～160mg／LRC-H对tHSC／Cl-6存活率无显著影响（P〉0．05）,320,640,1280mg／LRC-H显著抑制tHSC／C1—6的存活率（P〈0．05）．40,80,160mg／LRC—H可抑制TGF-β活化tHSC／Cl-6细胞中α-SMA蛋白表达,下调TIMP-1蛋白表达,上调MMP-13蛋白表达,降低p-Erk和p-JNK蛋白表达,对p-p38无显著影响．[结论]RC—H可通过介导MAPK信号通路中Erk和JNK磷酸化而抑制TGF-β刺激的肝星状细胞活化．     

草乌甲素对乙醛诱导的LX-2细胞ECM分泌及相关蛋白表达的影响

目的:探讨草乌甲素(BLA)对乙醛诱导的人LX-2肝星状细胞(LX-2细胞)外基质及其相关蛋白的影响。方法:将细胞分为空白对照组(NC组)、乙醛组(模型组)和BLA+乙醛组(BLA组),乙醛浓度为400μmol/L,BLA浓度为18.75μg/mL。对NC组和BLA组LX-2细胞进行形态学评价和DAPI染色,ELISA检测三组Ⅰ型胶原蛋白(Col-Ⅰ)和Ⅲ型胶原蛋白(Col-Ⅲ)的浓度,WB检测三组α-SMA、TGF-β1、MMP-1、TIMP-1的蛋白含量。结果:乙醛组Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的含量高于对照组(P<0.05),而BLA组Col-Ⅰ、Col-Ⅲ含量低于乙醛组(P<0.05)。乙醛组TGF-β1、α-SMA和TIMP-1蛋白含量均高于对照组(P<0.05),而MMP-1蛋白含量低于对照组(P<0.05);BLA组TGF-β1、α-SMA和TIMP-1蛋白含量均低于乙醛组(P<0.05),而MMP-1蛋白含量高于乙醛组(P<0.05)。结论:BLA可能通过抑制TGF-β1信号通路来抑制LX-2细胞的激活和增殖,并通过降低MMP-1/TIMP...     

丹参酮ⅡA对血管紧张素II诱导的大鼠肝星状细胞TGF-β1/Smads通路的影响

目的:研究丹参酮ⅡA对体外培养的血管紧张素Ⅱ诱导的肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)转化生长因子β1(TGF-β1)/Smads通路中TGF-β1、Smad2、Smad4的mRNA和蛋白表达的作用,探讨丹参酮ⅡA治疗肝纤维化的机理。方法:对大鼠肝星状细胞分别使用血管紧张素Ⅱ(1×10-5mol/L)及血管紧张素Ⅱ(1×10-5mol/L)联合丹参酮ⅡA(25μg/ml)干预48h,分别用real-time PCR及western blot方法检测各组细胞TGF-β1、Smad2、Smad4的mRNA及蛋白表达。结果:血管紧张素Ⅱ上调肝星状细胞TGF-β1、Smad2、Smad4的mRNA及蛋白表达(P0.01),而丹参酮ⅡA对血管紧张素Ⅱ在肝星状细胞中的这种诱导作用具有明显的抑制(P0.01)。结论:丹参酮ⅡA抗肝纤维化的机制之一可能是通过对肝星状细胞TGF-β1/Smads通路的调控实现的。     

槲皮素诱导肝星状细胞凋亡:基于调控miR-146影响PI3K/Akt信号通路

目的 探讨槲皮素(Que)通过调控肝星状细胞内miR-146水平影响PI3K/Akt信号通路诱导细胞凋亡的作用机制。方法 以大鼠肝星状细胞系(HSC-T6)为研究对象,设计实验分组：空白对照组、TGF-β组、TGF-β+Que-L(40μmol/L)、TGF-β+Que-M(60μmol/L)和TGF-β+Que-H(80μmol/L)为药物治疗部分;各组阴性对照组、miR-146模拟剂(mimic)和抑制剂(inhibitor)为细胞转染部分。CCK-8法检测不同浓度的Que对细胞抑制情况,选出低、中、高3个剂量浓度用于后续细胞实验;细胞凋亡流式细胞术检测Que对HSCs细胞凋亡的影响;RT-qPCR法检测HSC-T6细胞药物治疗以及细胞转染后miR-146、α-SMA、CollagenⅠ、TRAF6、PI3K和Akt mRNA表达情况;Western blot法检测以上各组中α-SMA、CollagenⅠ、TRAF6、PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达情况;免疫荧光实验检测HSC-T6细胞药物治疗中α-SMA、CollagenⅠ蛋白表达强弱。结果 CCK-8实验结果显示,相同时间...